三维培养：研究乳腺细胞正常腺泡结构与恶性转化的工具

本实验的总体目标是利用三维培养系统来区分良性乳腺表型与恶性乳腺表型。首先，将对照组和实验组细胞以三复孔的方式接种于八孔载玻片中预先铺好的生长因子减少型Matrigel层上。第二步是每隔四天更换一次含2% GFR Matrigel的新鲜完全培养基，使类似腺泡的克隆生长10至15天。

接下来，以5倍分辨率获取在3D培养中生长的类腺泡样集落的相差图像。最后一步是使用相关分子标记物对类腺泡样集落进行免疫细胞化学分析处理，随后获取位于中切面的C2免疫染色类腺泡样集落的共聚焦图像。最终，利用在3D培养中生长的细胞的相差图像与共聚焦图像来鉴定细胞的表型和分子变化，从而区分良性的乳腺细胞与恶性的乳腺细胞。

与现有的二维培养、侵袭或迁移实验等方法相比，该技术的主要优势在于能够重现良性乳腺组织的组织结构，以及在恶性转化过程中组织结构的紊乱。因此，该技术可有效用于区分良性乳腺细胞与恶性乳腺细胞。该方法有助于回答乳腺癌研究领域中的关键问题，例如信号通路缺陷对细胞表型的影响，以及发现新的致癌或肿瘤抑制通路。

实验开始时，将生长因子减少型或GFR Matrigel在4摄氏度下过夜解冻。接下来，将完全培养基HME预热至37摄氏度，并将八孔腔室载玻片置于冰上冷却。向预冷载玻片每个孔的中央加入40微升GFR Matrigel。

使用 P 200 移液器吸头尽可能均匀地铺展凝胶，避免产生气泡和过度铺展，以免形成弯月面。随后将载玻片置于 37 摄氏度、5% CO2 条件下孵育，使基质胶固化。在此期间，用胰蛋白酶消化眼组织，获取 HME 细胞，然后将其收集至 15 毫升离心管中，在 150 × g 条件下离心 4 分钟，计数细胞并将其稀释至每毫升 12,500 个细胞。在完全培养基中，向细胞悬液中加入 GFR 基质胶，使其终浓度为 2%，然后向预编码腔室载玻片的每孔中加入 400 微升该溶液。

然后将培养板放入含 CO2 缓冲的培养箱中。每四天更换一次新鲜的完全培养基，持续 15 天。对于抑制剂实验，在铺板时向完全培养基中加入小分子抑制剂，随后每三天更换一次新鲜培养基，并补充相应抑制剂，以启动细胞生长，每种处理组设置三个重复。

使用与载物台移动器和计算机相连的相差显微镜，在5倍分辨率下拍摄每孔中aser结构的相差图像。通过移动载玻片从一个视野到下一个视野，覆盖有室载玻片的整个孔区域。统计aser结构的总数、单个圆形扁平的asinine数量，以及多细胞aser结构或无序生长且缺乏组织性的结构数量。

通过分析发出的分支过程，计算单轮扁平状激光结构与恶性结构的百分比，并将这些信息绘制成柱状图。使用双尾非配对学生t检验计算显著性。

按照随附的文字实验方案准备免疫荧光染色试剂。接着，使用 P 200 移液器小心吸除培养上清液。然后，在室温下用新配制的 2% 多聚甲醛固定 ASIN 或结构 20 分钟；固定后，在 4 摄氏度下用 0.5% Triton X-100 对细胞进行透化处理 10 分钟。

然后用 100 毫摩尔的甘氨酸洗涤培养物三次，每次洗涤 10 到 15 分钟。接着，在一抗封闭缓冲液中室温封闭细胞一小时。然后将培养物在初级封闭缓冲液（也称为第二次封闭溶液）中孵育，其中加入 20 微克/毫升的山羊抗小鼠 Fab2 片段，孵育 30 分钟，以封闭 Matrigel 中的氨基反应性小鼠 IgG 物种。

封闭后，在4摄氏度下用第二封闭液与一抗共同孵育细胞过夜。用免疫荧光缓冲液或I缓冲液轻轻振荡洗涤细胞三次，每次10至15分钟。随后在if F缓冲液中加入荧光标记的二抗孵育细胞45分钟。

接着，用 IF 缓冲液轻轻振荡洗涤细胞，每次 10 分钟，共洗涤三次。使用含抗荧光淬灭剂的 DPI 封片剂封片，以观察细胞核。将载玻片置于室温下过夜干燥。

随后，通过共聚焦显微镜获取细胞在Matrigel表面生长时类器官中段的图像，并利用z轴层扫技术对整个腺泡结构进行一系列光学切片成像。在第5天，经DPI染色的对照HME细胞与C CN six基因敲低细胞的共聚焦图像显示，敲低细胞缺乏正常组织结构。到第15天，对照组细胞停止增殖，形成分化良好的ASIN样结构，并具有清晰定义的管腔，而基因敲低细胞则呈现出侵袭性分支状和管状表型。免疫荧光染色显示，层粘连蛋白、v alpha six整合素以及ECA herrin的表达缺失，分别表明基底膜结构破坏、基底极性丧失以及细胞间接触减少。

在恶性细胞中，对照细胞显示出围绕在荒谬的α6整合素基底表达周围的完整层，以及GM1 30和eca的顶端表达。在此处的细胞-细胞连接处，通过外源性添加纯化的重组人CCN6蛋白，可逆转CCN6敲低的HME细胞的恶性表型。两种高转移性乳腺癌细胞系，即SUM149和MDA-MB-231，经P38 MAP激酶抑制剂SB203580和SB202190处理后，其恶性行为得以减弱。

观看本视频后，您应能够充分理解如何在三维培养体系中培养乳腺细胞，并有效利用在基质胶（matrigel）上形成的类似腺泡的生长形态作为读出指标，以区分良性和恶性乳腺细胞表型。