Name: 3维组织学音量和其研究小鼠乳腺腺体的应用改造 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-07-26T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 59 s
Description: 学习三维组织学体积重建的图像配准方法，用于研究小鼠乳腺细胞宏观结构变化。该技术通过对比野生型与Igfbp7基因敲除小鼠的乳腺腺体，揭示腺体大小差异，为乳腺发育和泌乳机制研究提供高分辨率空间信息。

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作者感谢桑尼布鲁克研究所的生物标志物成像&#160;研究实验室（BIRL）提供的组织学服务。本研究得到了特里·福克斯基金会、加拿大乳腺癌基金会—草原-西北地区以及加拿大卫生研究院（CIHR）基金项目（#MOP-97996）的支持。

1. 样本
<ol>
	<li>在乳汁分泌开始三天后，从野生型 CDH1 以及 Igfbp7 基因敲除小鼠中手术切除乳腺组织。</li>
	<li>将乳腺组织铺展在玻璃载片上，以帮助恢复其天然的乳腺形态。</li>
</ol>
2. 固定与组织处理
<ol>
	<li>将乳腺组织置于中性缓冲的4%多聚甲醛中，4&#160;oC条件下固定过夜。</li>
	<li>在组织处理前，将组织保存于70%乙醇中。</li>
	<li>将乳腺组织转移至小型组织处理盒中。</li>
	<li>使用自动组织处理仪进行组织处理
	<ol>
		<li>依次用浓度递增的乙醇和二甲苯溶液进行脱水：70%乙醇中45分钟，95%乙醇中两次、每次45分钟，100%乙醇中三次、每次1小时，二甲苯中两次、每次45分钟。</li>
		<li>在真空加压条件下，用石蜡渗透组织，每次1小时，共3次。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将组织包埋于石蜡中制成蜡块，以备切片。</li>
</ol>
3. 组织学与块面成像
<ol>
	<li>使用旋转式切片机修整石蜡包埋块，直至去除多余的石蜡。</li>
	<li>使用垂直铣床在石蜡包埋块至少两个角上垂直于包埋盒的方向钻出1 mm的孔。</li>
	<li>将组织块安装到旋转式切片机上。</li>
	<li>在切片机前方安装切面成像系统19。</li>
	<li>在切片前采集石蜡块切面的光学图像。</li>
	<li>在切片机上以5 μm厚度连续切出四片一组的切片条带。
	<ol>
		<li>将切片条带转移至冷水浴中。</li>
		<li>分离条带中的第二片和第四片切片，并将其贴附于载玻片上。选择第二片和第四片可使相邻切片之间保持5 µm的间隔。</li>
		<li>将每张切片在温水浴（48 oC）中展开以消除皱褶，然后重新贴附于载玻片上。 
		注意：切片、贴片和展片过程可能导致切片出现撕裂、折叠、收缩或膨胀等形变。这些伪影会增加组织学切片配准的难度。</li>
		<li>使用自动染色机对切片进行苏木精-伊红（H&amp;#38;E）染色。</li>
		<li>使用自动封片机对载玻片进行封片。</li>
		<li>使用数字组织学切片扫描仪以目标分辨率对切片进行数字化。本实验方案采用20倍放大倍数，分辨率为0.47 μm。</li>
		<li>将组织学图像降采样至与块面图像相同的分辨率，即18 μm。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 图像配准
<ol>
	<li>图像分割与点选择
	<ol>
		<li>在块面图像中测量定位孔的像素值，并使用平均值作为固定阈值，以分割石蜡块角落中的定位孔。</li>
		<li>由于使用固定阈值可能会额外分割出其他部分，因此利用分割对象的圆形度和面积来识别定位孔并剔除多余对象。为此，编写一小段代码，计算各分割对象的 (4π × 面积)/(周长)2 比值，该比值在圆形物体中为 1。</li>
		<li>针对每个乳腺组织，选择一幅块面图像作为参考图像，并利用定位孔中心及基于标志点的配准技术，将其余块面图像与参考图像对齐。</li>
		<li>对于已对齐的块面图像，手动分割或提取组织区域以去除背景。在后续流程中使用掩膜中面积最大的对象。</li>
		<li>对于 H&amp;#38;E 切片，按以下步骤进行自动分割。
		<ol>
			<li>采用 Otsu 阈值法20 将组织学图像与背景分离，并生成组织学图像的二值掩膜。</li>
			<li>利用标记对象的直方图，在每个掩膜中识别并选择面积最大的对象。</li>
			<li>从组织学图像和块面图像的掩膜中提取宽度为一个像素的边界点。</li>
			<li>使用链码算法21，将边界点表示为一系列分段线性拟合。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>初始刚性配准
	<ol>
		<li>采用傅里叶描述子算法22，计算组织学图像边界点与其对应块面图像边界点之间的初始刚性变换。该初始变换包括平移、旋转和缩放因子。</li>
		<li>利用上一步获得的初始变换对每幅组织学图像进行变换。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>刚性配准的优化
	<ol>
		<li>使用滚珠滤波器23 去除组织学轮廓中高曲率的边缘部分。</li>
		<li>使用均匀分布从剩余的组织学边界点中随机选取 500 个点。</li>
		<li>利用傅里叶描述子获得的初始变换，对组织学随机边界点进行变换。</li>
		<li>选取全部块面图像边界点，使用迭代最近点（ICP）算法24 计算块面边界点（目标）与组织学随机边界点之间的刚性变换。</li>
		<li>对上一步获得的已对齐组织学图像进行变换，由此生成的图像序列构成组织学三维体积数据。</li>
		<li>使用三维可视化软件生成组织学体积数据的可视化图像。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>以 5 倍放大倍率查看图像序列
	<ol>
		<li>将原始组织学图像下采样至 5 倍放大倍率。</li>
		<li>在一幅组织学图像中裁剪出感兴趣区域。</li>
		<li>结合两次配准步骤所得的刚性变换，计算该区域在其他 5 倍放大倍率组织学图像中的位置。</li>
		<li>在所有其他组织学图像中，将感兴趣区域裁剪为相同尺寸的区域。</li>
		<li>最后手动优化各区域之间的对齐效果。编写一个程序，能够叠加两幅图像，允许用户调节其中一幅图像相对于另一幅的旋转和平移参数，并在对齐满意后保存变换后的图像。</li>
		<li>使用三维可视化软件查看已对齐的 5 倍放大倍率组织学区域图像序列。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露

本研究中，我们开发了一种图像配准工作流程，用于从连续的二维组织学图像重建三维组织学体积，该方法无需在组织内选择随机的内部标志点或植入基准标记物，从而避免对组织造成形变。根据所述方法，在切片前将光学块面图像本身用作参考图像。我们利用在石蜡块上钻取的外部孔洞来辅助对齐块面图像，并校正石蜡块在相机前发生的二维横向移动。将二维组织学图像与对应的二维块面图像对齐，以防止配准误差的累积传播，从而即使在因石蜡块问题导致连续切片存在缺陷的情况下，仍能重建出精确的组织学体积。为了使该工作流程独立于组织类型和所使用的组织学染色方法，我们采用边界点进行配准。这种基于点的方法相较于基于强度的方法具有优势，即计算需求更低，因而更适用于处理非常大的数字病理图像。
使用块面图像对齐组织学图像的另一个优势在于，组织学图像之间的间距不会影响其对齐生成组织学体积图像的质量。这一点在临床环境中尤为重要，因为切片间距可能变化很大，通常可大至半厘米。
在本文中，我们已证明该方法对于两种结构和强度变化不同的乳腺组织具有可重复性。由于该方法利用组织切片的边界信息，不同腺体...

IGFBP7（胰岛素样生长因子结合蛋白7）属于胰岛素样生长因子结合蛋白家族，已被证明能够结合IGF1受体4。已知IGFBP7的下调与乳腺癌的不良预后相关5，而在异种移植肿瘤模型中重新引入IGFBP7可显著抑制肿瘤生长6，其机制涉及诱导细胞凋亡和细胞衰老7。为了研究IGFBP7的作用，研究人员构建了Igfbp7基因敲除小鼠5（未发表数据）。尽管这些小鼠不会自发形成肿瘤，但其卵巢、肌肉和肝脏组织的组织学结构出现改变，并伴有乳腺发育模式异常（未发表数据）。该缺陷表型最初表现为基因敲除小鼠产仔数量较少，且无法维持多次大规模繁殖（未发表数据）。
三维组织学体积图像有望为定量和比较分析以及体医学影像中病理学发现的评估提供有用信息。三维共聚焦、双光子显微镜可在局部范围内提供腺体的高分辨率细胞形态学信息14，但其视野和成像深度有限。组织学体积重建则可在更大的空间范围内提供更多信息。采用传统方法制备组织学切片时，通常会出现一些形变，如收缩、膨胀、撕裂和折叠。这些形变使得将连续的组织学图像配准为三维图像堆栈以重建三维体积变得困难。随着存在缺陷的连续切片数量增加，完整切片之间的相似性降低，从而使配准过程更加复杂。
已有多种方法被提出用于对齐组织学切片并构建连续的组织学三维体积。某些技术依赖于图像强度的变化8，而另一些则基于切片的形态特征9。对于某些样本，可利用解剖结构作为标志点10,11，结合基于标志点的配准方法进行对齐12,13。但这些内部结构可能在整个体积中无法持续识别，且对于某些样本，难以确定可靠的解剖标志。一些研究团队采用逐对配准策略，利用轮廓或解剖结构将连续的组织学图像依次对齐16-18。在缺乏参考图像的情况下，将系列组织学切片相互配准可能导致配准误差累积，并改变组织学体积的真实形态。逐对配准方法依赖于整组图像中切片形态及内部结构的一致性，因此要求对样本进行密集采样，而这一点在某些情况下可能无法实现，e.g., 对于临床样本。
在此流程中，我们使用块面图像作为组织学体积重建的参考图像集19。块面图像在将石蜡包埋的组织块安装到切片机上后、每次切片前拍摄。因此，单个连续切片的损伤不会干扰连续切片之间的配准8,11,15。我们采集块面图像的方式与其他研究组不同。光学块面图像通过远心镜头获取，以消除或最小化桶形畸变和透视畸变，这类畸变在使用普通光学镜头时通常会出现。这是本方法相较于其他已发表方法的优势之一，后者使用普通镜头进行块面成像。图像以轻微倾斜角度拍摄，利用组织块表面的反射增强组织与石蜡表面之间的对比度，并消除石蜡表面下方组织在深度方向上的阴影。此外，还使用摄影滤光片对来自组织块表面和组织的光线进行偏振，以平衡对比度19。为校正组织块在旋转式切片机上的位移，在组织块的角落钻出两到三个小孔，这些小孔在块面图像中易于识别。这些孔的质心与基于标志点的刚性配准相结合，用于对齐块面图像。

<table><tbody><tr><td>16% PFA</td><td>VWR International</td><td>15710</td><td>16% 多聚甲醛溶液</td></tr><tr><td>小型组织处理盒</td><td>VWR International</td><td>CA95029-956</td><td></td></tr><tr><td>Leica ASP300 全自动组织处理机</td><td>Leica</td><td>14047643515</td><td></td></tr><tr><td>100% 乙醇</td><td>Fisher Scientific</td><td>S25307B</td><td></td></tr><tr><td>二甲苯</td><td>VWR International&amp;nbsp;</td><td>CA95057-822</td><td></td></tr><tr><td>石蜡&amp;nbsp;</td><td>Thermo Fisher</td><td>39501006</td><td>Paraplast 组织包埋介质</td></tr><tr><td>Leica EG 1160 组织包埋中心</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Leica 旋转式切片机</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>研磨机</td><td>Argo</td><td></td><td></td></tr><tr><td>显微镜载玻片</td><td>VWR International&amp;nbsp;</td><td>CA48312-015</td><td></td></tr><tr><td>苏木精-伊红染色（H&amp;amp;E 染色）</td><td>VWR International</td><td></td><td></td></tr><tr><td>自动染色机</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>盖玻片&amp;nbsp;</td><td>VWR International&amp;nbsp;</td><td>48404-452</td><td></td></tr><tr><td>MEDITE RCM 7000 玻片封片机</td><td>MEDITE</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Leica SCN400 玻片扫描仪</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MATLAB</td><td>MathWorks Inc</td><td>MATLAB 2007b</td><td>开发软件</td></tr><tr><td>MeVisLab</td><td>MeVis Medical Solutions AG</td><td>MeVisLab 2.1</td><td>三维可视化软件</td></tr></tbody></table>

三维组织学图像体积重建及其在小鼠乳腺研究中的应用

Reconstruction of 3-Dimensional Histology Volume and its Application to Study Mouse Mammary Glands

组织学体积重建有助于在由细胞构成的宏观结构水平上研究器官的三维形态和体积变化。该技术还可用于研究和验证体积医学成像及治疗中的新技术与算法。构建不同器官的三维高分辨率图谱1,2,3也是组织学体积重建的另一项应用，为研究组织结构以及各种细胞特征之间的空间关系提供资源。本文介绍一种用于组织学体积重建的图像配准方法，该方法使用一组光学块面图像。重建所得的组织学体积能够可靠地反映样本的真实形状，且不引入传播性的后处理配准误差。本研究将两只小鼠乳腺的苏木精-伊红（H&amp;#38;E）染色切片与其对应的块面图像进行配准，配准过程利用了从组织学图像和块面图像中样本边缘提取的边界点。配准的准确性通过视觉方式进行评估，同时还在高分辨率下对乳腺宏观结构的对齐情况进行了视觉评估。
本研究详细阐述了该图像配准流程的各个步骤，从乳腺组织的切除到三维组织学体积重建。二维组织学图像可揭示成对切片之间的结构差异，而三维组织学体积则能够可视化乳腺在形态和体积上的差异。

传统显微技术的一个局限在于，对器官在微观层面的理解一次仅限于一个视野。即使是提供完整切片的“全视野”玻片，也无法提供三维信息。随着全切片动态扫描技术的发展，我们观察切片整体的能力已有所提升，但要推断结构仍需进行三维组织学体积重建。
为了更好地表征Igfbp7基因敲除小鼠的表型缺陷，对开始泌乳后3天切除的乳腺组织进行了三维重建。图1展示了本研究所提出方法在三维组织学重建中的流程。首先利用石蜡块四角的孔洞对块面图像进行配准。图2A-B分别显示了野生型和Igfbp7基因敲除型乳腺组织的块面图像体积。随后将组织学图像与其对应的已配准块面图像进行配准，以重建组织学体积。图3A-B分别展示了野生型和Igfbp7基因敲除型乳腺组织的重建后组织学体积。通过观察整体结构（视频A和B），可以发现突变型与野生型腺体在大小上的差异。然而，采用本文所述方法后可明显看出，这种大小差异主要体现在长度和宽度上，而有趣的是，在深度上并无显著差异。在本初步实验所用的样本中，野生型腺体深度为1.06 mm，而Igfbp...

我们提出了一种用于三维（3D）组织学体积重建的图像配准方法，该方法有助于在由细胞构成的宏观结构水平上研究器官的变化。利用该方法，我们研究了野生型与Igfbp7基因敲除型乳腺组织之间的三维结构差异。

组织学体积重建有助于在由细胞构成的宏观结构水平上研究器官的三维形态和体积变化。它可以……

本视频的总体目标是介绍一种用于三维组织学的图像配准方法，以及对乳腺细胞宏观结构变化研究的体积重建技术。为此，在野生型和胰岛素样生长因子结合蛋白七（IGF BP seven）基因敲除小鼠开始泌乳后第三天，从小鼠体内切除乳腺组织。随后对这些腺体组织进行处理，并包埋于石蜡块中以进行切片。随后采集组织块的下一个光学块面图像，并对组织块进行切片。采集切片图像后，利用定制软件将每张切片图像与其对应的块面图像对齐，以重建乳腺组织的组织学三维体积。所得数据凸显了突变型与野生型腺体在大小上的差异。与现有的三维共聚焦双重显微技术相比，该技术的主要优势在于能够提供空间范围大得多的信息。该方法还可用于研究和验证体积医学成像及治疗中的新技术与算法，以及实现对不同器官的三维高分辨率分析。这种重建的组织学体积图像能够可靠地呈现样本处理过程，且不存在累积的配准误差。当我们注意到IGF P七号基因敲除小鼠的产仔数较少，且无法维持多次大量产仔时，便首次萌生了采用此方法的想法，因此我们决定研究其乳腺组织的结构。将组织包埋于石蜡中后，使用旋转式切片机修块，直至去除多余的石蜡。接下来，使用垂直铣床在石蜡块至少两个角落垂直于包埋盒的方向上钻出1毫米的孔，然后将组织块安装到旋转式切片机上。接下来，在切片机前方设置块面成像系统时，将配备远摄镜头的相机以略微倾斜的角度置于组织块表面前方。相机应连接至切片机前方的计算机。然后在组织块前方放置一个光源，使相机能够捕捉到光源在组织块表面的反射光。调整相机角度，直至能够清晰区分组织块表面的组织与周围的石蜡。采集一张光学块面图像。然后使用切片机切下四片厚度为五微米的连续切片。将条带转移至冷水浴中，分离条带的各部分，然后用玻片捞取冷水中的第二段和第四段。将其转移至温水浴中以展开并去除皱褶。选择第二段和第四段可使各部分之间保持5微米的间隔。将切片从展片液中捞起并重新贴附到显微镜载玻片上，直至其完全展平。需要注意的是，切片、贴附和展平过程可能导致一些形变，例如撕裂、折叠、收缩和膨胀。这些人为假象会增加组织学切片配准的难度。使用自动染色机对切片进行苏木精和伊红（H&E）染色，然后使用自动封片机进行封片，并利用数字病理切片扫描仪以目标分辨率对切片进行数字化。本方案中，放大倍数为 20 ×，分辨率为 0.47 微米。本视频部分概述了图像配准过程，该过程通过使用本实验室开发的定制软件结合 MATLAB C++ 完成。首先使用 ITK 将组织学图像下采样至大体切面图像的分辨率，这会将组织学图像缩小 0.026 倍。接下来，进行图像分割和点选时，在 MATLAB 中打开几张块面图像，使用数据光标工具测量配准孔的像素值。将平均像素值作为固定阈值，用于分割配准孔。为去除多余的分割区域，利用分割对象的圆形度和面积保留孔洞，去除额外的分割部分。接下来，对每一块乳腺组织，选择一张切块表面图像作为参考。将其他切块表面图像的定位孔中心与参考图像的定位孔中心对齐。然后利用为定位孔获得的变换参数，对齐各切块表面图像，并手动分割或从背景中提取 h 和 d 切片的组织区域。使用 OSU 阈值技术将组织学图像与背景分离，并生成组织学图像的二值掩膜。接着，利用标记对象的直方图，识别并选择每个掩膜中尺寸最大的对象。从组织学图像和切块表面掩膜中提取宽度为一个像素的边界点。接下来，使用傅里叶描述子算法确定组织学图像边界点与其对应的切块表面图像之间的初始刚性变换。该初始变换包括平移、旋转和缩放因子。利用上一步得到的初始变换对每张组织学图像进行变换。为了优化刚性配准，使用滚动球滤波器从组织学轮廓中去除高曲率的边缘部分。接着，从剩余的组织学边界点中基于均匀分布随机选取500个点。利用傅里叶描述子获得的初始变换对组织学边界点进行变换。利用块状面边界点，并使用迭代最近点算法来确定块、面边界点与组织学图像之间的刚性变换。随机边界点。然后将上一步获得的组织学图像进行变换，以在三维可视化软件中创建组织学体积的可视化图像。进入实验室界面，选择模块，加载杂项文件，添加“从2D文件生成3D”模块。然后从菜单中选择图像，添加“图像属性转换”模块。最后，从“模块—可视化—3D查看器”中添加一个3D视图模块。双击“从2D文件合成3D”以加载图像，然后单击“创建3D”。通过双击“图像属性转换”来调整体素大小，并将体素大小设置为 0.018 0.018 0.01。双击“查看3D”以查看体数据。最后，按照随附文档中的步骤，以5倍放大倍数查看图像堆栈。为了更清楚地表征IGFBP-7基因敲除小鼠的缺陷，按照本文所述方法对乳腺组织进行了三维重建。这些图展示了野生型和基因敲除型乳腺组织重建后的组织学体积。请注意，右侧的突变腺体比左侧的野生型腺体更短且更窄，但其深度与野生型腺体相近，分别为1.06毫米和无效型腺体的1.02毫米。此外，可见左侧野生型腺体中由粉红色伊红染色指示的间质组织较少，而右侧的无效型腺体则似乎主要由间质组织构成。此处苏木精染色（用于识别有核细胞）显示，无效型腺体保持了其细胞密度，而野生型腺体则似乎主要包含腺体结构。为了进一步研究，此处对淋巴结区域的高分辨率图像进行了比对。可见一些较大的结构，这些结构本应充满乳汁。相比之下，IGFBP-7基因敲除腺体中的结构发育较少且不完善。此外，这些结构中充满了成纤维细胞样细胞。观看本视频后，您应能很好地掌握如何通过重建连续扫描切片来构建器官的三维重建图像。很好。现在，在尝试此操作时，重要的是要始终如一地为载玻片和扫描图像命名，因为两者的数量都会很多，而有序的组织是成功实施该操作的关键。还可以进行其他方法，例如针对特定细胞和疾病标志物的免疫组织化学，以回答其他问题，例如，血管系统如何渗透肿瘤？

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Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

3维组织学音量和其研究小鼠乳腺腺体的应用改造

本方法介绍了如何对小鼠乳腺组织进行解剖，并评估其发育情况和功能。通过整体封片法评估切除的乳腺组织的发育程度，同时采用基于催产素的肌上皮细胞收缩实验来评价泌乳功能。...

小鼠模型中乳腺发育与功能的评估

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人和小鼠侧脑室的三维建模及室周组织的组织学表征

啮齿类动物乳腺发育通常通过描述性评估或测量基本物理特征来进行评价。分支密度是乳腺发育的一个指标，但难以进行客观量化。本方案描述了一种可靠的方法，用于定量评估乳腺腺体的分支特征。...

使用Sholl分析法对大鼠乳腺全组织切片中的分支密度进行定量

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切片乳腺组织整体标本以识别病灶

本文介绍了一种分离完整小鼠乳腺组织以研究细胞外基质（ECM）表达及导管形态的实验方案。从小鼠第4对腹部乳腺中获取8至10周龄未产雌性小鼠的乳腺组织，经中性缓冲甲醛固定后进行切片，并采用免疫组织化学方法对细胞外基质蛋白进行染色。...

完整小鼠乳腺腺体的分离及其细胞外基质表达与腺体形态学分析

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小鼠模型中基于乙醇的消融溶液的导管内递送及X射线可视化用于乳腺癌的预防与局部治疗

本实验方案描述了一种利用激光扫描共聚焦显微镜和多光子显微镜对哺乳期小鼠乳腺进行活体成像的简便技术。...

活体乳腺组织亚细胞显微成像

学习三维组织学体积重建的图像配准方法，用于研究小鼠乳腺细胞宏观结构变化。该技术通过对比野生型与Igfbp7基因敲除小鼠的乳腺腺体，揭示腺体大小差异，为乳腺发育和泌乳机制研究提供高分辨率空间信息。

三维组织学图像体积重建及其在小鼠乳腺研究中的应用

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