Name: 新生儿软脑膜表面电穿孔 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-05-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 22 s
Description: 学习新生儿软脑膜表面电穿孔技术，通过玻璃微针注射质粒DNA并施加电流，实现中枢神经系统神经祖细胞的遗传标记与操控。该方法安全灵活，可用于研究神经发育中的细胞谱系与分化机制。

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作者感谢塞缪尔·奥斯钦综合癌症研究所癌症研究论坛奖、西达赛奈再生医学研究所以及古林家族提供的支持。本项目获得了国立卫生研究院研究资源中心资助的临床与转化科学研究所核心代金券的支持，资助编号为 UL1RR033176，目前该资助由国家推进转化科学中心负责，资助编号为 UL1TR000124。本内容仅由作者负责，不代表 NIH 的官方观点。

该操作程序符合西达赛奈医学中心动物护理和使用委员会（IACUC）的要求。研究人员在开展实验前应确保符合所在机构的IACUC规定。所有工具和试剂在使用前均应进行灭菌处理。
1. 工具、溶液和DNA混合物的准备
<ol>
	<li>将100毫米长的火焰抛光硼硅酸盐玻璃毛细管插入微电极拉制仪中。设置加热参数，进行标准加权拉制，形成约17.5毫米长的移液尖端。使用锋利的外科剪刀在尖端起始处约8–9毫米处剪断，以获得直径约为100 µm的开口。</li>
	<li>通过将经滤膜过滤的无核酸酶水（使用20 μm注射器滤膜）与快绿粉末混合，配制1% w/v的快绿储备液。</li>
	<li>提取高浓度（即 &#62; 3 μg/μl）且不含内毒素的纯化质粒DNA，并将其溶解于Tris-EDTA（TE）缓冲液中。将所需量的质粒加入TE缓冲液稀释液中，并加入1%快绿溶液，使其终浓度为1:10（即快绿终浓度为0.1% w/v）。为实现外源基因的高效表达，建议质粒终浓度为0.5–2.0 µg/µl。</li>
</ol>
2. 动物麻醉、移液管装载和软脑膜表面质粒注射
<ol>
	<li>将出生后1-2天的小鼠置于放置于冰上的培养皿中，持续5-8分钟，以诱导低温麻醉&#160;（时间取决于幼鼠的年龄/体重）。当通过趾部捏压无反应和/或尾部反射消失确认出现低体温后，小鼠即可进行注射。若动物出现疼痛反射，则应将其重新放回冰上。&#160; 注射和电穿孔操作总共耗时不超过2-3分钟，因此需合理安排低体温、注射和电穿孔各步骤的时间，以维持适当的麻醉状态。</li>
	<li>麻醉过程中，使用标准移液器，小心吸取所需体积的质粒混合液（0.5–2 μl），滴加至一片石蜡膜上作为参考。此处注射的质粒混合液总体积为0.5 µl。随后，使用显微注射仪，将组装好的玻璃毛细移液管小心插入含有质粒混合液的管中。操作时需格外注意避免管尖破裂，确保其不接触管壁边缘。通过缓慢回拨转移调节旋钮，将溶液吸入移液管中。当移液管内吸入足够体积后，向前旋转旋钮，直至压力恢复至0 hPa的中性位置。</li>
	<li>使用300–450 hPa的注射压力，确保压力适当，以均匀填充软脑膜表面/脑膜间隙。将注射针尖置于先前用移液器点样的石蜡膜参考标记（来自步骤2.2）附近，踩下显微注射仪的脚踏开关，将一滴液体注射到石蜡膜上。相应调整压力，直至喷出的液量等于先前移液器点样的参考体积。</li>
	<li>一旦针尖达到平衡且确认麻醉成功后，幼鼠即可进行注射。</li>
	<li>实验的目的是将质粒混合物注射到颅骨下方、软脑膜表面之上，以便将DNA电转至软脑膜表面的前体细胞中图1A对于皮层注射，用非优势手的拇指和食指固定幼鼠。在出生后0至2天（P0–P2）期间，大脑半球及上丘等其他浅表结构清晰可见，便于对这些结构进行准确定位。图1B）。使用惯用手并定位至目标皮层区域（即 运动区、体感区等），将移液管插入皮肤和颅骨，注意避开脑动脉。确保移液管尖端穿过颅骨后不再进一步深入（穿透颅骨后阻力明显减小即为标志）。</li>
	<li>使用显微注射仪的脚踏板注入质粒溶液，并确保其在组织中均匀扩散（图2A). 
	注意：必须通过实验确定一种方法，以在最大化质粒递送效率的同时避免因液体压力导致血肿。可通过调整注射持续时间、角度、体积以及精确的注射靶点位置，避免对血管造成破坏。</li>
	<li>务必在注射间隙将吸头置于蜡纸或塑料石蜡膜上先前注射形成的测试液滴中，以防止吸头干燥。此举旨在避免DNA溶液蒸发结晶在吸头内积聚，从而导致吸头堵塞及加样体积不一致。</li>
</ol>
3. 电穿孔
<ol>
	<li>将电穿孔仪设置为135–150 V，进行五次脉冲，每次持续50毫秒，脉冲间间隔950毫秒。为提高导电性并防止皮肤灼伤，请在3毫米铂金镊状电极上覆盖电穿孔凝胶。&#160;此时检查幼鼠的脚趾夹捏反射和尾部反射，以确认麻醉效果。&#160;若仍有反应，将其置于冰上数分钟以加强麻醉。</li>
	<li>对于皮层（及上丘）注射，使用3毫米电极（图2B），以提高幼鼠存活率（相较于用于脑室区电穿孔的7毫米和10毫米电极）。将电极的负极探针置于注射区域上方，正极探针置于对侧眼下方区域，使电极方向相对于中线呈45–60°角（图2C）。</li>
	<li>使用电穿孔仪的脚踏开关触发电流，并根据幼鼠年龄和体重，保持镊状电极位置进行3–5次脉冲，从而有效将DNA导入脑半球曲率下方的软脑膜表面细胞。 
	注意：可在脉冲间隔期间将负极在注射区域上扫过，或使用更大的电极，以扩大电穿孔区域。</li>
	<li>电穿孔后立即小心清除幼鼠身上的凝胶，并将其置于加热灯下约5分钟。</li>
	<li>电穿孔后数分钟内，幼鼠会因发绀而暂时失去正常的粉红色外观。需观察幼鼠是否恢复自然肤色并开始正常活动，之后再将其放回笼中。</li>
	<li>通过观察母鼠是否将幼鼠带回巢穴并开始理毛行为，确认其重新社会化。若母鼠表现出攻击性，应确保幼鼠身上无残留凝胶，并将幼鼠与部分垫料一同孵育，以转移巢穴气味。</li>
</ol>
4. 针对上丘的改良方法
靶向：
<ol>
	<li>以与皮层相同的方式注射上丘，但需注意目标区域位于人字缝后方和外侧，大致在中线位置（图3A 和 图3B）。注射成功时，质粒混合物会自然填充上丘的轮廓。完成成功注射后，动物即可进行电穿孔。</li>
</ol>
电穿孔：
<ol>
	<li>采用非常相似的方法，对于上丘注射，将电极的负电极探针置于注射区域上方，正电极探针置于眼部、鼻部或下巴周围，从而将DNA导入上丘的浅层区域（图3C）。在此情况下，电极的方向相对于中线呈25–40°角。</li>
</ol>

<ol><li>Breunig, J. J., Haydar, T. F., Rakic, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+stem+cells%3A+historical+perspective+and+future+prospects%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Neural stem cells: historical perspective and future prospects.</a> Neuron. 70 (4), 614-625 (2011).</li>
<li>Gage, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mammalian+neural+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Mammalian neural stem cells.</a> Science. 287 (5457), (2000).</li>
<li>Kriegstein, A., Alvarez-Buylla, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+glial+nature+of+embryonic+and+adult+neural+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The glial nature of embryonic and adult neural stem cells.</a> Annu Rev Neurosci. 32, 149-184 (2009).</li>
<li>Breunig, J. J., Arellano, J. I., Macklis, J. D., Rakic, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Everything+that+glitters+isn%27t+gold%3A+a+critical+review+of+postnatal+neural+precursor+analyses%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Everything that glitters isn't gold: a critical review of postnatal neural precursor analyses.</a> Cell Stem Cell. 1 (6), 612-627 (2007).</li>
<li>Costa, M. R., Kessaris, N., Richardson, W. D., Gotz, M., Hedin-Pereira, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+marginal+zone%2Flayer+I+as+a+novel+niche+for+neurogenesis+and+gliogenesis+in+developing+cerebral+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The marginal zone/layer I as a novel niche for neurogenesis and gliogenesis in developing cerebral cortex.</a> J Neurosci. 27 (42), 11376-11388 (2007).</li>
<li>Breunig, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+genetic+targeting+of+pial+surface+neural+progenitors+and+immature+neurons+by+neonatal+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22Neural+Dev%22%5BJournal%5D)">Rapid genetic targeting of pial surface neural progenitors and immature neurons by neonatal electroporation.</a> Neural Dev. 7, (2012).</li>
<li>Ohira, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ischemia-induced+neurogenesis+of+neocortical+layer+1+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Ischemia-induced neurogenesis of neocortical layer 1 progenitor cells.</a> Nat Neurosci. 13 (2), 173-179 (2010).</li>
<li>Bystron, I., Blakemore, C., Rakic, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+the+human+cerebral+cortex%3A+Boulder+Committee+revisited%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Development of the human cerebral cortex: Boulder Committee revisited.</a> Nat Rev Neurosci. 9 (2), 110-122 (2008).</li>
<li>Schmechel, D. E., Rakic, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Golgi+study+of+radial+glial+cells+in+developing+monkey+telencephalon%3A+morphogenesis+and+transformation+into+astrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Anat+Embryol+%28Berl%22%5BJournal%5D)">A Golgi study of radial glial cells in developing monkey telencephalon: morphogenesis and transformation into astrocytes.</a> Anat Embryol (Berl. 156 (2), 115-152 (1979).</li>
<li>Halfter, W., Dong, S., Yip, Y. P., Willem, M., Mayer, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+critical+function+of+the+pial+basement+membrane+in+cortical+histogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">A critical function of the pial basement membrane in cortical histogenesis.</a> J Neurosci. 22 (14), 6029-6040 (2002).</li>
<li>Bystron, I., Rakic, P., Molnar, Z., Blakemore, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+first+neurons+of+the+human+cerebral+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The first neurons of the human cerebral cortex.</a> Nat Neurosci. 9 (7), 880-886 (2006).</li>
<li>Tanaka, D. H., Maekawa, K., Yanagawa, Y., Obata, K., Murakami, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multidirectional+and+multizonal+tangential+migration+of+GABAergic+interneurons+in+the+developing+cerebral+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Multidirectional and multizonal tangential migration of GABAergic interneurons in the developing cerebral cortex.</a> Development. 133 (11), 2167-2176 (2006).</li>
<li>Ang Jr, E. S., Haydar, T. F., Gluncic, V., Rakic, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Four-dimensional+migratory+coordinates+of+GABAergic+interneurons+in+the+developing+mouse+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Four-dimensional migratory coordinates of GABAergic interneurons in the developing mouse cortex.</a> J Neurosci. 23 (13), 5805-5815 (2003).</li>
<li>Tamamaki, N., Fujimori, K. E., Takauji, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Origin+and+route+of+tangentially+migrating+neurons+in+the+developing+neocortical+intermediate+zone%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Origin and route of tangentially migrating neurons in the developing neocortical intermediate zone.</a> J Neurosci. 17 (21), 8313-8323 (1997).</li>
<li>Larkum, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+yin+and+yang+of+cortical+layer+1%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The yin and yang of cortical layer 1.</a> Nat Neurosci. 16 (2), 114-115 (2013).</li>
<li>Jiang, X., Wang, G., Lee, A. J., Stornetta, R. L., Zhu, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+organization+of+two+new+cortical+interneuronal+circuits%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The organization of two new cortical interneuronal circuits.</a> Nat Neurosci. 16 (2), 210-218 (2013).</li>
<li>Endo, T., Isa, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functionally+different+AMPA-type+glutamate+receptors+in+morphologically+identified+neurons+in+rat+superficial+superior+colliculus%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Functionally different AMPA-type glutamate receptors in morphologically identified neurons in rat superficial superior colliculus.</a> Neuroscience. 108 (1), 129-141 (2001).</li>
<li>Schmidt, M., Ozen Boller, M., G,, Hall, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disinhibition+in+rat+superior+colliculus+mediated+by+GABAc+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Disinhibition in rat superior colliculus mediated by GABAc receptors.</a> J Neurosci. 21 (2), 691-699 (2001).</li>
<li>Ackman, J. B., Burbridge, T. J., Crair, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinal+waves+coordinate+patterned+activity+throughout+the+developing+visual+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Retinal waves coordinate patterned activity throughout the developing visual system.</a> Nature. 490 (7419), 219-225 (2012).</li>
<li>De Marco Garcia, N. V., Karayannis, T., Fishell, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+activity+is+required+for+the+development+of+specific+cortical+interneuron+subtypes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Neuronal activity is required for the development of specific cortical interneuron subtypes.</a> Nature. 472 (7343), 351-355 (2011).</li>
<li>Boller, M., Schmidt, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Postnatal+maturation+of+GABA%28A%29+and+GABA%28C%29+receptor+function+in+the+mammalian+superior+colliculus%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Postnatal maturation of GABA(A) and GABA(C) receptor function in the mammalian superior colliculus.</a> Eur J Neurosci. 14 (8), 1185-1193 (2001).</li>
<li>Saito, T., Nakatsuji, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+gene+transfer+into+the+embryonic+mouse+brain+using+in+vivo+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation.</a> Dev Biol. 240 (1), 237-246 (2001).</li>
<li>De Vry, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+electroporation+of+the+central+nervous+system%3A+a+non-viral+approach+for+targeted+gene+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Prog+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">In vivo electroporation of the central nervous system: a non-viral approach for targeted gene delivery.</a> Prog Neurobiol. 92 (3), 227-244 (2010).</li>
<li>Stancik, E. K., Navarro-Quiroga, I., Sellke, R., Haydar, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterogeneity+in+ventricular+zone+neural+precursors+contributes+to+neuronal+fate+diversity+in+the+postnatal+neocortex%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Heterogeneity in ventricular zone neural precursors contributes to neuronal fate diversity in the postnatal neocortex.</a> J Neurosci. 30 (20), 7028-7036 (2010).</li>
<li>De la Rossa, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+reprogramming+of+circuit+connectivity+in+postmitotic+neocortical+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">In vivo reprogramming of circuit connectivity in postmitotic neocortical neurons.</a> Nat Neurosci. 16 (2), 193-200 (2013).</li>
<li>Boutin, C., Diestel, S., Desoeuvre, A., Tiveron, M. C., Cremer, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+in+vivo+electroporation+of+the+postnatal+rodent+forebrain%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Efficient in vivo electroporation of the postnatal rodent forebrain.</a> PLoS One. 3 (4), (2008).</li>
<li>Chesler, A. T., Le Pichon, C. E., Brann, J. H., Araneda, R. C., Zou, D. J., Firestein, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+gene+expression+by+postnatal+electroporation+during+olfactory+interneuron+nurogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Selective gene expression by postnatal electroporation during olfactory interneuron nurogenesis.</a> PLoS One. 3 (1), (2008).</li>
<li>dal Maschio, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-performance+and+site-directed+in+utero+electroporation+by+a+triple-electrode+probe%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">High-performance and site-directed in utero electroporation by a triple-electrode probe.</a> Nat Commun. 3, (2012).</li>
<li>Yoshida, A., Yamaguchi, Y., Nonomura, K., Kawakami, K., Takahashi, Y., Miura, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+expression+of+different+transgenes+in+neurons+and+glia+by+combining+in+utero+electroporation+with+the+Tol2+transposon-mediated+gene+transfer+system%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Cells%22%5BJournal%5D)">Simultaneous expression of different transgenes in neurons and glia by combining in utero electroporation with the Tol2 transposon-mediated gene transfer system.</a> Genes Cells. 15 (5), 501-512 (2010).</li>
<li>Chen, F., LoTurco, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+stable+transgenesis+of+radial+glia+lineage+in+rat+neocortex+by+piggyBac+mediated+transposition%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">A method for stable transgenesis of radial glia lineage in rat neocortex by piggyBac mediated transposition.</a> J Neurosci Methods. 207 (2), 172-180 (2012).</li>
<li>Feliciano, D. M., Lafourcade, C. A., Bordey, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neonatal+subventricular+zone+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Neonatal subventricular zone electroporation.</a> J Vis Exp. , (2013).</li>
<li>Lam, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improving+FRET+dynamic+range+with+bright+green+and+red+fluorescent+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Improving FRET dynamic range with bright green and red fluorescent proteins.</a> Nat Methods. 9 (10), 1005-1012 (2012).</li>
<li>Subach, O. M., Cranfill, P. J., Davidson, M. W., Verkhusha, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+enhanced+monomeric+blue+fluorescent+protein+with+the+high+chemical+stability+of+the+chromophore%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">An enhanced monomeric blue fluorescent protein with the high chemical stability of the chromophore.</a> PLoS One. 6 (12), (2011).</li>
</ol>

作者声明不存在相互竞争的经济利益。

成功转染软脑膜表面前体细胞的最关键因素包括：1）将质粒混合物准确靶向至软脑膜表面；2）避免在注射部位形成血肿；3）避免与中脑电穿孔相关的动物死亡。
准确地定位软脑膜表面需通过精确且谨慎地穿刺颅骨，以避免穿透软脑膜表面。若靶点定位不当，误及表层皮肤或深层脑室或脑实质，则会出现以下现象：1）轻轻摩擦组织时，亮绿染料随皮肤发生移位（即 快绿染料局限在颅骨上方的皮肤和结缔组织中，或2）快绿染料消失进入脑组织，表明质粒混合物已进入脑室和/或实质。质粒混合物正确位于软脑膜表面的证据是染料在颅骨下积聚，且轻柔移动皮肤无法使其移位。然而，实现精准靶向需要熟练的操作技巧。血肿的形成很可能是由于质粒注射破坏了血管系统所致。在电穿孔后数天至数周内取材组织时，可在注射部位观察到血凝块。为避免血肿，应调整液体注射的脉冲时长，和/或注意大脑血管的一般分布模式，以避免损伤血管。通常情况下，上丘区域较不易发生凝血。使用3 mm镊状电极可更集中地传递电流，从而避免因镊状电极释放的电流导致动物死亡；同时应如图所示将电极方向避开腹侧中脑区域。图2C 和...

神经干细胞和前体细胞存在于整个哺乳动物的中枢神经系统1,2。过去十年中，对胚胎期和成体脑与脊髓脑室周围区域的生发区中这些细胞的特性与性质已有广泛研究记录1-3。这在很大程度上得益于日益精确的遗传学工具的发展，例如神经系统特异性的Cre介导的floxed等位基因重组或逆转录病毒谱系示踪技术4。然而，其中一个前体细胞区域——软脑膜表面前体细胞区——直到最近才被初步详细描述5-7&#160;，仍需进一步系统深入的研究。
脑的软脑膜表面被定义为脑表面与周围脑膜之间的界面8。在发育过程中，神经上皮细胞以及随后的放射状胶质细胞终足会附着于该表面9,10。人类大脑中最早出现的一些神经元以及大量神经元的有丝分裂现象均在此区域被观察到11。在胚胎神经发生后期，皮质中间神经元除了通过中间带和室下带的迁移路径外，还已知会穿越软脑膜区域12-14。在此期间，该区域的干细胞可被培养，并且该区域似乎是神经发生和胶质发生的一个活跃部位5。在成年脑中，已有报道表明，在缺氧刺激后，中间神经元可由软脑膜表面的前体细胞产生7。然而，由于难以对该区域进行特异性研究，该区域在胚胎期及出生后发育过程中对神经发生的贡献仍不明确6。在上丘和大脑皮层中，浅层（或皮层中的I层）中间神经元可能调节其下方兴奋性神经元群体的环路输出，从而显著影响这些结构的功能。特别是I层中间神经元，由于其与皮层柱的浅层和深层之间存在广泛的连接，因此处于调控大脑皮层上层各层神经元放电活动的关键位置15,16。类似地，水平中间神经元接收来自皮层和视网膜纤维的兴奋性输入，其轴突投射范围相对较广，推测其可介导对远距离视觉刺激产生反应的神经元群体的抑制作用17,18。此外，其形态特征也使其可能在发育中视觉系统的模式化波动活动中发挥重要作用19。有趣的是，中间神经元的发育和成熟在很大程度上发生在出生后。进一步研究发现，这一成熟过程受神经元活动的调控，因此构成了发育可塑性的基础，对环路功能具有终身影响20,21。值得注意的是，目前尚未报道能够通过转基因手段特异性靶向这些细胞的启动子。虽然可通过逆转录病毒靶向分裂中的前体细胞7&#160;，但病毒制备耗时较长，且需要较高的技术以获得细胞转导所需的高滴度病毒。
电穿孔技术推动了神经发育研究的复兴，因为它能够快速高效地对神经前体细胞中的信号通路进行遗传学分析4,22,23。电穿孔技术包括将质粒DNA注射入组织，随后在头部外部施加电脉冲，从而单向地将DNA导入脑室周围增殖的前体细胞中4,22,23。研究表明，电穿孔后质粒转基因的表达依赖于细胞通过细胞周期的M期24。具体而言，尽管质粒可有效递送至脑室壁周围约160 µm范围内的所有细胞，但只有在电穿孔后8小时&#160;内经历M期的细胞才会表达转基因24。据推测，这一现象是由于附加体质粒需进入细胞核，而核膜的破裂（发生在M期）是实现这一过程的关键；支持这一观点的证据是，某些可诱导核膜通透性增加的化学物质能够在有丝分裂后细胞中诱导质粒表达25。电穿孔最初应用于胚胎研究22，而其在出生后脑组织中的应用则较晚才被建立26,27。最近，我们已将该技术改进并应用于软脑膜表面前体细胞的遗传操作6。此外，利用该方法，我们发现该区域存在两种明显不同的前体细胞谱系——中间神经元谱系和星形胶质细胞谱系6。本实验方案详细描述了一种简单、快速且高效的方法，用于靶向这些细胞，以研究调控其发育的分子机制。

<table><tbody><tr><td>火焰抛光硼硅酸盐玻璃管</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>1B100F-4</td><td></td></tr><tr><td>微电极拉制仪</td><td>Sutter Instruments Company</td><td>P-30</td><td></td></tr><tr><td>快绿FCF</td><td>Sigma Aldrich, Inc.</td><td>F7528</td><td></td></tr><tr><td>XenoWorks数字显微注射仪</td><td>Sutter Instruments Company</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ECM 830电穿孔仪</td><td>&lt;a name=&quot;RANGE!B6">Harvard Apparatus, BTX Instrument Div&lt;/a&gt;</td><td>45-0052</td><td></td></tr><tr><td>3毫米铂金镊状电极</td><td>Harvard Apparatus, BTX Instrument Div</td><td>45-0487</td><td></td></tr><tr><td>SignaGel导电电极凝胶</td><td>Cardinal Health</td><td>70315-025</td><td></td></tr><tr><td>Tris-EDTA缓冲液，pH 8.0</td><td>Integrated DNA Technologies, Inc.</td><td>11-01-02-05</td><td></td></tr><tr><td>红外加热灯</td><td>VWR</td><td>36547-009</td><td></td></tr><tr><td>精细锐利剪刀</td><td>Fine Science Tools</td><td>14060-09</td><td></td></tr></tbody></table>

新生小鼠软脑膜表面电穿孔技术

Neonatal Pial Surface Electroporation

近年来，软脑膜表面被确认为在胚胎期、围产期及成年期神经发生和胶质发生过程中（包括损伤后）具有重要意义的生发微环境。然而，由于缺乏特异性或病毒制备过程耗时较长，针对这些前体细胞群体进行遗传学干预及谱系追踪的方法一直受到限制。因此，该领域的研究进展相对缓慢，针对此部位的研究报道寥寥无几。电穿孔技术已被用于胚胎神经干细胞特性研究超过十年，近年来也逐渐应用于出生后大脑的研究。本文介绍一种基于改良电穿孔技术的高效、快速且简便的软脑膜表面前体细胞遗传操作方法。软脑膜表面电穿孔可实现对这些前体细胞的便捷遗传标记与操控，因而为研究此类细胞提供了一种节省时间且经济有效的手段。

软脑膜表面电穿孔可导致质粒DNA在软脑膜表面或其附近的细胞（主要是前体细胞）中表达6。更具体而言，电极的方向对于决定质粒移动方向及后续表达至关重要。因此，在双电极配置中，质粒大致沿负极与正极之间的直线向量移动。因此，若将负极置于注射部位上方，正极位于负极腹侧，则质粒将被驱向软脑膜表面。通常认为，将电极定向以使电流向量垂直于脑表面是最理想的情况。通过适当的电极定向并使用更小、更聚焦的靶向电极，存活率可达100%。然而，在某些区域（如中脑），必须注意避免电流传递可能引起心脏停搏，从而导致电穿孔小鼠幼崽存活率降低。新近描述的三电极配置或其他改进方法可能有助于靶向更困难的区域，同时避开涉及心率等重要功能的结构28。需密切观察幼崽是否被正确复温至其正常体温，复温成功的标志是出现活动和肤色恢复。当幼崽恢复肤色后，即可将其放回巢穴。我们最常使用的CD1品系母鼠会立即开始照料归巢的幼崽。然而，其他品系的行为可能更具变异性，可能出现攻击性或忽视行为。通常将垫料的气味转移到幼崽身上可有效预防这些问题。对于忽视或攻击行为严重的品系，将幼崽寄养至CD1品系母鼠是最有效的解决方案。
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软脑膜表面是中枢神经系统中一个独特的前体细胞区域，正受到越来越多的关注。本文详细介绍了一种利用改良电穿孔技术快速进行该前体区域遗传操作的方法。该方法可用于研究细胞谱系和参与细胞分化过程的信号通路，进而阐明子代细胞的命运及其生物学特性。

近年来，软脑膜表面已被确认为在胚胎期、围产期及成年期神经发生和……过程中具有重要意义的生发微环境

本实验的总体目标是对表皮表面的神经前体细胞进行遗传标记和操控。首先将装有质粒DNA溶液的玻璃移液管插入表皮表面区域，实现这一目标。第二步是将DNA注入覆盖表皮表面的软脑膜间隙。接下来，将电极进行适当定位，以向果皮表面有效传递电流。最后一步是通过施加电流，将DNA电穿孔导入果皮表面的前体细胞。最终，该方法可与其他技术结合使用，以揭示果皮表面神经前体细胞增殖、迁移和（或）分化的自然发生过程及其分子决定因素。与病毒转导等现有方法相比，该技术的主要优势在于电穿孔更安全、更灵活，且无需制备病毒颗粒或进行包装。该方法可用于回答神经干细胞与前体细胞领域中的关键问题，例如这些表层前体细胞对组织、组织发生以及神经环路功能的贡献如何。开始操作时，使用拉针仪从玻璃毛细管中拉制移液针，拉制完成后，用锋利的剪刀剪去针尖。接下来，使用过滤的无核酸酶水配制1%快绿贮存液。将无内毒素血浆DNA用EDTA缓冲液稀释后，按适当比例加入1%快绿溶液中。使用标准移液器将所需量的质粒混合物滴加到一片石蜡膜上，作为参考。接下来，使用显微注射仪，将组装好的玻璃移液管小心插入含有质粒混合物的离心管中。避免管尖接触离心管边缘，以防破损。通过缓慢回旋转移旋钮，将溶液吸入移液管中。当加载足够体积后，向前调节透析旋钮，直至压力回到零的中性位置，即赫克托帕斯卡（Hector Pascals）。接下来，将针尖置于参考注射位置旁，使用显微注射仪的脚踏板排出一个体积的液体。调节压力，直至体积等于先前用移液器测定的参考体积。校准注射体积后，取出动物进行质粒注射。确认麻醉深度后，用非优势手的拇指和食指夹住幼鼠。用惯用手定位目标区域，大脑皮层半球及其他浅表结构（如上丘）应清晰可见。确定正确位置后，将移液器穿过皮肤和颅骨插入，注意避开脑动脉。当移液管尖端到达果皮表面时，立即停止推进。一旦移液管尖端穿透颅骨并处于正确位置，即通过显微注射仪的脚踏开关注入质粒溶液。注射完成后，小心地取出移液管。为防止移液管尖端在连续注射间干燥和堵塞，应将其置于石蜡膜上的测试液滴中。重复上述步骤，直至所有幼崽完成注射，以提高导电性并防止皮肤灼伤。用电穿孔凝胶覆盖三毫米铂金镊子TROs。接下来，调整电穿孔参数以进行皮层注射。将带负电的探针置于注射区域上方，带正电的探针置于对侧眼下方区域。电极的方向应与中线呈45至60度角。使用脚踏开关触发电流，并将镊子型电极（TROs）固定在原位，持续3到5次脉冲。根据幼鼠的年龄和体重，脉冲应将DNA靶向导入下方表皮表面的细胞中。可以将负极扫过注射区域。在脉冲之间，或使用更大的电极，可在电穿孔后立即扩大电场作用区域，小心地将幼鼠身上的凝胶清理干净，并将其置于加热灯下约五分钟。由于发绀，幼鼠在电穿孔后的几分钟内会迅速失去其自然的粉红色。在将幼鼠放回笼中或向顶盖注射前，观察幼鼠自然颜色的恢复及正常运动的开始。找到位于Lambda后侧和外侧、大致在中线位置的目标区域，随后按照刚刚展示的相同步骤进行操作。注射成功时，质粒混合物会自然填充顶盖的轮廓。在注射上丘后进行电穿孔时，将电极的负电极探针置于注射区域上方，正电极探针置于眼部、吻部或下巴周围。此时，电极的方向与中线呈25至40度角。该图像显示的是电穿孔后背外侧皮层的荧光报告质粒表达情况，其中绿色为表达膜标记的clover，蓝色为tagBFP。此处以红色伪彩色显示的两种核蛋白。在电穿孔后约两个月，可在该皮层中间神经元中观察到广泛的树突。EGFP阳性细胞同时为BRDU阳性，表明它们在电穿孔过程中处于增殖状态。尝试该技术时，重要的是要准确定位果皮表面，以避免破坏下方的皮层和/或维管组织。

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新生儿软脑膜表面电穿孔

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in utero 和 ex vivo 电穿孔法用于小鼠视网膜神经节细胞中的基因表达

一种将质粒DNA导入小鼠视网膜细胞以开展功能获得或功能缺失研究的方法 体内...

体内 电穿孔转染发育中小鼠视网膜

高效基因递送至中枢神经系统多个区域 在子宫内 电穿孔

颅面软骨在发育过程中与其他组织紧密接触，在活体动物中难以进行操作。我们正在利用电穿孔技术在颅面骨骼生长过程中递送分子工具，同时避免早期胚胎效应。该方法将使我们能够高效地验证候选分子...

颅面间充质细胞的电穿孔

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我们展示了一种被称为新生鼠侧脑室下区电穿孔的微创技术。该技术包括将质粒DNA注射到新生幼鼠的侧脑室内，并施加电流以递送并遗传操控神经干细胞...

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子宫内双次电穿孔技术可用于靶向空间和时间上分离的细胞群体。该技术可用于在正常条件下通过荧光蛋白观察这些细胞群体之间的相互作用，也可在功能实验干扰目的基因后进行观察。...

双子宫内电穿孔技术用于时空分离的细胞群体靶向

多孔基质电穿孔（PSEP）可实现稳定、高通量的递送，并保持高细胞存活率。跨上皮电阻（TEEI）测量的引入为PSEP的中间过程提供了深入见解，并实现了无标记递送。本文介绍了一种同时进行PSEP递送实验与TEEI测量分析的方法。...

基于多孔基底的电穿孔结合跨上皮电阻监测

学习新生儿软脑膜表面电穿孔技术，通过玻璃微针注射质粒DNA并施加电流，实现中枢神经系统神经祖细胞的遗传标记与操控。该方法安全灵活，可用于研究神经发育中的细胞谱系与分化机制。

新生小鼠软脑膜表面电穿孔技术

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