三维组织学图像体积重建及其在小鼠乳腺研究中的应用

本视频的总体目标是介绍一种用于三维组织学的图像配准方法，以及对乳腺细胞宏观结构变化研究的体积重建技术。为此，在野生型和胰岛素样生长因子结合蛋白七（IGF BP seven）基因敲除小鼠开始泌乳后第三天，从小鼠体内切除乳腺组织。随后对这些腺体组织进行处理，并包埋于石蜡块中以进行切片。

随后采集组织块的下一个光学块面图像，并对组织块进行切片。采集切片图像后，利用定制软件将每张切片图像与其对应的块面图像对齐，以重建乳腺组织的组织学三维体积。所得数据凸显了突变型与野生型腺体在大小上的差异。

与现有的三维共聚焦双重显微技术相比，该技术的主要优势在于能够提供空间范围大得多的信息。该方法还可用于研究和验证体积医学成像及治疗中的新技术与算法，以及实现对不同器官的三维高分辨率分析。这种重建的组织学体积图像能够可靠地呈现样本处理过程，且不存在累积的配准误差。

当我们注意到IGF P七号基因敲除小鼠的产仔数较少，且无法维持多次大量产仔时，便首次萌生了采用此方法的想法，因此我们决定研究其乳腺组织的结构。将组织包埋于石蜡中后，使用旋转式切片机修块，直至去除多余的石蜡。接下来，使用垂直铣床在石蜡块至少两个角落垂直于包埋盒的方向上钻出1毫米的孔，然后将组织块安装到旋转式切片机上。

接下来，在切片机前方设置块面成像系统时，将配备远摄镜头的相机以略微倾斜的角度置于组织块表面前方。相机应连接至切片机前方的计算机。然后在组织块前方放置一个光源，使相机能够捕捉到光源在组织块表面的反射光。

调整相机角度，直至能够清晰区分组织块表面的组织与周围的石蜡。采集一张光学块面图像。然后使用切片机切下四片厚度为五微米的连续切片。

将条带转移至冷水浴中，分离条带的各部分，然后用玻片捞取冷水中的第二段和第四段。将其转移至温水浴中以展开并去除皱褶。选择第二段和第四段可使各部分之间保持5微米的间隔。

将切片从展片液中捞起并重新贴附到显微镜载玻片上，直至其完全展平。需要注意的是，切片、贴附和展平过程可能导致一些形变，例如撕裂、折叠、收缩和膨胀。这些人为假象会增加组织学切片配准的难度。

使用自动染色机对切片进行苏木精和伊红（H&E）染色，然后使用自动封片机进行封片，并利用数字病理切片扫描仪以目标分辨率对切片进行数字化。本方案中，放大倍数为 20 ×，分辨率为 0.47 微米。

本视频部分概述了图像配准过程，该过程通过使用本实验室开发的定制软件结合 MATLAB C++ 完成。首先使用 ITK 将组织学图像下采样至大体切面图像的分辨率，这会将组织学图像缩小 0.026 倍。

接下来，进行图像分割和点选时，在 MATLAB 中打开几张块面图像，使用数据光标工具测量配准孔的像素值。将平均像素值作为固定阈值，用于分割配准孔。为去除多余的分割区域，利用分割对象的圆形度和面积保留孔洞，去除额外的分割部分。

接下来，对每一块乳腺组织，选择一张切块表面图像作为参考。将其他切块表面图像的定位孔中心与参考图像的定位孔中心对齐。然后利用为定位孔获得的变换参数，对齐各切块表面图像，并手动分割或从背景中提取 h 和 d 切片的组织区域。

使用 OSU 阈值技术将组织学图像与背景分离，并生成组织学图像的二值掩膜。接着，利用标记对象的直方图，识别并选择每个掩膜中尺寸最大的对象。从组织学图像和切块表面掩膜中提取宽度为一个像素的边界点。

接下来，使用傅里叶描述子算法确定组织学图像边界点与其对应的切块表面图像之间的初始刚性变换。该初始变换包括平移、旋转和缩放因子。利用上一步得到的初始变换对每张组织学图像进行变换。

为了优化刚性配准，使用滚动球滤波器从组织学轮廓中去除高曲率的边缘部分。接着，从剩余的组织学边界点中基于均匀分布随机选取500个点。利用傅里叶描述子获得的初始变换对组织学边界点进行变换。

利用块状面边界点，并使用迭代最近点算法来确定块、面边界点与组织学图像之间的刚性变换。随机边界点。然后将上一步获得的组织学图像进行变换，以在三维可视化软件中创建组织学体积的可视化图像。

进入实验室界面，选择模块，加载杂项文件，添加“从2D文件生成3D”模块。然后从菜单中选择图像，添加“图像属性转换”模块。最后，从“模块—可视化—3D查看器”中添加一个3D视图模块。

双击“从2D文件合成3D”以加载图像，然后单击“创建3D”。通过双击“图像属性转换”来调整体素大小，并将体素大小设置为 0.018 0.018 0.01。双击“查看3D”以查看体数据。

最后，按照随附文档中的步骤，以5倍放大倍数查看图像堆栈。为了更清楚地表征IGFBP-7基因敲除小鼠的缺陷，按照本文所述方法对乳腺组织进行了三维重建。这些图展示了野生型和基因敲除型乳腺组织重建后的组织学体积。

请注意，右侧的突变腺体比左侧的野生型腺体更短且更窄，但其深度与野生型腺体相近，分别为1.06毫米和无效型腺体的1.02毫米。此外，可见左侧野生型腺体中由粉红色伊红染色指示的间质组织较少，而右侧的无效型腺体则似乎主要由间质组织构成。此处苏木精染色（用于识别有核细胞）显示，无效型腺体保持了其细胞密度，而野生型腺体则似乎主要包含腺体结构。

为了进一步研究，此处对淋巴结区域的高分辨率图像进行了比对。可见一些较大的结构，这些结构本应充满乳汁。相比之下，IGFBP-7基因敲除腺体中的结构发育较少且不完善。

此外，这些结构中充满了成纤维细胞样细胞。观看本视频后，您应能很好地掌握如何通过重建连续扫描切片来构建器官的三维重建图像。很好。现在，在尝试此操作时，重要的是要始终如一地为载玻片和扫描图像命名，因为两者的数量都会很多，而有序的组织是成功实施该操作的关键。

还可以进行其他方法，例如针对特定细胞和疾病标志物的免疫组织化学，以回答其他问题，例如，血管系统如何渗透肿瘤？