使用无标记光学生物传感器检测G蛋白偶联受体对钾通道的调节作用

以下实验的总体目标是利用无标记共振波长梯度光学生物传感器，检测钾离子通道对G蛋白偶联受体的调节作用。将未转染的HEK 293细胞以及稳定表达大鼠钠激活钾通道Slack B的HEK 293细胞接种至384孔光学生物传感器板中，过夜孵育。随后，对细胞质膜附近的质量进行基线测量，并加入内源性G蛋白偶联受体（GPCR）的激动剂。最后，检测GPCR激活引起的信号变化，并计算钾通道对该反应的调节作用。

最终，该方法可通过定量测量G蛋白偶联受体与钾离子通道之间的信号传导机制，帮助解答神经科学和细胞信号传导领域的关键问题。与目前用于研究通道与蛋白质相互作用的方法（例如免疫共沉淀和沉淀分析）相比，该技术的主要优势在于可在活细胞中进行检测，且无需使用可能改变相互作用蛋白结构的外源性标记物。

最后，在活细胞内，您实际上可以实时追踪这些相互作用。尽管该方法能够揭示 GPCR 与钾离子通道之间的信号传导，它还可用于研究由配体诱导的细胞黏附和铺展毒性、增殖、迁移，以及细胞膜与光学生物传感器之间距离变化所引发的细胞反应。

该技术还有望用于发现由离子通道或受体异常引起的疾病（例如多种通道病）的新型治疗方法，因为它可作为一种高通量方法，用于检测药理学试剂对通道蛋白的作用。蛋白质相互作用。当我们意识到有必要开发一种能够在活细胞中观察通道蛋白相互作用的检测方法时，我们首次提出了使用该方法的想法。

开始384孔光学生物传感器板的包被：每孔加入20微升无菌组织培养级水，润湿二氧化钛板，孵育15分钟。随后使用16通道移液器，每孔加入50微升磷酸盐缓冲液（PBS），洗涤一次。

接下来，在每个孔中加入 20 µL 预先配制好的纤连蛋白工作液，在室温下孵育 2 小时，以形成细胞外基质（ECM）。孵育结束后，用每孔 50 µL 的 PBS 洗涤一次，然后向每孔中加入 40 µL 预先配制好的卵清蛋白工作液。

将酶标板在4°C孵育过夜，以封闭卵白蛋白结合后的孔板。每孔加入50 µL PBS，洗涤三次。细胞外基质包被的板子可在4°C保存最多四十八小时。

从未切除的 HEK 293 细胞和稳定表达 slack B 的 HEK 293 细胞中移除培养基，这些细胞按照文本方案中所述条件进行培养。然后加入胰蛋白酶使细胞从培养皿上脱落。在 1000 × g 离心力下离心 1 分钟以收集细胞。

去除胰蛋白酶培养基，并将细胞重悬于生长培养基中。使用血细胞计数板或自动细胞计数仪测定细胞浓度，以尽量减少孵育过程中蒸发带来的影响，并将细胞稀释至每孔所需数量。在本实验中，每孔加入 50 微升生长培养基，接种 1000 个细胞。

将稀释后的细胞各取50微升加入生物传感器的每个孔中，接种细胞后，在37摄氏度、5% CO2条件下于培养基中过夜培养。为准备共振波长梯度（RWG）光学生物传感器实验，孵育结束后从细胞中移除培养基。

用Hank's平衡盐溶液洗涤细胞一次，然后向每个孔中加入25 µL该溶液。将生物传感器板置于结合扫描仪上，使细胞在室温下平衡1至2小时。同时，准备另一块化合物板，用于在检测过程中向生物传感器板中加入感兴趣的配体。

进行这些检测时，向生物传感器板的每个孔中加入含有化合物的 25 微升溶液，总体积为 50 微升。为执行 RWG 光学生物传感器检测，使用扫描系统对代表 384 孔板一半的 A1 至 P12 孔进行基线测量。使用 Bind Scan 软件，对每个孔中心 1.5 毫米区域以每像素 3.75 微米的最大分辨率进行扫描，此基线扫描大约需要 30 分钟。

然后向A1至P12各孔中每孔加入25 µL化合物溶液。接着，对A13至P24各孔进行初始读数测量。完成这些孔的初始读数后，向A13至P24各孔中每孔加入25 µL化合物溶液。

最后一步，对 A1 至 P12 孔进行一次化合物处理后的测量，并重复测量 A13 至 P24 孔。为分析检测数据，打开 Windows 中用于基线测量的 bind 检测数据，点击网格编辑器按钮以启用细胞选择。软件将计算用户定义的关注指标，打开插件，包括细胞识别器（cell finder），并在细胞识别器中设置基线或函数参数，使细胞能够与生物传感器背景区分开来。

导出细胞图谱文件，该文件包含基线测量的细胞识别数据。对添加化合物后的数据重复上述步骤。然后打开基线或插件，并导入基线测量的细胞图谱。

软件将计算背景数据与加药后数据之间峰值波长值（PWV）的偏移量。选择“delta细胞均值”以输出细胞PWV平均偏移量的结果。随后可将数据导出至Microsoft Excel进行进一步分析。

Slack b 稳定转染的 HEK 293 细胞和对照未转染的 HEK 293 细胞以每孔 1000 个细胞的密度接种于 384 孔 ECM 包被的 RWG 生物传感器板上。通过 BindScan 在化合物加入前及加入后 30 分钟生成质量密度梯度图。

红色显示的软件区域代表被识别为属于细胞的像素，黄色线条则用于区分细胞与灰色培养板背景。使用bind view软件通过从基础状态下的PWV减去加入化合物后的PWV，来确定GPCR激动剂加入后PWV的变化。该变化以颜色梯度表示，其中红色代表峰值波长值的正向偏移，蓝色代表无变化。

内源性M1毒蕈碱受体在卡巴胆碱作用下，对未切除的对照HEK 293细胞和稳定表达slack B的HEK 293细胞均产生反应，与对照细胞相比，峰值波长值呈阳性增加。其中，转染slack B的细胞峰值波长值增加更为显著。S-F-L-L-R NH₂三氟乙酸盐以及末端凝血酶受体激活肽五肽（该肽对内源性G蛋白偶联受体——蛋白酶激活受体1具有激动剂活性）在未切除细胞和转染slack B的细胞中也表现出差异性反应。

这些结果表明，Slack B 通道的存在显著增强了在 K 细胞中激活内源性 G 蛋白偶联受体（GPCR）时所引发的 PWV 位移，并证明了利用该检测方法研究通道蛋白相互作用的可行性。观看本视频后，您应能够充分理解如何建立并实施无标记光学生物传感器检测。只要细胞和试剂得到妥善准备，掌握该技术后可在两天内完成整个实验流程。

需要牢记的是，实验参数（例如待接种的细胞数量、配体孵育时间等）必须根据不同细胞系进行优化。完成该实验步骤后，可采用其他方法（如 R 和人工智能）来分析并确定导致信号变化的关键蛋白质。请注意，操作人源细胞培养物可能存在极高风险，因此在进行该实验时，必须采取适当防护措施，例如在生物安全柜内操作。