蛋白质 - 蛋白质相互作用的双分子荧光互补的烟草原生质体和叶片可视化

蛋白质复合物在体内的形成可以通过双分子荧光互补可视化。合作伙伴的互动融合，以荧光标记的互补部件和瞬时表达烟叶，导致后两种蛋白质的接近改组后的荧光信号。

以下实验的总体目标是监测在完整烟叶中表达的两种蛋白质的相互作用。这是通过设计适当的构建体，融合两个感兴趣的基因以分裂荧光蛋白并将这些构建体转化为农业细菌来实现的。作为第二步，将农用细菌培养物混合并注射到烟叶中，这导致蛋白质表达和重构的荧光信号。

如果蛋白质靠近，接下来，在显微镜下分析整个叶子或分离的原生质体。根据荧光显微镜检测到的发射荧光信号获得显示蛋白质蛋白质相互作用的结果。现有方法（如 cor 免疫沉淀或酵母与杂交）的这种技术的主要优点是可以在活植物细胞中直接监测蛋白质蛋白质相互作用。

这种方法可以帮助回答植物生物学领域的关键问题，例如在各种细胞区室中形成蛋白质复合物。要开始此过程，请培养用于转化烟叶的农业细菌。将 10 毫升含有适当抗生素的 LB 培养基与 50 微升含有目标质粒的 AG L 一种甘油原液培养物接种在无菌 50 毫升试管中。

在 28 摄氏度下孵育至少 24 小时，以 190 RPM 的速度摇动，直到第二天培养物达到 1.0 到 2.0 之间的 OD 600。将细菌以 3000 倍 G 离心 15 分钟。弃去上清液后，将沉淀悬浮在新鲜制备的渗透培养基中，并将悬浮液调节至 OD 600 为 1.0。

将农业细菌细胞在室温下避光孵育 2 小时，以浸润烟叶。从三周龄的烟草植株中选择几片较老的叶子。混合等体积。

每种携带目标构建体的农用细菌 3 毫升。将细胞悬液混合物填充到 5 毫升注射器中，无需针头，以将细胞悬液渗透到烟叶中。小心地将注射器压在叶子底部的几个地方，给植物浇水，让它们盖上盖子避光两天。

要从浸润的叶子中分离原生质体，首先，将叶子放入培养皿中，并加入一些新鲜制备的酶溶液。使用新的剃须刀片，将叶子切成大约 0.5 平方厘米大小的块。接下来，将带有酶溶液的叶块转移到真空中。

渗透瓶。真空渗透约 20 秒，直到气泡从叶子中冒出。非常小心地释放真空吸尘器。

90 分钟后，在室温下避光以 40 RPM 摇动培养瓶 90 分钟。以 90 RPM 振荡 1 分钟释放原生质体。通过纱布将溶液过滤到 15 毫升圆底离心管中。

用 2 mL FPCN 缓冲液覆盖原生质体溶液，并在室温下以 70 倍 G 的速度缓慢加速和减速离心 10 分钟。完整的原生质体将在酶溶液和 FPCN 之间的界面处积累，使用宽口 1 毫升移液器吸头将完整的原生质体转移到新鲜的离心管中。为了成功执行此程序，请始终使用白色孔头尖端，以防止完整的原生质体破裂。

用 W 5 缓冲液离心机以 100 倍 G 的速度填充试管 2 分钟，缓慢加速和减速。要沉淀原生质体，请小心去除上清液并重悬沉淀。在大约 200 微升的 W 5 缓冲液中，取决于原生质体的量。

为了准备用于激光扫描显微镜的原生质体样品，首先在显微镜载玻片上放置两条相距约 2 厘米的小密封剂条。将 20 微升原生质体溶液放在条带之间，并小心地将盖玻片放在顶部。密封剂条将防止原生质体被盖玻片压扁。

为了制备用于激光扫描显微镜的全叶样品，请从叶子上切下一厘米的碎片，然后将其放在显微镜载玻片上，叶子的底面朝上。加入大约 30 微升水。在上面放一个盖玻片，并在两面用胶带紧紧固定。

使用 MICCA 型 TCS SP five 的共聚焦激光扫描显微镜进行成像以进行放大。使用以甘油为成像介质的 63 倍星等物镜，使用 Leica 应用程序套件高级荧光软件进行评估。将 Argonne 激光器设置为 30%，将 488 纳米的激光功率设置为 18% 的强度要监控 515 纳米的信号，请将第一个 PMT 探测器发射带宽设置为 495 到 550 纳米。

监测叶绿素自发荧光。将第二个 PMT 探测器发射带宽设置为 650 到 705 纳米。要监测 M cherry 信号，请使用 HENI 5 61 激光器。

将激光强度设置为 18%，并将第三个 PMT 探测器发射带宽设置为 587 至 610 纳米。确保所有 PMT 探测器通道的照片都使用相同的增益设置拍摄。增益应介于 800 和 900 之间，以排除背景信号。

以 1024 x 1024 像素的这种格式、宽度和高度获取图像，扫描速度为 100 赫兹。对于 Z 层叠，每个层叠之间的最大距离为 0.5 微米。在本研究中，采用 BFC 方法监测胞质分子伴侣 HSP 90 与膜对接蛋白 TPR 7 和 to 64 的相互作用。

如该示意图所示，金星与位于内质网的 TPR 7 或位于叶绿体外膜中的 64 的胞质溶质部分偶联。Hs.P 90 是 N 末端与 SCFP 融合，使 talk 64 和 TPR 7 的 TPR 结构域相互作用。使用 HSP 90 C（末端），SCFP 单独在胞质溶胶中作为阴性对照表达，以验证 TPR 7 HS P 90 蛋白复合物的定位。TPR 7 和 HS P 90 与 ER 标记共转化。

对照，在完整的叶子中监测荧光。SCFP 单独与 TPR 7 和 ER 标志物一起表达。在显示的所有图像中，比例尺代表 10 微米。

左侧的面板显示了在 515 纳米处监测的绿色重构荧光。ER 标记显示为红色。在中间面板中，两个信号的叠加层显示在右侧面板中。

监测 TPR 7 的重组信号与 HS P 90 重叠，ER标志物呈黄色。相比之下，没有监测 TPR 7 和阴性对照作为 CFP 的信号。在下一个例子中，叶绿体蛋白毒素 64 与 HS P 90 作为对照共表达。

Tox 64 单独与 SCFP 共表达。和以前一样，在 515 纳米处监测绿色重构荧光。中间面板显示了在 480 纳米处监测的叶绿素自发荧光。

两个信号的红色叠加显示在右侧面板中。在共分泌毒素 64 和 HSP 90 的细胞中观察到重构荧光，但在细胞中未观察到。Coex 单独表达 tox 64 和 SCFP

由于毒株 64 和 HSP 90 的确切定位很难在整个叶子的显微图片中确定。从浸润的烟叶中分离原生质体用于荧光显微镜检查。和以前一样，在 515 纳米处监测重构荧光，在 480 纳米处监测叶绿素自发荧光，并创建叠加图像，如该叠加图像所示，到 64 和 HSP 90 可以检测为叶绿体周围的环形结构关闭。

观看本视频后，您应该对如何设计构建体、转化烟叶以及如何最好地可视化显示两种目标蛋白质相互作用的荧光信号有很好的了解。