肿瘤间质微环境的组织工程构建及其在癌细胞侵袭研究中的应用

以下实验方案的总体目标是利用成纤维细胞生成天然基质，以评估肿瘤细胞的侵袭能力。该过程首先在含有山梨酸的培养基中于塑料表面培养成纤维细胞，以形成天然基质。第二步中，将天然基质从塑料培养表面分离并释放，随后在该基质上接种肿瘤细胞，并在固定培养时间后将其提升至气液界面。

将这些三维培养物收获后用于肿瘤细胞侵袭的组织学分析。最终，可通过免疫组织化学分析来评估天然成纤维细胞基质对肿瘤细胞侵袭的影响。该三维典型培养技术的优势在于，我们能够在无任何合成材料或外源性基质（如异种Ⅰ型胶原）的条件下，评估成纤维细胞自身所产生的天然基质。首先，在六孔板中，以添加了新鲜配制的IC酸的成纤维细胞培养基，按每孔200,000个成纤维细胞的密度进行接种。

每两到三天用二至五毫升新鲜培养基更换一次磷酸盐。六周结束时，将形成肉眼可见的、嵌入细胞外基质中的致密细胞层。根据所使用的细胞类型，可见的基质可能更早或更晚形成，并可能开始从培养皿上脱落，如此处所示。

为使该层从组织培养板上脱离，先用1毫升微量移液器吸头轻轻刮取基质的边缘，然后将基质边缘向孔的中心推压。细胞及天然基质应可轻易从培养板表面脱离，并悬浮于培养基中。在培养基中将天然基质充分展开，以避免其自身折叠。

让天然基质漂浮并重塑五天，由于张力强度和内在重塑作用，每两到三天需更换一次培养基。基质将显著收缩，变为更小但更厚的天然基质，此时即可用于侵袭实验。

进行侵袭实验时，首先使用钝头镊子将天然基质轻轻转移至尼龙网上。一旦基质置于网上，使用1毫升微量移液器吸头和钝头镊子轻轻铺展基质，使其尽可能平展。

接下来，将少量凡士林涂抹在每个基质对应的无菌克隆圆筒的一端。然后将圆筒凡士林面朝下放置在原代基质上，以确保原代基质与克隆环之间形成紧密密封。现在向圆筒中加入250,000个皮肤鳞状细胞癌（SCC）细胞及适量的胡萝卜素位点生长培养基。

待皮肤鳞状细胞癌细胞在天然基质上贴壁后，移除圆柱体，然后将尼龙网支撑的天然基质连同皮肤鳞状细胞癌细胞一起抬升至气液界面，并置于弯曲的不锈钢丝网支架上。最后加入角质形成细胞生长培养基，添加山梨酸作为补充，使培养基液面刚好接触天然基质的底部，每两到三天更换一次培养基，并在皮肤鳞状细胞癌细胞接种后的第7天和第14天进行收获。该技术为在不同三维间质环境中观察和比较肿瘤细胞的侵袭行为提供了可能。

如图所示，在右侧图中，过表达C7的RDEB皮肤鳞状细胞癌角质形成细胞在天然基质中的侵袭能力显著低于左侧图中C7缺乏的RDEB对照组。该技术的建立使研究人员能够直接评估成纤维细胞产生的天然基质对肿瘤细胞侵袭等过程的影响。