新生小鼠软脑膜表面电穿孔技术

本实验的总体目标是对果皮表面的神经前体细胞进行遗传标记和操控。首先，将装有质粒DNA溶液的玻璃移液管插入果皮表面区域；第二步，将DNA注入覆盖果皮表面的软膜腔隙中。

接下来，将电极进行适当定位，以向果皮表面准确地施加电流。最后一步是通过施加电流将DNA电穿孔导入果皮表面的前体细胞中。最终，该方法可与其他技术相结合，用于研究果皮表面神经前体细胞增殖、迁移和/或分化的自然过程及其分子决定因素。

与现有的病毒转导等方法相比，该技术的主要优势在于电穿孔更安全、更灵活，且无需制备病毒颗粒或进行包装。该方法可回答神经干细胞与前体细胞领域中的一些关键问题，例如这些表层前体细胞对组织、组织发生以及神经环路功能的贡献是什么。首先，使用拉针仪从玻璃毛细管中拉制移液针，拉制完成后，用锋利的剪刀剪去针尖。

接下来，使用过滤的无核酸酶水配制1%快绿贮存液。将无内毒素血浆DNA溶于EDTA缓冲液并稀释后，按适当比例加入1%快绿溶液中。使用标准移液器将所需量的质粒混合物滴加到一片石蜡膜上，作为参考。

接下来，使用显微注射器，小心地将组装好的玻璃移液管插入含有质粒混合物的离心管中。避免管尖接触管壁边缘，以防破损。通过缓慢回拨转移旋钮，将溶液吸入移液管中。

当加载足够体积后，向前调节旋钮，直至压力回到零的中性位置（赫克托帕斯卡）。接着，将提示端置于参考注射位置旁边，使用显微注射器的脚踏板排出一个体积的液体。

调节压力，直至液量等于先前用移液器量取的参考体积。校准注射体积后，取出动物进行质粒注射。确认麻醉深度后，用非优势手的拇指和食指固定幼鼠。

用惯用手对准目标区域，大脑皮层半球及其他浅表结构（如上丘）应清晰可见。确定正确位置后，将移液器穿过皮肤和颅骨插入，注意避开脑动脉。

当移液管尖端到达果皮表面时，立即停止推进。一旦移液管尖端穿透颅骨并处于正确位置，即通过显微注射仪的脚踏板注入质粒溶液。注射完成后，小心地取出移液管。为防止移液管尖端在连续注射之间干燥和堵塞，应将其置于石蜡膜上的测试液滴中。重复上述步骤，直至所有幼鼠完成注射，以提高导电性并防止皮肤灼伤。

用三毫米铂金镊子TRO涂上电穿孔凝胶。接下来，调整电穿孔参数，用于向皮层注射。将带负电的探针置于注射区域上方，带正电的探针置于对侧眼下方区域。

电极的方向应与中线呈45至60度角。使用脚踏开关触发电流，并将镊子型电极固定在原位，持续3到5次脉冲。根据幼鼠的年龄和体重，脉冲应将DNA靶向导入下方表皮表面的细胞中。

可将负极扫过注射区域。在脉冲间隔期间，或使用较大的电极，可在电穿孔后立即扩大电场作用区域。仔细将幼鼠身上的凝胶清理干净，并将其置于加热灯下约五分钟。由于发绀，幼鼠在电穿孔后的几分钟内会迅速失去其自然的粉红色。

在将幼崽放回笼子或向四叠体注射前，观察其自然肤色的恢复以及正常运动的开始。定位目标区域，该区域位于人字缝后方和外侧，大致在中线位置，随后按照刚刚演示的相同步骤进行操作。注射成功时，质粒混合物会自然填充四叠体的轮廓。

在上丘注射后进行电穿孔时，将电极的负极探针置于注射区域上方，正极探针置于眼部、吻部或下巴周围。此时，电极的方向与中线呈25至40度角。此图像显示的是电穿孔后背外侧皮层的情况，其中荧光报告质粒表达膜标记的绿色clover蛋白和tagBFP蛋白。

此处以红色伪彩显示两种核蛋白。在电穿孔后约两个月，该皮层中间神经元显示出广泛的树突。EGFP阳性细胞同时为BrdU阳性，表明它们在电穿孔过程中处于增殖状态。

在尝试该技术时，重要的是要准确定位果皮表面，以避免破坏下方的皮层和/或维管组织。