Name: 三维文化:一种工具来研究正常腺泡结构与恶性转化的乳腺细胞 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-04-25T14:45:00.000+00:00
Duration: 8 min 33 s
Description: 学习三维培养技术区分乳腺良性与恶性表型的方法。利用Matrigel培养基和免疫荧光分析，研究人员可观察细胞形态变化及分子标记差异，为肿瘤生物学研究提供重要工具。

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本研究由美国国立卫生研究院（NIH）资助，资助项目编号为R01 CA107469、R01 CA125577和U01CA154224，授予C.G. Kleer，以及密歇根大学癌症中心支持项目。

1. 材料与培养基的准备
<ol>
	<li>在 4 °C 过夜解冻生长因子减少型（GFR）Matrigel。</li>
	<li>将所需细胞系的完全培养基预热至 37 °C。MCF10A 使用 ATCC 指定培养基；HME 使用添加了 5% 胎牛血清、1 µg/ml 氢化可的松、5 µg/ml 胰岛素、10 ng/ml 表皮生长因子和 100 ng/ml 霍乱毒素的 Ham's F-12 培养基；SUM149 使用添加了 5% FBS、2 µg/ml 氢化可的松和 5 µg/ml 胰岛素的 Ham's F-12 培养基；MDA-MB-231 使用含 10% FBS 的 DMEM 培养基。</li>
	<li>将 8 孔腔室载玻片置于冰上预冷。</li>
	<li>准备组织培养超净台及相关用品。</li>
</ol>
2. 8孔腔室载玻片中的三维培养
<ol>
	<li>在8孔载玻片的每个孔中加入40 µl GFR Matrigel。将Matrigel滴加至孔中央，然后使用P200移液器吸头均匀涂布。尽量使涂层均匀，避免产生气泡或过度涂布，以防形成弯月面。</li>
	<li>在37 °C、5% CO₂条件下孵育载玻片2在Matrigel凝固的同时，用胰蛋白酶消化细胞，在组织培养离心机中以150 × g离心4分钟，收集细胞。</li>
	<li>计数细胞，并用相应细胞系的完全培养基稀释至12,500个细胞/ml。加入GFR基质胶至终浓度2%，混匀后取400 µl加入已预先包被基质胶的腔室载玻片的每个孔中。</li>
	<li>将载玻片置于 CO₂ 培养箱中孵育2 培养箱。每4次更换新鲜的完全培养基th 天，持续至第15天。</li>
	<li>药理学抑制剂处理： 进行抑制剂实验时，在细胞接种时将小分子抑制剂加入完全培养基中，随后每隔三天更换一次含有抑制剂的新鲜培养基，细胞在GFR Matrigel上培养。</li>
	<li>纯化蛋白处理： 
	<ol>
		<li>按照步骤 2.1–2.3 接种细胞。培养 4 天后，进行血清饥饿处理 16 小时。</li>
		<li>第5天，将纯化蛋白以适当浓度加入含0.1% FBS的培养基中，处理血清饥饿的细胞。两天后更换新鲜培养基，并再次加入纯化蛋白。</li>
		<li>第10天，将条件培养基更换为完全HME培养基，继续培养5天。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在Matrigel上生长的腺泡结构的免疫荧光染色: 
	<ol>
		<li>配制含2%多聚甲醛、0.5% Triton X-100和100 mM甘氨酸的1×PBS溶液（pH 7.4）。配制免疫荧光缓冲液（IF缓冲液），其中含1×PBS、0.1%牛血清白蛋白、0.2% Triton X-100和0.05% Tween-20。</li>
		<li>使用 P200 移液枪吸头小心吸取培养上清液。</li>
		<li>在室温下用2%新配制的多聚甲醛固定腺泡结构20分钟。</li>
		<li>用 0.5% Triton X-100 在 4 °C 下孵育细胞 10 分钟以进行透化处理。</li>
		<li>用 100 mM 甘氨酸洗涤培养物三次，每次 10–15 分钟。</li>
		<li>用IF缓冲液配制的10%山羊血清在室温下封闭细胞1小时，此步骤称为一抗封闭。</li>
		<li>将培养物与20 µg/ml的山羊抗小鼠F(ab´)₂片段抗体共同孵育2 在初级阻断缓冲液中孵育30分钟。此步骤对于阻断Matrigel中具有免疫反应性的鼠IgG成分至关重要。</li>
		<li>在第二封闭液（封闭液加20 µg/ml山羊抗小鼠F(ab´)2片段）中，4 °C条件下与一抗孵育过夜。</li>
		<li>用免疫荧光缓冲液轻轻振荡洗涤三次，每次10-15分钟。</li>
		<li>在IF缓冲液中用荧光标记的二抗孵育45分钟。</li>
		<li>用免疫荧光缓冲液轻轻振荡洗涤3次，每次10分钟。</li>
		<li>使用含DAPI的抗荧光淬灭剂封片，以观察细胞核。</li>
		<li>让载玻片在室温下干燥过夜。</li>
		<li>图像采集：在Matrigel上生长的细胞集落中段进行共聚焦成像。如需更多信息，可通过Z轴层扫在整个腺泡结构的全长范围内采集一系列光学切片。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 用于免疫印迹的双孔培养板中的三维培养
<ol>
	<li>将2孔板预冷于冰上。按照步骤2.1-2.4操作，将试剂用量按2孔板的规模相应放大。 例如 每孔加入160 µl Matrigel包被，并向2孔板的每孔中加入1.6 ml细胞/Matrigel混合液。</li>
	<li>使用市售的3D培养细胞收获试剂盒，按照制造商说明书从Matrigel中收获腺泡结构。</li>
	<li>将细胞洗涤液和细胞收获缓冲液稀释至1x，并预冷至4 °C。洗涤和去除Matrigel应在冰上进行。</li>
	<li>用细胞洗涤缓冲液将腺泡结构洗涤3次。</li>
	<li>使用细胞收获缓冲液将腺泡收集至15 ml离心管中，随后在4 °C摇床上孵育30分钟。用1 ml移液器充分混匀悬浮液，以将Matrigel分解成小片段，并使大部分细胞释放到细胞收获缓冲液中。</li>
	<li>在培养用离心机中以200 × g离心收集细胞。用P200移液器吸头去除细胞沉淀上方的浮层水凝胶。</li>
	<li>使用试剂盒提供的SDS上样缓冲液重悬裂解物。也可使用RIPA裂解缓冲液。</li>
</ol>
4. 恶性与良性乳腺表型的定量分析
<ol>
	<li>每组处理条件下均设三个重复，按照步骤 2.1–2.4 培养细胞。</li>
	<li>使用配备载物台移动器和计算机的相差显微镜，在 5X 或 10X 分辨率下拍摄每个孔中腺泡结构的相差图像。通过移动玻片从一个视野到下一个视野，从而覆盖玻室载玻片的整个孔。</li>
	<li>计数腺泡结构的总数、单个圆形扁平腺泡的数量，以及多腺泡结构或无序生长且从主体发出分支结构的数量。</li>
	<li>计算单个圆形扁平腺泡结构占恶性结构的百分比，并以柱状图表示。采用 Student t 检验计算显著性差异。</li>
</ol>

<ol><li>Arendt, L. M., Rudnick, J. A., Keller, P. J., Kuperwasser, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stroma+in+breast+development+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Semin.+Cell+Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Stroma in breast development and disease.</a> Semin. Cell Dev. Biol. 21, 11-18 (2009).</li>
<li>Debnath, J., Muthuswamy, S. K., Brugge, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphogenesis+and+oncogenesis+of+MCF-10A+mammary+epithelial+acini+grown+in+three-dimensional+basement+membrane+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Morphogenesis and oncogenesis of MCF-10A mammary epithelial acini grown in three-dimensional basement membrane cultures.</a> Methods. 30, 256-268 (2003).</li>
<li>Lee, G. Y., Kenny, P. A., Lee, E. H., Bissell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+culture+models+of+normal+and+malignant+breast+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional culture models of normal and malignant breast epithelial cells.</a> Nat. Methods. 4, 359-365 (2007).</li>
<li>Li, Q., Chow, A. B., Mattingly, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+overlay+culture+models+of+human+breast+cancer+reveal+a+critical+sensitivity+to+mitogen-activated+protein+kinase+kinase+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Pharmacol.+Exp.+Ther%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional overlay culture models of human breast cancer reveal a critical sensitivity to mitogen-activated protein kinase kinase inhibitors.</a> J. Pharmacol. Exp. Ther. 332, 821-828 (2010).</li>
<li>Rosen, P. P. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRosen%2C+PP+%22Rosen%27s+breast+pathology%22">Rosen's breast pathology</a>. Rosen, P. , 3rd edition, Lippincott Williams & Wilkins. Philadelphia, PA. (2008).</li>
<li>Weaver, V. M., Fischer, A. H., Peterson, O. W., Bissell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+importance+of+the+microenvironment+in+breast+cancer+progression%3A+recapitulation+of+mammary+tumorigenesis+using+a+unique+human+mammary+epithelial+cell+model+and+a+three-dimensional+culture+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The importance of the microenvironment in breast cancer progression: recapitulation of mammary tumorigenesis using a unique human mammary epithelial cell model and a three-dimensional culture assay.</a> Biochem. Cell Biol. 74, 833-851 (1996).</li>
<li>Kenny, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+morphologies+of+breast+cancer+cell+lines+in+three-dimensional+assays+correlate+with+their+profiles+of+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Oncol%22%5BJournal%5D)">The morphologies of breast cancer cell lines in three-dimensional assays correlate with their profiles of gene expression.</a> Mol. Oncol. 1, 84-96 (2007).</li>
<li>Pal, A., Huang, W., Li, X., Toy, K. A., Nikolovska-Coleska, Z., Kleer, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CCN6+modulates+BMP+signaling+via+the+Smad-independent+TAK1%2Fp38+pathway%2C+acting+to+suppress+metastasis+of+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">CCN6 modulates BMP signaling via the Smad-independent TAK1/p38 pathway, acting to suppress metastasis of breast cancer.</a> Cancer Res. 15, 4818-4828 (2012).</li>
<li>Pal, A., Huang, W., Toy, K. A., Kleer, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CCN6+knockdown+disrupts+acinar+organization+of+breast+cells+in+three-dimensional+cultures+through+up-regulation+of+type+III+TGF-%CE%B2+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Neoplasia%22%5BJournal%5D)">CCN6 knockdown disrupts acinar organization of breast cells in three-dimensional cultures through up-regulation of type III TGF-β receptor.</a> Neoplasia. 14, 1067-1074 (2012).</li>
<li>Wang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenotypic+reversion+or+death+of+cancer+cells+by+altering+signaling+pathways+in+three-dimensional+contexts%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Natl.+Cancer+Inst%22%5BJournal%5D)">Phenotypic reversion or death of cancer cells by altering signaling pathways in three-dimensional contexts.</a> J. Natl. Cancer Inst. 94, 1494-1503 (2002).</li>
<li>Weaver, V. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reversion+of+the+malignant+phenotype+of+human+breast+cells+in+three-dimensional+culture+and+in+vivo+by+integrin+blocking+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Reversion of the malignant phenotype of human breast cells in three-dimensional culture and in vivo by integrin blocking antibodies.</a> J. Cell Biol. 137, 231-245 (1997).</li>
<li>Wang, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+co-culture+models+to+study+prostate+cancer+growth%2C+progression%2C+and+metastasis+to+bone%5BTitle%5D)+AND+%22Semin.+Cancer+Biol%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional co-culture models to study prostate cancer growth, progression, and metastasis to bone.</a> Semin. Cancer Biol. 15, 353-364 (2005).</li>
<li>Vaughan, M. B., Ramirez, R. D., Wright, W. E., Minna, J. D., Shay, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+three-dimensional+model+of+differentiation+of+immortalized+human+bronchial+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Differentiation%22%5BJournal%5D)">A three-dimensional model of differentiation of immortalized human bronchial epithelial cells.</a> Differentiation. 74, 141-148 (2006).</li>
<li>Fata, J. E., Werb, Z., Bissell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+mammary+gland+branching+morphogenesis+by+the+extracellular+matrix+and+its+remodeling+enzymes%5BTitle%5D)+AND+%22Breast+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Regulation of mammary gland branching morphogenesis by the extracellular matrix and its remodeling enzymes.</a> Breast Cancer Res. 6, 1-11 (2004).</li>
<li>Luca, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+the+3D+microenvironment+on+phenotype%2C+gene+expression%2C+and+EGFR+inhibition+of+colorectal+cancer+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Impact of the 3D microenvironment on phenotype, gene expression, and EGFR inhibition of colorectal cancer cell lines.</a> PLoS One. 8, 1-11 (2013).</li>
</ol>

作者声明不存在竞争性财务利益。

本文介绍了在重建基底膜上进行乳腺上皮细胞三维培养的方法，以及该体系在区分恶性与良性乳腺表型方面的应用价值。该体系也可用于培养其他腺体组织的不同细胞类型，已有文献报道成功用于前列腺上皮细胞、支气管上皮细胞和甲状腺上皮细胞等的培养12-14。三维培养的重要性在于其作为一种生理相关性较高的模型，能够帮助揭示恶性转化过程中腺体结构破坏所涉及的分子机制。此外，它还提供了一个可行的模型系统，有助于筛选治疗癌症的新靶点。许多在二维培养中显示有效的药物，在实验和临床应用中往往效果甚微15。因此，三维培养可作为一种重要的临床前工具，用于预测化合物在体内的作用效果。
三维培养是一种具有挑战性的技术，需谨慎操作。GFR Matrigel 是进行三维细胞培养最常用的基质。它可在 4 °C 过夜融化，分装后于 -20 °C 冻存以备后续使用。应避免反复冻融。GFR Matrigel 在 4 °C 时呈液态，但在 37 °C 时会凝固，因此在更换条件培养基为新鲜培养基或对细胞进行免疫细胞化学处理...

在重建基底膜上进行乳腺上皮细胞的三维培养（3D）是研究正常乳腺及乳腺癌复杂表型及其相关信号通路的重要模型系统2,3乳腺的功能单位是终末导管小叶单位（TDLU），由一条小导管分支形成腺泡构成。腺泡为高度有序的结构，由上皮细胞和肌上皮细胞两层细胞组成，外周由基底膜包绕。5正常腺泡最显著的特征是细胞具有极性、与基底膜相连以及特化的细胞间连接。这种复杂的组织结构在浸润性癌中遭到破坏。常用的二维培养体系使细胞以单层形式生长，无法形成腺泡结构，因此单层培养难以模拟正常乳腺上皮细胞之间复杂的相互关系，也无法反映乳腺癌中这些关系的失调情况。目前，多个实验室已建立了功能性的同型乳腺上皮细胞培养体系。2,33D 培养涉及在 Matrigel 上培养乳腺细胞，Matrigel 是一种来源于 Engelbreth-Holm-Swarm 小鼠肉瘤细胞的可溶性提取物，可商业获取。其他如 I 型胶原蛋白等 3D 培养基质也常被使用。乳腺细胞可通过 3D 包埋法进行 3D 培养，即细胞包埋于 Matrigel 中进行培养。2或者，可采用3D顶层培养法（也称为3D覆盖培养法），该方法因所需Matrigel体积较少而具有成本效益，同时便于通过相差成像对集落形成进行延时监测，非常适合 原位 成像2-3. 3D on top 实验已被用于定义腺泡表型与基因表达谱之间的相关性7.
3D 培养可有效区分正常和良性细胞与侵袭性癌细胞。正常和良性乳腺细胞在 Matrigel 上会形成生长停滞、具有极性的结构，中央具有明确的管腔；而侵袭性癌细胞则大量无序增殖，且管腔无法清除。E6/E7 永生化的人类乳腺上皮细胞以及 MCF10A 细胞系（一种从 36 岁患有纤维囊性改变的患者中分离获得的自发永生化细胞系）已成功用于在 3D 条件下重现良性乳腺表型3,8，并作为研究多种分子致癌功能和肿瘤抑制功能的模型系统8,9。这些良性细胞可通过慢病毒/逆转录病毒感染来对目的基因进行遗传操作。若目的基因为肿瘤抑制基因，则通过 shRNA 介导的基因敲低将导致恶性转化；若目的基因为致癌基因，则在良性细胞中过表达该基因应表现出恶性表型。在这两种情况下，3D 培养中形成的腺泡结构均可反映恶性转化过程。
良性单细胞在三维培养中开始增殖并形成圆形球状结构。到第5至8天，这些细胞球会分化为外层与Matrigel接触的极化细胞层，以及内部未与Matrigel接触、极性较弱的细胞团。在接下来的10至15天内，内部细胞将通过凋亡逐渐死亡，形成清晰的管腔结构。而恶性细胞则失去极性，呈无序生长。高度恶性的细胞通常形成分支状结构。这些表型差异可通过延时相差显微成像以及 原位 使用相关分子标志物进行免疫染色。最常用的标志物包括α6-整合素（一种基底极性标志物），联合增殖标志物磷酸化组蛋白3和凋亡标志物cleaved caspase-3。后者对于判断腺泡中心是否存在管腔形成至关重要，管腔形成是正常及良性乳腺细胞的特征。其他极性及细胞间接触标志物包括GM130、层粘连蛋白（laminin）、ERM蛋白和E-钙黏蛋白（E-cadherin）。 alternatively，可对乳腺癌细胞系进行基因工程改造以操控目标基因。在此情况下，细胞表型若逆转为生长停滞的良性状态，可作为区别于癌性表型的判断指标。
3D 培养还可被谨慎地用于阐明参与恶性转化的信号通路10-11。利用上述检测方法，可通过药理学抑制剂、阻断性抗体或重组蛋白精确定位导致恶性转化的分子信号机制。通过多个实验室的持续努力，已可从 3D 培养中提取细胞以分离 RNA，并制备裂解液用于免疫印迹和免疫共沉淀。这些策略在本实验方案中以逐步且详尽的方式进行了描述。

<table><tbody><tr><td>生长因子减少型基质胶</td><td>BD Biosciences</td><td>354230</td><td>避免反复冻融&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Lab-Tek 8孔玻璃腔室载片</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>177402</td><td>预冷于冰上&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Lab-Tek 2孔玻璃腔室载片&amp;nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>177380</td><td>预冷于冰上&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>山羊抗小鼠 F(ab&amp;acute;)&lt;sub&gt;2 &lt;/sub&gt;片段</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td>115-006-006</td><td></td></tr><tr><td>正常山羊血清</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td>005-000-121</td><td></td></tr><tr><td>荧光标记 Alexa 抗体</td><td>Molecular Probes</td><td></td><td>请访问 Molecular Probes 官网查询</td></tr><tr><td>含 DAPI 的 Prolong Gold 抗荧光淬灭封片剂</td><td>Molecular Probes</td><td>P36935</td><td></td></tr><tr><td>3D 培养细胞收获试剂盒</td><td>Trevigen</td><td>3448-020-k</td><td></td></tr><tr><td>抗 α-6-整合素抗体</td><td>Fisher Scientific</td><td>MAB1378</td><td>免疫荧光使用 1:100 稀释</td></tr><tr><td>抗 GM130 抗体</td><td>BD Biosciences</td><td>610822</td><td>免疫荧光使用 1:100 稀释</td></tr><tr><td>抗磷酸化组蛋白 3（Ser10）FITC 标记抗体</td><td>Fisher Scientific</td><td>16-222</td><td>免疫荧光使用 1:100 稀释</td></tr><tr><td>抗剪切型 Caspase 3（Asp 175）抗体</td><td>Cell Signaling</td><td>9661s</td><td>免疫荧光使用 1:50 稀释</td></tr><tr><td>抗 E-钙黏蛋白抗体</td><td>BD Biosciences</td><td>610181</td><td>免疫荧光使用 1:200 稀释</td></tr></tbody></table>

三维培养：研究乳腺细胞正常腺泡结构与恶性转化的工具

Three Dimensional Cultures: A Tool To Study Normal Acinar Architecture vs. Malignant Transformation Of Breast Cells

浸润性乳腺癌是一类恶性上皮性肿瘤，其特征是侵入邻近组织并具有转移倾向。癌细胞与其微环境之间的信号相互作用对乳腺癌的生长和生物学行为具有强大影响1。然而，当细胞在二维（2D）单层培养条件下生长时，来自细胞外基质的大部分信号会丢失，或其相关性未得到充分研究。近年来，在重建基底膜上进行三维（3D）培养已成为重现良性和恶性乳腺细胞组织结构的首选方法。在3D环境中生长的细胞能够保留来自细胞外基质的重要信号，提供一种生理上更相关的ex&#160;vivo系统2,3。值得注意的是，越来越多的证据表明，细胞在3D条件下与在2D条件下生长时的行为存在显著差异4。3D培养可有效用于区分恶性表型与良性乳腺表型，并揭示其中涉及的细胞和分子信号通路3。良性上皮细胞的一个显著特征是具有极性，即顶端胞质朝向管腔，基底胞质则附着于基底膜。这种顶端-基底极性在浸润性乳腺癌中丧失，后者表现为细胞排列紊乱，并形成相互吻合且分支的导管样结构，无序地侵入周围间质。良性腺体与浸润性癌之间的这些组织病理学差异可在3D培养中得以重现6,7。通过采用适当的检测指标，如定量分析单一的圆形腺泡结构，或结合其他分子与细胞生物学技术，检测细胞增殖、极性和凋亡相关已验证分子标志物的差异表达，3D培养可成为深入理解恶性转化过程中细胞变化以及阐明相关信号通路的重要工具。

三维培养可有效用于区分人类乳腺上皮细胞的恶性表型与良性乳腺组织。将单个良性细胞接种于Matrigel上，可形成有序的球形结构，通过相差显微成像可在单一平面上轻松观察为单个圆形扁平的腺泡结构。而将单个恶性细胞接种于Matrigel上，则呈现无序生长，折射率极高，难以在单一平面上成像。如图1所示，良性HME细胞和MCF10A细胞形成类似球形的腺泡结构，而高度转移性的乳腺细胞系SUM149和MDA-MB-231则生长为具有向外延伸突起的分支管状结构。此类偏离良性表型的形态变化可作为判断恶性转化的指标，并可用于界定某一分子是作为肿瘤抑制因子还是肿瘤促进因子的功能。如图2所示，敲低（KD）肿瘤抑制基因CCN6会引发恶性转化。通过慢病毒介导的转染使HME细胞中CCN6表达水平下调后，其细胞结构从早期即出现紊乱。在第5天，良性对照细胞仍生长为完美的球形结构，而CCN6敲低细胞已表现出无序的表型。至第15天，良性对照细胞停止增殖，并形成围绕明确中央腔隙的极化细胞层，而敲低细胞则持续旺盛生长，形成无序的大型管状结构，若继续培养则可进一步扩展（图2）。</...

在重建基底膜上进行乳腺上皮细胞的三维培养是一种有效模拟 体内 良性乳腺的组织结构，并区分恶性表型与良性乳腺表型。重要的是，该系统可应用于研究其他组织中的浸润性癌。

侵袭性乳腺癌是一类恶性上皮性肿瘤，其特征为侵犯邻近组织并具有转移倾向。

本实验的总体目标是利用三维培养系统来区分良性乳腺表型与恶性乳腺表型。首先，将对照组和实验组细胞以每组三个重复接种于八孔载玻片中预先铺好的生长因子减少型Matrigel层上。第二步是每隔四天更换一次含2% GFR Matrigel的新鲜完全培养基，使类似腺泡的克隆生长10至15天。接下来，在3D培养中生长的类腺泡样集落以5倍分辨率获取相差图像。最后一步是使用相关分子标记物对类腺泡样培养物进行免疫细胞化学分析，并对位于中截面的C2免疫染色类腺泡样集落获取共聚焦图像。最终，通过3D培养细胞的相差图像和共聚焦图像来识别细胞的表型和分子变化，从而区分良性的乳腺细胞与恶性细胞。与现有的二维培养、侵袭或迁移实验等方法相比，该技术的主要优势在于能够重现良性乳腺组织的结构特征，以及在恶性转化过程中组织结构的紊乱。因此，该技术可有效用于区分良性乳腺细胞与恶性乳腺细胞。该方法有助于解答乳腺癌研究领域中的关键问题，例如信号通路缺陷对细胞表型的影响，以及发现新的致癌通路或肿瘤抑制通路。实验开始时，将生长因子减少型（GFR）Matrigel 在 4 摄氏度下过夜解冻。接下来，将完全 HME 培养基在 37 摄氏度下预热，并将八孔腔室载玻片置于冰上冷却。向预冷载玻片各孔的中心加入 40 微升 GFR Matrigel。使用 P 200 移液器吸头尽可能均匀地铺展凝胶，避免产生气泡和过度铺展，以免形成弯月面。随后将载玻片置于 37°C 和 5% CO₂ 条件下孵育，使 Matrigel 凝固。在此期间，用胰蛋白酶消化眼组织，收集 HME 细胞，然后将其置于 15 毫升离心管中，在 150 × g 条件下离心 4 分钟，计数细胞并稀释至 12,500 个细胞/毫升。在完全培养基中，向细胞悬液中加入 GFR Matrigel，终浓度为 2%，然后向预先编码的腔室载玻片的每个孔中加入 400 微升该溶液。然后将培养板置于CO2缓冲培养箱中。每4天更换一次新鲜的完全培养基，持续15天。对于抑制剂实验，在铺板时将小分子抑制剂加入完全培养基中，随后每3天更换一次添加了抑制剂的新鲜培养基，以启动细胞生长，并为每种处理设置三个重复。使用配备载物片移动器和计算机的相差显微镜，以5倍分辨率对每个孔中的aser结构进行相差成像。通过移动载物片从一个视野到下一个视野，覆盖有孔载物片的整个区域。统计aser结构的总数、单个圆形扁平状asinine的数量，以及多个aser结构或无序生长且缺乏组织性的结构数量。通过发出的分支过程，计算单轮扁平激光结构与恶性结构的百分比，并将数据以柱状图形式呈现。采用双尾非配对学生T检验计算其显著性。按照随附的文字方案准备免疫荧光染色所需的试剂。接着，使用 P 200 移液器小心吸去培养后的培养基。然后在室温下用新配制的 2% 多聚甲醛对 ASIN 或结构进行固定，固定时间为 20 分钟

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