Name: 在斑马鱼胚胎氧化应激分析 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-07-07T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 5 s
Description: 学习在活体斑马鱼胚胎中检测氧化应激的方法，利用共聚焦显微镜和细胞荧光分析技术对活性氧进行定性与定量评估。该技术可在单细胞和组织水平精确测量ROS水平，为发育生物学研究提供可靠的活体分析工具。

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马西莫·桑托罗实验室获得了HFSP、玛丽·居里行动、特雷森基金会和AIRC的支持。感谢达夫内·盖斯和埃米利亚诺·帕尼耶里对稿件的审阅。

1. 仪器和工作溶液的准备
<ol>
	<li>制备鱼水溶液。通过将 2 g 海盐“Instant Ocean”溶解于 50 ml 蒸馏水中配制储备液。取 1.5 ml 鱼水储备液加入 1 L 蒸馏水中，制备即用型鱼水（终浓度为 60 µg/ml 海盐）。使用前对即用型鱼水进行高压灭菌。该溶液用作斑马鱼胚胎培养基。</li>
	<li>制备用于胚胎固定的甲基纤维素。将 1.5 g 甲基纤维素溶解于 50 ml 无菌鱼水中。使用磁力搅拌器促进溶解，粉末完全溶解可能需要数小时。检查溶液澄清度后分装至小管中。可在 -20 °C 保存数月，使用时解冻分装样品。使用前以 950 × g 离心甲基纤维素 5 分钟。避免分装样品反复冻融。</li>
	<li>通过将 200 mg 三卡因溶解于 100 ml 水中并用 1 M Tris-HCl（pH 9）调节 pH 至 7.0，配制 50 ml 三卡因/乙基-3-氨基苯甲酸甲磺酸盐（储备液）。该储备液于 4 °C 保存，不得超过 30 天。警告：三卡因具有毒性，请按照适当的处理规范操作。</li>
	<li>在斑马鱼胚胎中诱导氧化应激
	<ol>
		<li>制备用于一般性氧化应激诱导的氧化剂溶液：通过将 H2O2 储备液（过氧化氢；100 mM）加入鱼水中，配制 50 ml 氧化剂溶液。H2O2 的终浓度使用范围为 2 mM 至 100 μM。该溶液需在使用前短时间内配制。该氧化剂溶液可用于整体染色 ROS 检测和单细胞 ROS 检测方法。请勿储存该溶液。警告：H2O2 具有危险性，吸入或吞咽有害。与可燃物接触可能引发火灾。应在通风橱中操作，并穿戴适当的个人防护装备。</li>
		<li>制备用于线粒体来源氧化应激诱导的氧化剂溶液：将 3.9 mg 鱼藤酮溶解于 2 ml 二甲基亚砜（DMSO）中，配制 5 mM 的氧化剂储备液。将该溶液避光保存于室温。
		<ol>
			<li>将鱼藤酮储备液溶于 10 ml 鱼水中，制成即用溶液。鱼藤酮使用浓度为 5–50 μM。请勿使用高于 100 μM 的浓度。在适当浓度下，该氧化剂溶液可用于整体染色 ROS 检测和单细胞 ROS 检测方法。警告：鱼藤酮具有毒性和危害性，请根据相应的预防措施进行操作。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>通过基因敲低诱导氧化应激：采用吗啉代寡核苷酸显微注射法敲低斑马鱼胚胎中的 nrf2a 基因表达，方法参照 Timme-Laragy A. et al.，201238 的报道。</li>
		<li>在组织损伤后诱导氧化应激：参照 Niethammer et al.，200939 的方法，在 72 hpf 斑马鱼胚胎尾鳍处制造伤口边缘。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>为单细胞 ROS 检测方法配制 5 ml ROS 检测试剂溶液：
	<ol>
		<li>用于一般性 ROS 检测的溶液：将通用的 ROS 敏感性分子探针溶解于 HBSS（Hanks 平衡盐溶液）中，配制工作液（浓度范围：2.5–10 μM）。该溶液需在使用前短时间内配制。</li>
		<li>用于特异性检测线粒体诱导 ROS 的溶液：使用前短时间内，将线粒体 ROS 敏感性探针用 DMSO 溶解，配制 5 mM 储备液。再将该储备液溶解于 HBSS 中，配制工作液（浓度范围：2.5–10 μM）。 
		注意：避免 ROS 检测试剂工作液及其相应储备液暴露于光和氧气。使用铝箔包裹试管避光。请勿储存或重复使用已溶解于 HBSS 中的探针。储备液可在 -20 °C 保存一个月。 
		警告：请在通风橱中按照适当规范操作分子探针和 DMSO。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>为整体染色 ROS 检测方法配制 5 ml ROS 检测试剂溶液：将通用的 ROS 敏感性分子探针储备液（以 DMSO 稳定保存）溶解于 HBSS 中，配制工作液（浓度范围：2.5–5 μM）。避免光照和氧气暴露。用铝箔包裹试管避光。该溶液需在使用前配制。请勿储存或重复使用该溶液。警告：请在通风橱中按照适当规范操作分子探针。</li>
	<li>通过将 10 ml 胎牛血清加入 15 ml 1× PBS 中，配制 25 ml 终止液。保持溶液无菌。该溶液于 4 °C 保存。该溶液仅用于单细胞 ROS 检测方法。</li>
	<li>将斑马鱼气浴培养箱温度设定为 28 °C。</li>
	<li>为单细胞 ROS 检测方法将离心机温度设定为 4 °C。</li>
</ol>
2. 成年鱼类的交配及斑马鱼胚胎的筛选
<ol>
	<li>根据标准方案设置成年斑马鱼配对交配40。根据具体实验需求选择合适的转基因品系。</li>
	<li>收集卵子并将其放入含有鱼水/胚胎培养基的90 mm培养皿中。将卵子置于28 °C下培养，直至胚胎发育至所需发育阶段（例如，48 hpf、72 hpf；hpf：受精后小时数）。</li>
	<li>筛选正在发育的胚胎。剔除所有未受精的卵子或发育不良的胚胎。</li>
	<li>通过在50 ml鱼水中加入1 ml三卡因（储备液）对胚胎进行麻醉。</li>
	<li>在体视显微镜下挑选Tg荧光胚胎。</li>
</ol>
3. 用氧化剂处理胚胎
<ol>
	<li>每种不同条件下使用至少30个48至72小时后受精（hpf）的胚胎。用新鲜的鱼水清洗胚胎两次，以去除三卡因（tricaine）。</li>
	<li>将具有荧光的胚胎分至三个培养皿中。每个培养皿中放置的胚胎数量不超过30个。</li>
	<li>移除洗涤液，并加入10 ml氧化剂溶液，或加入10 ml鱼水作为对照溶液。</li>
	<li>在28 °C下孵育胚胎10分钟至1小时。孵育时间取决于在特定组织中拟诱导的氧化应激水平。由于受氧化应激影响的细胞会逐渐发生细胞死亡，因此较短的孵育时间更佳。</li>
	<li>将胚胎转移至含有HBSS的新培养皿中，并通过轻轻旋转液体清洗胚胎。HBSS需预先在28 °C下温育。</li>
</ol>
4. 整体组织 ROS 检测方法
<ol>
	<li>在氧化剂处理后收集胚胎，每小管放置不超过10个胚胎。尽可能用HBSS冲洗，并用铝箔包裹试管以避光。</li>
	<li>向每根试管中加入1 ml ROS检测溶液。</li>
	<li>在28 °C避光条件下孵育胚胎15分钟，避免光照暴露。</li>
	<li>在孵育期间，准备用于整体胚胎分析的载玻片。在“凹面”载玻片上加入300 μl甲基纤维素，并用移液枪头在玻片表面将其铺匀。释放甲基纤维素时应避免产生气泡。</li>
	<li>孵育结束后，立即移除ROS检测溶液，并用2 ml HBSS洗涤两次。通过反复倒置试管来洗涤胚胎，切勿使用移液器吹打或涡旋震荡。</li>
	<li>用玻璃巴斯德移液管将胚胎吸起，使胚胎靠近移液管口，然后缓慢将其排入甲基纤维素中。使用细尼龙线适当调整胚胎的方向。</li>
	<li>比较对照组胚胎与处理组胚胎的荧光强度。或者，固定荧光体视显微镜或共聚焦显微镜的参数，确保所有胚胎均在相同的成像条件下进行观察。</li>
</ol>
5. 单细胞活性氧检测方法
<ol>
	<li>从步骤 3.5 开始。每种条件下至少需要准备 35 个胚胎。</li>
	<li>将胚胎转移至新的培养皿中。尽可能吸除鱼水，加入10 ml预冷的1×PBS缓冲液和400 μl蛋白酶抑制剂混合液。使用镊子手动去除胚胎的绒毛膜，并用细针去除卵黄囊。注意：去除卵黄囊可确保后续FACS分析样品的纯净性；此步骤可根据所使用的FACS仪器情况决定是否省略。</li>
	<li>将去卵黄的胚胎转移至24孔板（每孔15个胚胎），并移除所有鱼水。</li>
	<li>每孔加入 300 μl HBSS、30 μl 胶原酶 P 和 50 μl 胰蛋白酶-EDTA。</li>
	<li>使用紧密贴合的移液器吸头（1,000 μl）轻轻吹打混匀胚胎。</li>
	<li>在28 °C下孵育20分钟，每隔5分钟用移液器吹打混匀样品。</li>
	<li>在显微镜下观察匀浆液的一小部分，以检查组织是否充分破碎。通过移液操作促进形成单细胞悬液。胚胎孵育时间不得超过30分钟。</li>
	<li>加入200 μl终止液以终止反应，轻轻吹打混匀。</li>
	<li>将细胞悬液转移至预冷的底部密封管中。保持管子置于冰上，并避免光照。</li>
	<li>4 °C 条件下，250 × g 离心 5 分钟。</li>
	<li>移除上层相，并用预冷的HBSS轻轻吹打重悬细胞。</li>
	<li>计数细胞，确保所有样品中的细胞数量相同。细胞数量不得少于 2 x 106 细胞</li>
	<li>在 4 °C 条件下，以 250 × g 离心 5 分钟。</li>
	<li>吸除上清液，用1 ml 冰浴的含ROS敏感探针的HBSS重悬沉淀。</li>
	<li>将试管在室温下孵育3分钟&#160;在避光条件下孵育。根据氧化应激水平和探针的灵敏度调整孵育时间。</li>
	<li>将细胞转移至流式管中。在流式分析前，将流式管置于冰上并避免光照。</li>
	<li>使用荧光激活细胞分选仪（FACS）对细胞进行分选。根据Tg组织荧光设置相应的波长（例如，GFP）以及用于活性氧检测的分子探针的激发/发射光谱（例如，特异性线粒体活性氧敏感探针，广谱活性氧敏感探针）</li>
	<li>每种条件下，均应在同一实验批次中使用相同的流式细胞术（FACS）设置测量所有样本。以不同生物学重复的均值计算荧光细胞百分比。每种条件至少分析两个重复样本。</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

关键步骤
此处所述的斑马鱼胚胎氧化应激检测程序包含两种不同方法。整体 ROS 检测法主要用于 ROS 的定性分析，而单细胞 ROS 检测法则可实现更特异的定量测量。图1。这两种方法均可快速、简便地评估 体内 斑马鱼胚胎中的活性氧检测。然而，这两种方法均包含一些关键步骤。
与方法一相关的关键步骤
第一种全胚胎ROS检测方法具有显著优势，可轻松检测活体胚胎所有组织中的氧化应激（图2）。然而，有三个关键因素必须加以考虑，因其可能影响检测结果：1）探针对胚胎组织的通透性，2）探针的毒性，以及3）探针对低浓度活性氧的敏感性。
第一个方面特别与该方法的体内应用相关42。活性氧敏感探针的“细胞通透性”是实现本检测的关键特性。理想情况下，所有水溶性化学物质均适合用于活体斑马鱼胚胎的递送；然而，大多数用于氧化应激检测的试...

氧化应激特指由于细胞氧化还原状态失衡所导致的一种生理状况。细胞内持续发生的复杂氧化还原反应决定了细胞的氧化还原状态。氧化还原反应包括所有生物分子原子间发生电子转移的化学反应，从而导致分子的还原与氧化即 氧化还原反应）。这些反应由电子活化的物种催化（即 促氧化物质）具有极端的结构不稳定性，其未配对电子可自发活化，并与邻近的生物分子发生电子交换。这些异常反应会导致DNA损伤、蛋白质羧化和脂质氧化，最终引发细胞死亡1. 氧化应激水平的升高与衰老及多种病理状态的进展相关联2氧化应激已被报道为糖尿病和心血管疾病中血管改变的原因。3,4它还在阿尔茨海默病和帕金森病的神经元退行性变中发挥关键作用。5此外，氧化应激已被证实是调控癌症进展和转移事件的关键因素6,7此外，炎症和免疫反应可能引发并进一步加剧氧化应激。8.
在活细胞中，促氧化性物质来源于氧（ROS，活性氧物种）或氮（RNS，活性氮物种）。ROS 包括羟基自由基（.OH）、超氧阴离子（O2-）和过氧化氢（H2O2）。主要的 RNS 是一氧化氮（NO.）。一系列次级活性物质可通过 ROS 与 RNS 之间的自发反应或与游离金属离子的相互作用而生成9。例如，超氧阴离子与一氧化氮反应生成过氧亚硝酸根（ONOO-），而 H2O2 与 Fe2+ 反应则产生羟基自由基。由于 ROS 和 RNS 能够与多种生物分子发生反应，因此被认为对维持生理性的氧化还原状态构成严重威胁10。为维持氧化还原平衡，细胞配备了一系列解毒性的抗氧化分子和酶。超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶、谷胱甘肽过氧化物酶和过氧还原酶构成了主要的抗氧化酶系统，可保护细胞免受包括 H2O2 、.OH 和 ONOO- 在内的促氧化性物质的损害11。此外，维生素 C 和 E、多酚类化合物以及辅酶 Q10（CoQ10）等抗氧化分子在清除 ROS 及其有害衍生物方面也具有关键作用12,13。然而，当 ROS 和 RNS 过度生成，或抗氧化系统功能失调时，细胞的氧化还原状态将向氧化应激偏移14。
除了其负面含义外，活性氧（ROS）在不同来源的细胞中还可发挥多种生理作用。细胞通常会产生ROS作为信号分子，介导宿主防御和伤口修复等正常的生物学事件15-17。细胞内酶（如NOX（NADPH氧化酶）和XO（黄嘌呤氧化酶））在信号因子、生长因子以及细胞内钙离子水平波动的刺激下，通常会产生活性物质18,19。已有报道表明，ROS可差异性地调节一些重要核因子（如p53）或细胞组分（如ATM激酶）的活性，后者是DNA损伤应答的主要调控因子20。类似地，ROS通过介导蛋白酪氨酸磷酸酶（PTPs）的氧化与失活，显著影响细胞信号传导，而PTPs已被确认为信号转导的关键调控分子21。此外，基于蛋白质组学的方法表明，活性氮物种（RNS）也参与特异性蛋白质修饰及分子信号通路的改变。RNS可与半胱氨酸巯基反应，将其修饰为S-亚硝基硫醇（SNO），并触发与炎症性疾病和自身免疫性疾病等病理状态相关的分子通路22,23。
由于细胞培养实验仅能部分重现作用于 体内在动物模型中开展氧化还原研究具有重要意义24,25为了实现这一目标，斑马鱼被认为是一种适合研究氧化应激动态的脊椎动物模型26斑马鱼是一种新型模式生物系统，具有多种优势，可用于研究脊椎动物发育与疾病过程中的细胞和遗传事件。每周均可获得大量胚胎，满足实验需求。此外，斑马鱼胚胎具有卓越的光学通透性及较小的体型，使得在完整生物体内实现单细胞成像与动态追踪成为可能。27在过去的十年中，研究人员构建了大量斑马鱼突变体，用于模拟人类病理状况，如癌症和遗传性疾病。28-31最重要的是，已培育出大量转基因品系，为遗传学和生物学操作提供了广泛的机会32例如，转基因组织特异性斑马鱼品系经常被用于 体内 研究。这些品系在选定启动子的调控下表达荧光蛋白，能够用于识别单个细胞 体内以及它们所组成的解剖结构。
已有若干毒理学研究采用斑马鱼来评估化学物质对氧化还原稳态的体内效应，表明这种脊椎动物适用于药物发现和氧化应激研究领域的动物模型33-35。尽管已有部分荧光探针被用于监测斑马鱼幼体中的氧化应激36,37，但目前尚无成熟的检测与定量方法可用于测定斑马鱼组织及活细胞中氧化应激的水平。本文介绍一种用于在斑马鱼胚胎活细胞中进行体内氧化应激定量的实验方案。该方法结合成像技术、FACS分选、荧光探针以及促氧化条件，建立了一种简便的检测与定量斑马鱼胚胎及组织中活性氧物质的实验体系。

<table><tbody><tr><td>过氧化氢溶液</td><td>SIGMA</td><td>516813</td><td>切勿储存稀释液</td></tr><tr><td>1× Hank's 平衡盐溶液</td><td>GIBCO</td><td>14025</td><td></td></tr><tr><td>甲基纤维素</td><td>SIGMA</td><td>M0387</td><td></td></tr><tr><td>Instant Ocean 水族馆海盐混合物</td><td>INSTANT OCEAN</td><td>SS15-10</td><td></td></tr><tr><td>三卡因</td><td>SIGMA</td><td>A5040</td><td></td></tr><tr><td>通用活性氧敏感探针：CellROX Deep Red 试剂</td><td>INVITROGEN</td><td>C10422</td><td></td></tr><tr><td>线粒体特异性活性氧敏感探针：MitoSOX&amp;nbsp;</td><td>INVITROGEN</td><td>M36008</td><td>用 13 &amp;mu;l DMSO 溶解一支试剂瓶</td></tr><tr><td>氢溴乙啶</td><td>INVITROGEN</td><td>D23107</td><td></td></tr><tr><td>鱼藤酮</td><td>SIGMA</td><td>R8875</td><td>用 DMSO 配制 5 mM 储存液。&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>二甲基亚砜</td><td>SIGMA</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>VAS2870；3-苄基-7-(2-苯并噁唑基)硫代-1,2,3-三唑[4,5-d]嘧啶</td><td>EnzoLifeScience</td><td>BML-EI395</td><td>将粉末溶于 DMSO；在鱼水中稀释</td></tr><tr><td>碘化丙啶&amp;nbsp;</td><td>Molecular probes&lt;br /&gt;(Life Technologies)</td><td>P3566</td><td></td></tr><tr><td>7-氨基放线菌素 D (7-AAD)&amp;nbsp;</td><td>Molecular probes&lt;br /&gt;(Life Technologies)</td><td>A1310</td><td></td></tr><tr><td>Nrf2a Morpholino</td><td>GeneTools</td><td>5'-CATTTCAATCTCCAT&lt;br /&gt;CATGTCTCAG-3'</td><td>参考文献：Timme-LaLaragy &lt;em&gt;et al.&lt;/em&gt;; 2012 (PMID: 22174413)；Kobayashi &lt;em&gt;et al.&lt;/em&gt;; 2002 (PMID:12167159)</td></tr><tr><td>胶原酶 P</td><td>ROCHE</td><td>11213857001</td><td>将粉末以 100 mg/ml 浓度溶于无菌 HBSS 中。分装后于 -20 &amp;deg;C 保存</td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液 (PBS)</td><td>GIBCO</td><td>10010-056</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清&amp;nbsp;</td><td>GIBCO</td><td>10082-147</td><td></td></tr><tr><td>完全蛋白酶抑制剂混合片剂</td><td>ROCHE</td><td></td><td>将一片药片溶于 1 ml 水中</td></tr><tr><td>0.5% 胰蛋白酶-EDTA (10x)，无酚红</td><td>GIBCO</td><td>15400-054</td><td>使用前配制 1x 工作液</td></tr><tr><td>显微镜&amp;nbsp;</td><td>ZEISS</td><td></td><td></td></tr><tr><td>带荧光照明的体视显微镜</td><td>Nikon</td><td>AZ100</td><td></td></tr><tr><td>相机</td><td>ZEISS</td><td>AxioCamMRm</td><td></td></tr><tr><td>荧光图像采集软件</td><td>ZEISS</td><td>ZEN 2011</td><td></td></tr><tr><td>荧光激活细胞分选仪</td><td>BD FACSCalibur</td><td></td><td></td></tr><tr><td>离心机&amp;nbsp;</td><td>Eppendorf</td><td>5417R</td><td></td></tr><tr><td>FACS 管&amp;nbsp;</td><td>BD</td><td>342065</td><td></td></tr><tr><td>多孔板&amp;nbsp;</td><td>BD Falcon</td><td>353047</td><td></td></tr><tr><td>90 mm 无菌未处理培养皿</td><td>VWR</td><td>391-1915</td><td></td></tr><tr><td>共聚焦显微镜</td><td>Leica</td><td>Leica SP5</td><td></td></tr></tbody></table>

斑马鱼胚胎中氧化应激的分析

Analysis of Oxidative Stress in Zebrafish Embryos

活性氧（ROS）水平升高可能导致细胞氧化还原状态发生改变，进而引发氧化应激状态。这种情况会引起分子的氧化（如脂质、DNA、蛋白质），并导致细胞死亡。氧化应激还会影响多种病理过程的发展，例如糖尿病、视网膜病变、神经退行性疾病和癌症。因此，开发用于研究氧化应激的工具非常重要，不仅要在单细胞水平上，还应在完整生物体的背景下进行研究。本文中，我们认为斑马鱼胚胎是一个有价值的in vivo系统，可用于开展此类研究，并提供一种在in vivo条件下测量氧化应激的实验方案。利用荧光ROS探针和转基因荧光斑马鱼品系，我们建立了两种不同的in vivo氧化应激检测方法：i）“全胚胎ROS检测法”，用于氧化应激的定性测量；ii）“单细胞&#160;ROS检测法”，用于氧化应激的定量测量。本文中，我们通过氧化剂处理以及生理或遗传学方法诱导组织中氧化应激水平升高，以验证这些方法的有效性。该方案适用于正向遗传筛选，并将有助于阐明在神经系统疾病和癌症等与氧化应激相关病理的动物模型中，ROS的因果关系。

通过应用此处所述的方法，我们可以轻松检测和测量斑马鱼胚胎组织中的氧化应激（以及活性氧水平）。在成年斑马鱼交配后，收集卵子并使其在28 °C条件下发育至受精后72小时（hpf）。为了诱导氧化应激，我们提出两种不同的方法：1）用强促氧化剂处理胚胎；或2）在组织损伤后促进活性氧（ROS）的生成。
在第一种方法中，我们根据具体需求使用了两种不同的试剂：过氧化氢（H2O2）作为通用的细胞活性氧（ROS）生成剂，以及鱼藤酮作为特异性的线粒体活性氧诱导剂。鱼藤酮是电子传递链（ETC）复合体I的抑制剂，其功能失调可导致氧化应激41。
在第二种方法中，我们通过在斑马鱼胚胎的尾鳍处制造伤口来诱导活性氧的积累39. 或者，可通过显微注射吗啉代寡核苷酸敲低斑马鱼组织中的基因表达，以诱导氧化应激条件 Nrf2 抗氧化反应 通路 这是细胞抵御氧化应激细胞毒性的主要防御机制38.<...

本文报道了一种用于检测活体斑马鱼胚胎氧化应激的实验方案。该方法可实现对整个胚胎组织及单细胞群体中活性氧（ROS）的检测。本方案可同时完成定性与定量分析。

高水平的活性氧（ROS）可能导致细胞氧化还原状态发生改变，进而引发氧化应激状态。这种情况会引起……

以下实验的总体目标是对活体斑马鱼胚胎中的氧化应激进行定性和定量测量。通过向已制备的胚胎中添加氧化溶液以诱导氧化应激，或在胚胎尾鳍处制造伤口边缘来实现氧化应激建模。随后，采用单细胞方法或整体染色方法对胚胎进行处理，以检测氧化应激水平。接下来，将样品与活性氧检测探针共同孵育。结果可根据整体封片的共聚焦显微镜观察或单个细胞的细胞荧光定量分析，显示氧化应激程度和活性氧水平。该技术相较于现有的免疫荧光检测氧化应激标志物等方法的主要优势在于，能够在活体生物背景下实现直接检测，并在单个组织水平上进行定量分析。该方法有助于回答基础研究领域中的关键问题，例如探索病理状态下氧化应激的条件。初学者在操作过程中可能因意外的组织损伤而遇到困难，因为原始的敏感分子探针可能成为未预料的酸性来源。此外，氧化应激水平过高会导致细胞死亡，而过低则可能难以通过实践和实验检测到。这些问题仅会在制备用于诱导线粒体氧化应激的溶液时显现。该溶液由溶解在DMSO中的rotenone组成，应使用rotenone储备液配制，终浓度应在5至50 µM之间，绝不能超过100 µM，因为rotenone具有毒性和危害性。请注意标签上的各项预防措施。在制备用于孔洞 Mount Ross 检测的探针溶液时，应避免接触任何光线或氧气，且必须为单细胞 Ross 检测方法 freshly 制备。需配制含 FBS 的 PBS 终止液，并将其保存在 4 摄氏度环境中。其他准备工作包括将斑马鱼气浴培养箱设置为28摄氏度，并将单细胞方法所需的离心机预冷至4摄氏度。斑马鱼交配、胚胎收集及麻醉均按标准操作进行。采用标准方法，收集受精后48至72小时的目标胚胎。麻醉胚胎后，需将麻醉剂清洗两次，然后将胚胎分装至三个培养皿中，每皿不超过30个，用于单细胞原位检测。每种条件下需在多个培养皿中收集至少35个胚胎。接着，加入10毫升氧化溶液，或以阴性对照处理。加入10毫升水，然后在28°C下孵育胚胎10至60分钟。同时将HBSS预热至28°C，用于后续洗涤。孵育结束后，将胚胎转移至盛有温热HBSS的新培养皿中，并轻轻涡旋。然后进行整体染色或单细胞Ross检测。一种更具生理相关性的方法是采用NI Tomer及其团队描述的尾鳍损伤技术，在组织损伤后诱导应激反应。氧化剂处理后，将最多10个胚胎为一组转移至小管中。用 HBSS 大量冲洗，并用铝箔遮盖以避光。接着，向每根试管中加入 1 毫升原液检测溶液，在 28 摄氏度下孵育 15 分钟，孵育过程中保持避光。准备一张载玻片，用于同时放置对照组和实验组样本。在凹面载玻片上覆盖300微升甲基纤维素。挤出甲基纤维素时不要产生气泡。胚胎孵育后，迅速将试管中的溶液替换为2毫升HBSS，并反复倒置试管数次以洗涤胚胎。然后将胚胎吸入微量移液器的尖端，轻轻吹入经处理的载玻片中。使用细尼龙线调整胚胎的方向，随后用荧光或共聚焦扫描显微镜进行分析。务必在相同的设置下分析所有胚胎。将胚胎从 HBSS 清洗液转移至新的培养皿中，尽可能移除所有溶液。现在手动去除胚胎的包被。这一步骤对于将胚胎解离为单细胞至关重要。接下来，将胚胎转移至24孔板中，每孔放入15个胚胎。每个处理条件最好填充三孔。随后，吸除所有溶液，并加入300 µL HBSS、30 µL胶原酶P和50 µL胰蛋白酶EDTA。使用1毫升移液器吸头，用三通管吹打混匀胚胎。所有孔板制备完成后，将孔板置于28摄氏度条件下孵育至少20分钟，每隔5分钟吹打混匀一次，以确保充分匀浆。同时将一些微量离心管置于冰上，以便在组织准备好后收集样本。20 分钟时取样，在显微镜下检查组织是否已分散成单细胞悬液。若未达到，则继续孵育，总时间最长不超过 30 分钟。当组织完全消化后，加入 200 微升终止液以终止反应。使用1毫升移液枪头将此物与TRI混合。接着，将每个孔中的内容物转移至预冷的微量离心管中，并将这些管子置于冰上避光保存。然后在4摄氏度下以250 ×g离心5分钟。然后通过抽吸去除上清液。用预冷的HBSS轻轻重悬细胞沉淀，并检查悬液中至少含有200万个细胞。接着，将细胞重悬于1毫升的原始敏感探针溶液中。在室温避光条件下孵育约三分钟。根据实验情况调整孵育时间。随后，将细胞转移至避光的离心管中。进行传真分析以检测转基因标记。在分析过程中，检测荧光和罗斯探针荧光。为了标准化背景荧光，始终以对照样品为基准，将损失水平计算为倍数增加。采用 DAB 检测法检测伤口部位的过氧化氢积累。在氧化剂处理 20 分钟后，比较完整尾部与受伤尾部的信号。两种条件下均检测到非特异性信号。采用预处理胚胎以降低过氧化氢水平的相同实验。使用OX抑制剂VAs 28 70发现，检测到的信号确实依赖于Ross积累rot。还通过整体装片法检测了已知处理的胚胎。在高倍放大下可识别出解剖区域。通过传真进行的荧光计数检测Ross阳性细胞，用于单细胞Ross检测。该分析在排除死细胞的情况下进行。对照。未接受处理的细胞也进行了分析。通过比较这些结果，可轻松实现对Ross累积的定量。该检测方法在测试任意数量的实验操作方面表现出色。一旦掌握，若操作得当，该技术可在90分钟内完成。切记，使用分子探针可能具有极高危险性，且存在前驱风险。进行此操作时，必须始终佩戴手套。

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