利用双分子荧光互补技术在烟草原生质体和叶片中可视化蛋白质-蛋白质相互作用

以下实验的总体目标是监测在完整烟草叶片中表达的两种蛋白质之间的相互作用。该目标通过设计适当的载体实现，即将两个目的基因分别与分裂的荧光蛋白融合，并将这些载体转化至农杆菌中。第二步是将农杆菌培养物混合后注射到烟草叶片中，从而促使蛋白质表达并产生重建的荧光信号。

如果蛋白质相互靠近，则接下来在显微镜下分析完整的叶片或分离的原生质体。通过荧光显微镜检测所发出的荧光信号，获得表明蛋白质-蛋白质相互作用的结果。该技术相较于共免疫沉淀或酵母双杂交等现有方法的主要优势在于，蛋白质-蛋白质相互作用可在活体植物细胞中直接进行监测。

该方法有助于解答植物生物学领域中的关键问题，例如蛋白质复合物在不同细胞区室中的形成。开始此实验步骤时，需培养用于转化烟草叶片的农杆菌。在无菌的50毫升离心管中，将含有目的质粒的AG L1甘油菌种50微升接种至10毫升含有适当抗生素的LB培养基中。

在28摄氏度下培养至少24小时，以190转/分钟振荡，直至次日菌液在600 nm处的光密度（OD 600）达到1.0至2.0之间。将菌体在3000 × g条件下离心15分钟。弃去上清液后，将菌体沉淀重悬于新鲜配制的侵染培养基中，并将悬浮液的OD 600调整至1.0。

将农杆菌细胞在室温避光条件下于摇床中振荡培养两小时，以浸润烟草叶片。从三周大的烟草植株上选取数片较老的叶片。混合等体积的溶液。

取每种携带目标重组质粒的农杆菌各3毫升。用5毫升无针注射器吸取细胞悬浮液混合物，将悬浮液注入烟草叶片中。在叶片底面多个位置小心按压注射器，然后给植物浇水，并用遮盖物覆盖，避免光照，静置两天。

为了从浸润的叶片中分离原生质体，首先将叶片放入培养皿中，并加入一些新配制的酶解液。使用新的剃须刀片将叶片切成约 0.5 平方厘米大小的片状。接着，将带有酶解液的叶片碎片转移至真空环境中。

浸润烧瓶。抽真空浸润约20秒，直至叶片中有气泡冒出。非常小心地释放真空。

90分钟后，在室温避光条件下以40 RPM振荡锥形瓶90分钟。然后以90 RPM振荡1分钟释放原生质体。将溶液经纱布过滤至15毫升圆底离心管中。

在原生质体溶液上覆盖两毫升 FPCN 缓冲液，在室温下以 70 × g 离心 10 分钟，加速度和减速度均设置为缓慢。完整的原生质体会聚集在酶溶液与 FPCN 的界面处，使用宽孔径的一毫升移液器吸头将完整的原生质体转移至新的离心管中。为确保本实验步骤成功，务必使用白色孔径吸头，以防止完整原生质体破裂。

用W5缓冲液重悬原生质体，于100 × g条件下离心2分钟，加速度和减速度均设为慢速。为沉淀原生质体，请小心移除上清液，并根据原生质体的量，用约200 µL的W5缓冲液重悬沉淀。

为进行激光扫描显微镜观察，首先在载玻片上相距约两厘米处各放置一条宽约两厘米的封片胶，形成两条细小的胶条。将20微升原生质体溶液置于两条胶条之间，然后小心地盖上盖玻片。封片胶条可防止盖玻片压碎原生质体。

为进行激光扫描显微镜观察，取一片长约一厘米的叶片，将其底面朝上放置在载玻片上。加入约30 µL水，盖上盖玻片，并在两侧用透明胶带将其牢固固定。

使用 MICCA 型 TCS SP5 共聚焦激光扫描显微镜进行成像以实现放大。选用 63 倍油镜，以甘油作为成像介质，使用 Leica 应用套件高级荧光软件进行图像分析。将氩离子激光器设置为 30%，在 488 纳米波长下的激光功率设置为 18% 的强度，以监测 515 纳米处的信号；将第一个 PMT 检测器的发射波长带宽设置为 495 至 550 纳米。

为了监测叶绿素自发荧光，将第二个PMT检测器的发射波长范围设置为650至705纳米。为了监测M cherry信号，使用HENI 5 61激光器。

将激光强度设置为18%，第三个PMT检测器的发射波长范围设置为587至610纳米。确保所有PMT检测器通道的图像均在相同的增益设置下采集，增益值应介于800至900之间，以排除背景信号。

以1024 × 1024像素的尺寸和100赫兹的扫描速度获取此格式的图像。对于Z轴层扫，每层之间的最大间距为0.5微米。在本研究中，采用BFC方法监测细胞质分子伴侣HSP 90与膜锚定蛋白TPR seven及TPR 64之间的相互作用。

如本示意图所示，Venus 蛋白连接至定位于内质网的 TPR7 的胞质部分，或连接至定位于叶绿体外膜的 TPR64。Hs.P90 的 N 末端与 SCFP 融合，以促进 TPR64 和 TPR7 的 TPR 结构域与 HSP90 的 C 末端相互作用。单独表达的 SCFP 在胞质中作为阴性对照，用于验证 TPR7 与 HSP90 蛋白复合物的定位。TPR7 和 HSP90 与内质网标记蛋白共转化。

以完整叶片中的荧光作为对照进行监测。单独表达SCFP，并与TPR seven及内质网标记物共同表达。在所有所示图像中，比例尺代表10微米。

左侧图显示在515纳米处监测到的绿色荧光重建结果，内质网标记物呈红色。中间图显示两种信号的叠加，右侧图也显示叠加结果。

观察到TPR7与HSP90共表达的信号与内质网标记物重叠，呈现黄色。相比之下，TPR7与阴性对照CFP共表达时未检测到信号。在下一个示例中，叶绿体蛋白TOX64与HSP90共同表达作为对照。

将 Tox 64 与 SCFP 单独共表达。同前，于 515 纳米处监测重建的绿色荧光。中间图显示在 480 纳米处监测的叶绿素自发荧光。

右侧图中显示了两种信号的红色叠加。在共表达 tox 64 和 HSP 90 的细胞中观察到重建的荧光，但在仅共表达 tox 64 和 SCFP 的细胞中未观察到荧光。

由于在整片叶片的显微图像中难以准确确定tox 64和HSP 90的定位，因此从侵染的烟草叶片中分离原生质体用于荧光显微镜观察。与之前相同，在515纳米处监测重组荧光，在480纳米处监测叶绿素自发荧光，并生成叠加图像。如本叠加图像所示，tox 64和HSP 90可被检测为环绕叶绿体的环状结构。

观看本视频后，您应能充分理解如何设计表达载体、转化烟草叶片，以及如何最佳地观察荧光信号，以展示您所关注的两种目标蛋白之间的相互作用。