Name: 肿瘤微环境基质与应用癌细胞侵袭组织工程 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-03-18T15:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 48 s
Description: 学习利用成纤维细胞培养生成天然基质以研究肿瘤细胞侵袭行为。该方法通过三维培养和组织学分析，评估肿瘤微环境对癌细胞生物学的影响，为癌症研究提供更接近生理条件的模型。

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A.P.S 获得国际大疱性表皮松解症协会（DebRA International）和英国皮肤基金会的资助。Y.Z.N 获得新加坡科技研究局—邓迪大学合作博士项目（A*STAR - University of Dundee Partnership PhD Programme）的资助。

本研究遵循赫尔辛基宣言原则，并获得了相应伦理委员会的批准。
1. 培养基与试剂的准备
<ol>
	<li>200倍L-抗坏血酸-2-磷酸盐储备液的制备
	<ol>
		<li>每5 ml杜氏改良伊格尔培养基（DMEM）溶液中溶解29 mg L-抗坏血酸-2-磷酸盐，并通过0.22 μm微孔滤膜过滤。分装为0.25 ml无菌等份，于-20 °C保存。</li>
		<li>根据需要，在当天向每50 ml成纤维细胞培养基（含1% L-谷氨酰胺和10%胎牛血清的DMEM）中加入0.25 ml 200倍L-抗坏血酸-2-磷酸盐储备液，使L-抗坏血酸-2-磷酸盐终浓度为0.1 mM。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>角质形成细胞生长培养基的制备
	<ol>
		<li>原代鳞状细胞癌角质形成细胞的分离与培养方法已有先前报道21，其中也描述了角质形成细胞生长培养基的制备方法。</li>
		<li>简要步骤如下： 
		300 ml DMEM 和 100 ml Ham’s F-12，添加10% FBS 
		0.4 mg/ml 氢化可的松 
		5 mg/ml 胰岛素 
		10 ng/ml 表皮生长因子（EGF） 
		5 mg/ml 转铁蛋白 
		8.4 ng/ml 霍乱毒素 
		13 ng/ml 三碘甲状腺原氨酸 
		1x 青霉素-链霉素溶液</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 体外 在添加L-抗坏血酸-2-磷酸的培养基中构建成纤维细胞来源的天然基质
<ol>
	<li>在6孔板中，每孔接种200,000个成纤维细胞（20,000个细胞/cm2），使用添加L-抗坏血酸-2-磷酸的成纤维细胞培养基。每隔2-3天更换一次培养基，每次加入2-5 ml。（注意：换液频率和体积可根据不同细胞的具体需求进行调整。参见“讨论”部分）。</li>
	<li>培养6周后，可见肉眼可见的、嵌入细胞外基质中的致密细胞层（图1）。为将该层从组织培养板上分离，先用1 ml微量移液器吸头轻轻刮取基质边缘，然后将基质边缘向孔中心推挤。此细胞与基质层（天然基质）应可轻松从培养板表面脱离，并漂浮于培养基中。将漂浮的天然基质在培养基中充分展开，避免其自身折叠。</li>
	<li>让天然基质在培养基中漂浮并继续重塑5天，每隔2-3天更换一次培养基。由于基质内部的张力及固有的重塑能力，基质会显著收缩，转变为体积更小但更厚的天然基质，此时即可用于侵袭实验。</li>
</ol>
3. 肿瘤SCC角质形成细胞侵袭实验
<ol>
	<li>用钝头镊子轻轻夹取天然基质，转移至尼龙网上。一旦置于尼龙网上，使用1 ml 微量移液器吸头和钝头镊子轻轻铺展基质，使其尽可能平展。</li>
	<li>通过在一端涂抹少量无菌凡士林，准备无菌克隆环。</li>
	<li>将克隆环放置在天然基质上，凡士林面朝下。此举可确保天然基质与克隆环之间形成紧密密封。</li>
	<li>向克隆环中加入cSCC细胞（100 µl 角质形成细胞生长培养基中含有250,000个细胞）。</li>
	<li>6小时后，当cSCC细胞已在天然基质上沉降，移除克隆环。</li>
	<li>将带有天然基质和cSCC细胞的尼龙网抬起，置于弯曲的不锈钢丝网支撑架上，使其达到气液界面。</li>
	<li>加入添加了抗坏血酸的角质形成细胞生长培养基，直至培养基液面接触天然基质底部。</li>
	<li>每2–3天更换一次培养基，并在cSCC细胞接种后第7天和第14天进行收获。</li>
</ol>
4. 三维培养物的收获及组织学制备
<ol>
	<li>在室温下用4%多聚甲醛固定过夜。</li>
	<li>将样本沿中线切开，包埋于石蜡中制备福尔马林固定石蜡包埋块，切面朝外。</li>
	<li>或者，将切开的样本包埋于OCT中，并立即在液氮中速冻，制备新鲜冷冻组织块。</li>
	<li>使用切片机切取4 μm厚的切片，并脱蜡（如需要）。采用标准苏木精和伊红染色。为显示cSCC细胞，可在免疫组织化学染色中使用针对角蛋白14的小鼠单克隆抗体（LL001，实验室自制）。</li>
</ol>

<ol><li>Bell, E., Ehrlich, H. P., Buttle, D. J., Nakatsuji, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Living+tissue+formed+in+vitro+and+accepted+as+skin-equivalent+tissue+of+full+thickness%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Living tissue formed in vitro and accepted as skin-equivalent tissue of full thickness.</a> Science. 211 (4486), 1052-1054 (1981).</li>
<li>Asselineau, D., Bernhard, B., Bailly, C., Darmon, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epidermal+morphogenesis+and+induction+of+the+67+kD+keratin+polypeptide+by+culture+of+human+keratinocytes+at+the+liquid-air+interface%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Epidermal morphogenesis and induction of the 67 kD keratin polypeptide by culture of human keratinocytes at the liquid-air interface.</a> Exp. Cell Res. 159 (2), 536-539 (1985).</li>
<li>Pruniéras, M. M., Régnier, M. M., Woodley, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+Cultivation+of+Keratinocytes+with+an+Air-Liquid+Interface%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Invest.+Dermatol%22%5BJournal%5D)">Methods for Cultivation of Keratinocytes with an Air-Liquid Interface.</a> J. Invest. Dermatol. 81 (1 Suppl), 28-33 (1983).</li>
<li>Prunieras, M., Régnier, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+procedure+for+culturing+human+epidermal+cells+on+allogenic+or+xenogenic+skin%3A+preparation+of+recombined+grafts%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Chir.+Plast%22%5BJournal%5D)">New procedure for culturing human epidermal cells on allogenic or xenogenic skin: preparation of recombined grafts.</a> Ann. Chir. Plast. 24 (4), 357-362 (1979).</li>
<li>Gaggioli, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibroblast-led+collective+invasion+of+carcinoma+cells+with+differing+roles+for+RhoGTPases+in+leading+and+following+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Fibroblast-led collective invasion of carcinoma cells with differing roles for RhoGTPases in leading and following cells.</a> Nature. 9 (12), 1392-1400 (2007).</li>
<li>Bhowmick, N. A., Neilson, E. G., Moses, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stromal+fibroblasts+in+cancer+initiation+and+progression%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Stromal fibroblasts in cancer initiation and progression.</a> Nature. 432 (7015), 332-337 (2004).</li>
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<li>Vukicevic, S., Kleinman, H. K., Luyten, F. P., Roberts, A. B., Roche, N. S., Reddi, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+multiple+active+growth+factors+in+basement+membrane+Matrigel+suggests+caution+in+interpretation+of+cellular+activity+related+to+extracellular+matrix+components%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Identification of multiple active growth factors in basement membrane Matrigel suggests caution in interpretation of cellular activity related to extracellular matrix components.</a> Exp. Cell Res. 202 (1), 1-8 (1992).</li>
<li><a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BD+Biosciences+-+Discover+Labware%5BTitle%5D)+AND+%22SPC-356230+Rev+5.0+at+Rev+5.0%22%5BJournal%5D)">BD Biosciences - Discover Labware.</a> SPC-356230 Rev 5.0 at Rev 5.0. , Available from:
 
 <a target="_blank" href="http://SPC-356230 Rev 5.0">http://SPC-356230 Rev 5.0</a> Forthcoming.</li>
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<li>Hovnanian, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+linkage+of+recessive+dystrophic+epidermolysis+bullosa+to+the+type+VII+collagen+gene%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">Genetic linkage of recessive dystrophic epidermolysis bullosa to the type VII collagen gene.</a> J. Clin. Invest. 90 (3), 1032-1036 (1992).</li>
<li>Ryynänen, M. M., Ryynänen, J. J., Sollberg, S. S., Iozzo, R. V. R., Knowlton, R. G. R., Uitto, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+linkage+of+type+VII+collagen+%28COL7A1%29+to+dominant+dystrophic+epidermolysis+bullosa+in+families+with+abnormal+anchoring+fibrils%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">Genetic linkage of type VII collagen (COL7A1) to dominant dystrophic epidermolysis bullosa in families with abnormal anchoring fibrils.</a> J. Clin. Invest. 89 (3), 974-980 (1992).</li>
<li>Ng, Y. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibroblast-derived+dermal+matrix+drives+development+of+aggressive+cutaneous+squamous+cell+carcinoma+in+patients+with+recessive+dystrophic+epidermolysis+bullosa%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Fibroblast-derived dermal matrix drives development of aggressive cutaneous squamous cell carcinoma in patients with recessive dystrophic epidermolysis bullosa.</a> Cancer Res. 72 (14), 3522-3534 (2012).</li>
<li>Larouche, D., Paquet, C., Fradette, J., Carrier, P., Auger, F. A., Germain, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chapter+15%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Chapter 15.</a> Methods Mol. Biol. 482, 233-256 (2009).</li>
<li>Pouliot, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstructed+human+skin+produced+in+vitro+and+grafted+on+athymic+mice%29%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">Reconstructed human skin produced in vitro and grafted on athymic mice).</a> Transplantation. 73 (11), 1751-1757 (2002).</li>
<li>Purdie, K. J., Pourreyron, C., South, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+culture+of+squamous+cell+carcinoma+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Biol%22%5BJournal%5D)">Isolation and culture of squamous cell carcinoma lines.</a> Methods Biol. 731, 151-159 (2011).</li>
<li>Pinnell, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+collagen+biosynthesis+by+ascorbic+acid%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22Yale+J.+Biol.+Med%22%5BJournal%5D)">Regulation of collagen biosynthesis by ascorbic acid: a review.</a> Yale J. Biol. Med. 58 (6), 553-559 (1985).</li>
<li>Hata, R., Senoo, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((L-ascorbic+acid+2-phosphate+stimulates+collagen+accumulation%2C+cell+proliferation%2C+and+formation+of+a+three-dimensional+tissuelike+substance+by+skin+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Physiol%22%5BJournal%5D)">L-ascorbic acid 2-phosphate stimulates collagen accumulation, cell proliferation, and formation of a three-dimensional tissuelike substance by skin fibroblasts.</a> J. Cell. Physiol. 138 (1), 8-16 (1988).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

由于本实验的性质，完成实验所需的总时间可能长达两个月。在此期间，必须格外小心，并采用无菌细胞培养技术，以防止微生物污染。

除了作为胶原蛋白中羟脯氨酸和羟赖氨酸合成过程中的辅因子外，抗坏血酸还能刺激成纤维细胞中胶原蛋白特异性mRNA的表达22。此处选用的抗坏血酸为更稳定的L-抗坏血酸-2-磷酸盐23。建议每周换液三次，但具体频率需根据所培养的细胞类型而定。初始的成纤维细胞培养物随着培养时间的延长会消耗更多营养物质，因此可能需要更频繁地更换培养基，并使用更大体积的培养液。在更换培养基时操作应轻柔，注意尽量减少对细胞层的扰动，尤其是在天然基质生成过程中。

基质通常在2周后变得可见，尤其是在孔板的周边区域。偶尔，基质会自行脱离，无需任何机械干预。这反映了基质内在的重塑过程及其张力强度，这种张力会将基质向内牵拉，但也可能表明在更换培养基时，原有基质的边缘区域受到了扰动。
...

生物材料在三维组织培养中的应用使研究人员能够在实验室中更接近生理条件下研究细胞行为 体内 相较于在二维黏附条件和塑料基质上重建的环境，采用气-液界面三维培养方法在模拟复层上皮方面已取得显著进展。1-4这些技术能够真实模拟角质形成细胞的分化和肿瘤细胞的侵袭过程，为研究这些生物学过程的研究人员提供了更高的灵活性和保真度。用于模拟间质环境的生物材料基质主要采用Ⅰ型胶原、Engelbreth-Holm-Swarm小鼠肉瘤基质以及去表皮真皮。例如，已发现癌症相关成纤维细胞可促进癌症的侵袭5，通过间质-上皮相互作用的起始与进展6,7 在这些底物中培养时。

在利用此类技术研究的最大且最受关注的分层上皮——皮肤中，模拟其基质环境的金标准被认为是去表皮人真皮（DED）。DED的制备需通过胰蛋白酶消化或物理分离的方法，将表皮从人尸体皮肤中去除3,4。然而，对于未与临床机构关联的实验室而言，获取此类皮肤非常困难，而病变真皮则几乎无法获得。作为替代方案，实验室常使用I型胶原（源自大鼠尾部）和/或Engelbreth-Holm-Swarm小鼠肉瘤基质的组合。

1927年，Nageotte8发现可通过乙酸和盐析法轻松分离胶原蛋白，此后Huzella及其同事9率先将其应用于组织培养。Ehrmann和Gey9的研究表明，在29种细胞株和组织外植体的细胞培养中，胶原蛋白包被基质优于玻璃表面。目前组织培养中主要使用的胶原蛋白来源于大鼠尾腱，通常购自商业来源。然而，该基质在忠实模拟天然环境方面存在缺陷：大鼠尾胶原蛋白与人类胶原蛋白或人类真皮并不相同，后者主要成分为I型和III型胶原蛋白，而分离获得的大鼠尾胶原蛋白则不可避免地存在片段化现象。

Engelbreth-Holm-Swarm 小鼠肉瘤基质是由培养的 Engelbreth-Holm-Swarm 小鼠肉瘤细胞分泌的一种胶状蛋白质混合物10。其主要成分为层粘连蛋白、IV 型胶原蛋白、硫酸乙酰肝素蛋白聚糖、entactin 和 nidogen，这些蛋白质的确切比例在不同批次之间会有所变化。除了结构蛋白外，该基质还含有较高水平的生长因子，例如转化生长因子 β、表皮生长因子、胰岛素样生长因子 1、牛成纤维细胞生长因子以及血小板源性生长因子，这些因子会影响细胞行为11,12。最近一项蛋白质组学研究共鉴定出 1,851 种蛋白质，进一步说明了 Engelbreth-Holm-Swarm 小鼠肉瘤基质的极端复杂性13。鉴于该基质成分丰富且结构复杂，在使用该基质进行实验时，对不同实验结果的解释与比较应谨慎对待11。

我们的实验室对遗传性皮肤病具有浓厚兴趣，特别是那些易发生皮肤鳞状细胞癌（cSCC）的疾病14。在隐性营养不良型大疱性表皮松解症（RDEB）的研究中，该病是一种由COL7A1基因种系突变引起的严重水疱性皮肤病15-17，我们已确定这些患者的真皮微环境具有促肿瘤特性18。在本研究过程中，我们无法评估嵌于I型胶原/Engelbreth-Holm-Swarm小鼠肉瘤基质中的真皮成纤维细胞的促肿瘤特性，因此探索了评估细胞自身天然基质的方法。为此，我们改进了Lucie Germain实验室先前用于构建人皮肤等效物的技术19,20。Germain的技术能够在无合成或尸体来源支架的情况下，利用原代人角质形成细胞和成纤维细胞培养体系重建具有结构良好基底膜的人皮肤。

本文所述步骤用于重建直接来源于原代基质成纤维细胞的皮肤肿瘤基质微环境（天然基质） 体外 被描述18. 利用成纤维细胞长期培养产生的天然基质作为真皮等效物，用于检测cSCC细胞的侵袭能力。本文展示了使用天然基质的研究数据，这些基质来源于RDEB成纤维细胞分泌的细胞外基质（缺乏VII型胶原蛋白（C7）），或来源于经逆转录病毒转导表达VII型胶原蛋白构建体的RDEB成纤维细胞，结果表明单一胶原蛋白对肿瘤细胞侵袭具有显著影响。

<table><tbody><tr><td>L-抗坏血酸-2-磷酸</td><td>Sigma</td><td>A8960</td><td></td></tr><tr><td>含L-谷氨酰胺、4,500 mg/L D-葡萄糖、110 mg/L 丙酮酸钠的DMEM培养基</td><td>Life Technologies</td><td>11995-073</td><td></td></tr><tr><td>100倍青霉素-链霉素溶液</td><td>Life Technologies</td><td>15070</td><td></td></tr><tr><td>凡士林</td><td>VWR</td><td>PROL28908.290</td><td></td></tr><tr><td>克隆环</td><td>Sigma</td><td>Z370789</td><td></td></tr><tr><td>亲水性尼龙网滤膜，孔径100 &amp;#956;m，直径25 &amp;#956;m，每包100片</td><td>Millipore</td><td>NY1H02500</td><td></td></tr><tr><td>弯曲的不锈钢丝网支撑架</td><td>实验室自制</td><td></td><td>尺寸设计为可放入6孔板中</td></tr></tbody></table>

肿瘤间质微环境的组织工程构建及其在癌细胞侵袭研究中的应用

Tissue Engineering of Tumor Stromal Microenvironment with Application to Cancer Cell Invasion

在嵌有间充质细胞的基质上培养上皮细胞的三维类器官培养体系，被广泛用于研究上皮细胞的分化与侵袭行为。传统上，大鼠尾部来源的I型胶原蛋白和/或源自Engelbreth-Holm-Swarm小鼠肉瘤细胞的基质常被用作模拟间充质细胞（通常为成纤维细胞）所处的基质或间质微环境的底物。尽管使用此类基质的实验具有重要信息价值，但可以认为，由于这些底物中单一蛋白成分占主导（如I型胶原蛋白），或富含基底膜组分和生长因子（如小鼠肉瘤细胞来源的基质），它们并不能最真实地反映间质细胞自身对基质成分的贡献。为了研究从易发生肿瘤的遗传性大疱性皮肤病（隐性营养不良型大疱性表皮松解症）患者中分离得到的原代皮肤成纤维细胞所分泌的天然基质，我们改进了一种现有的天然基质制备方案，用于研究肿瘤细胞的侵袭能力。该方法诱导成纤维细胞在长期培养过程中自主分泌形成其天然基质，随后将该基质从培养皿上分离，并在其上接种上皮细胞，再将整个共培养体系置于气-液界面进行培养。随后可在不同时间点评估细胞的分化状态和/或侵袭行为。该技术能够在三维环境中评估上皮-间充质细胞间的相互作用，且无需使用人工或外源性基质，唯一的缺点是制备天然基质所需时间较长。本文中，我们描述了该技术的应用，用于评估成纤维细胞表达的一种分子——VII型胶原蛋白——抑制肿瘤细胞侵袭的能力。

该技术为在不同三维间质环境下检测和比较肿瘤细胞（本例中为cSCC）的侵袭行为提供了可能。利用该技术，不仅可以构建模拟RDEB真皮环境的C7缺陷型天然基质，还可构建经基因工程改造而过表达C718的其他基质。如图2所示，与C7缺陷型RDEB对照基质相比，RDEB cSCC角质形成细胞在C7过表达的天然基质中的侵袭显著受到抑制。该侵袭行为通过标准组织学方法进行可视化观察，即将凝胶固定后包埋于石蜡块中，切片并进行免疫染色。建议用于染色的抗体包括：针对cSCC细胞的抗角蛋白14抗体（LL001）和针对成纤维细胞的抗波形蛋白抗体（V9）。
<img alt="成纤维细胞-角质形成细胞培养过程示意图；抗坏血酸处理，气液界面。" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51321/51321fig1highres.jpg" width="500" data-altupdatedat="1787630408000" d...

由成纤维细胞构建的组织工程天然基质是一种新兴工具，可用于生成支持上皮细胞增殖和分化的间质基底。本文介绍了一种应用该方法评估不同类型间质细胞对肿瘤细胞生物学特性影响的实验方案。

将上皮细胞在嵌有间充质细胞的基质上进行三维类器官培养，被广泛用于研究上皮细胞的分化以及……

以下实验方案的总体目标是利用成纤维细胞生成天然基质，以评估肿瘤细胞的侵袭能力。首先，在含有山梨酸的培养基中于塑料表面培养成纤维细胞，以生成天然基质。第二步，将该天然基质从塑料培养表面分离并释放，随后在基质中接种肿瘤细胞，并在固定时间后将其提升至气液界面。这些三维培养物将被收获，用于对肿瘤细胞侵袭进行组织学分析。最终，可通过免疫组织化学分析评估天然成纤维细胞基质对肿瘤细胞侵袭的影响。因此，该三维典型培养技术的优势在于，我们能够在不存在合成材料或外源性基底（如异种Ⅰ型胶原）的情况下，评估成纤维细胞自身产生的天然基质。首先，在六孔板中，以成纤维细胞培养基接种每孔200,000个成纤维细胞，培养基中需添加新鲜配制的IC酸。每两到三天用两到五毫升新鲜培养基更换磷酸盐缓冲液。六周结束时，肉眼可见嵌在细胞外基质中的细胞形成较厚的一层。根据所用细胞类型的不同，可见的基质可能更早或更晚形成，并可能开始从培养皿上脱落，如此处所示。为使该层从组织培养板上脱离，先用1毫升微量移液器枪头轻轻刮取基质的边缘，然后将基质的边缘向孔的中心推压。细胞和天然基质应能轻易从培养板表面脱离，并悬浮于培养基中。在培养基中将天然基质充分展开，以避免其自身折叠。 让天然基质漂浮并重塑五天，由于张力强度和内在重塑作用，每两到三天继续更换培养基。基质将显著收缩，变为更小但更厚的天然基质，此时即可用于侵袭实验。进行侵袭实验时，首先使用钝头镊子将天然基质轻轻转移至尼龙网上。待基质置于网上后，用1毫升微量移液枪头配合钝头镊子轻轻铺展基质，使其尽可能平整地平铺。接下来，将少量凡士林涂抹到每个基质对应的无菌克隆圆环的一端。然后将圆环以涂抹凡士林的一侧朝下放置于天然基质上，以确保天然基质与克隆环之间形成紧密密封。现在向圆环中加入250,000个皮肤鳞状细胞癌（SCC）细胞，使用胡萝卜素位点生长培养基。待皮肤鳞状细胞癌细胞在天然基质上贴壁后，移除圆柱体，然后将尼龙网支撑的天然基质连同皮肤鳞状细胞癌细胞一起抬升至气液界面，并置于弯曲的不锈钢丝网支撑物上。最后加入角质形成细胞生长培养基，添加山梨酸作为补充成分，使培养基液面刚好接触天然基质的底部，每两到三天更换一次培养基，并在皮肤鳞状细胞癌细胞接种后的第7天和第14天进行收获。该技术为在不同三维间质环境中观察和比较肿瘤细胞的侵袭行为提供了可能。如图所示，在右侧图中，过表达C7的RDEB皮肤鳞状细胞癌角质形成细胞在天然基质中的侵袭能力显著低于左侧图中C7缺乏的RDEB对照组。该技术的建立使研究人员能够直接评估成纤维细胞产生的天然基质对肿瘤细胞侵袭等过程的影响。

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科研

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生物工程

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