Name: 心肌缺血再灌注损伤的通过左前降支结扎小鼠模型 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-04-10T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 7 s
Description: 学习左前降支结扎手术建立小鼠心肌缺血再灌注损伤模型。该方法通过精确结扎LAD动脉模拟心肌梗死，结合血清生物标志物与组织学分析评估损伤程度，为心血管疾病研究提供可靠的实验基础。

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本研究由美国国立卫生研究院下属的国家关节炎与肌肉骨骼和皮肤病研究所资助，项目编号为 R01-AR063084。本内容仅由作者负责，不一定代表美国国立卫生研究院的官方观点。

本动物实验方案已获得俄亥俄州立大学机构动物照护与使用委员会（IACUC）的批准，并符合其制定的指南和规定。当地IACUC制定的所有政策均符合美国国立卫生研究院实验室动物福利办公室发布的《动物实验指南》要求。
1. 麻醉与气管插管
<ol>
	<li>使用前对所有器械和外科用品进行高压灭菌。整个操作过程中佩戴无菌的一次性外科手套。全程维持无菌环境。&#160;建议使用无菌手术巾，但视频中未展示，以便更清晰地观察小鼠的解剖标志。</li>
	<li>将每只小鼠单独放入诱导室，以5%异氟烷和氧气（流速0.4 L/min）进行麻醉，直至翻正反射消失；随后通过连接麻醉装置的鼻罩管，以2%异氟烷和100%氧气（流速0.4 L/min）维持麻醉，直至气管插管完成。所使用的异氟烷麻醉机应具备适当的排气装置，并配备活性炭过滤器，以最大限度减少术者在操作过程中暴露于异氟烷蒸气。&#160;鼻罩在文中提及但未在视频中展示，以便观察对小鼠进行插管的操作过程。</li>
	<li>在远离手术平台的区域使用动物毛发剪剃除小鼠胸部毛发，以避免手术区域污染。</li>
	<li>将小鼠仰卧位固定于手术平台上，以便后续插管。一个简单的小型聚苯乙烯泡沫平台即可作为手术平台。用预先灭菌的手术巾覆盖平台，以提供无菌表面。在平台与手术巾之间放置加热垫，以维持小鼠在手术过程中的体温。</li>
	<li>用胶带将一段至少10 cm长的2-0丝线固定在平台上，然后将丝线绕过小鼠前上切牙打结。将鼻罩置于靠近平台边缘（距边缘2–3 cm）并正对小鼠鼻部的位置。将小鼠身体拉直，并用胶带将其尾巴固定在平台上。</li>
	<li>用胶带将四肢固定于身体两侧。注意前肢不可过度拉伸，以免影响呼吸。</li>
	<li>在进行颈部和胸部切口前，用聚维酮碘和酒精对已剃毛的手术区域进行消毒。</li>
	<li>将带小鼠的平台放置成头部朝向操作者。沿颈正中线做长约0.5 cm的皮肤切口。分离甲状腺两叶之间的峡部，暴露胸骨舌骨肌，在该肌下方可见气管。</li>
	<li>取出18号套管针的内针，使其可用作插管管。针尖部分可作为持针器，外管露出约1 cm的部分可作为气管插管。</li>
	<li>一手用弯头镊子夹住小鼠舌头并轻轻上抬，通过颈部皮肤切口观察气管。另一手缓慢插入插管管，直至管子进入气管内并被观察到。</li>
	<li>一旦插管进入气管，立即将另一手的弯头镊子移向插管，并迅速取出内针。若插管无法顺利进入气管，应立即将管子退出，以避免引起呼吸问题。当插管接近咽喉时，必须将管尖朝上，以防止误入食管而非气管。</li>
</ol>
2. 通气与固定
<ol>
	<li>使用动物呼吸机提供人工通气，以0.4 L/min的流速输送含2%异氟烷的氧气。采用改良的Y型连接器将气管插管与呼吸机相连。通过观察胸廓是否对称扩张来确认气管插管位置正确。</li>
	<li>设定潮气量为260 μl/次，通气频率为130次/分钟，可根据特定小鼠的体重酌情调整。</li>
	<li>移除尾部固定胶带，轻柔地将小鼠翻转至右侧卧位以进行后续手术。再次使用胶带将尾部和四肢固定于手术平台上。</li>
	<li>插入直肠探头以监测体温，并调节加热垫以维持体温在约37 ºC。</li>
	<li>用胶带将探头固定在平台上。在切口前，于切口部位皮下注射布比卡因以局部麻醉。</li>
</ol>
3. 开胸术
<ol>
	<li>在左侧胸骨边缘外约2 mm处，朝左前肢与身体连接部位的方向（约在肢与躯干连接处下方1-2 mm），做一个长约1 cm的斜切口。浅表胸静脉位于此区域附近，切口时应使切口的外侧端接近该静脉，但不得切入静脉内。</li>
	<li>切开胸肌以暴露下方的肋骨。此过程中应避免意外损伤血管。若发生出血，需使用棉签止血后，再进行下一步操作7。</li>
	<li>通过薄而半透明的胸壁观察肋骨及膨胀的肺组织。使用手术剪在第三肋间隙处做一6-8 mm的切口，以打开胸腔。该切口应距离胸骨边缘至少2 mm，以避开位于此处的胸廓内动脉。若损伤该动脉，将导致难以控制的大量出血。</li>
	<li>将预先灭菌的自制胸腔拉钩插入切口，轻轻向后牵拉，使切口张开至约8-10 mm宽，同时注意避免损伤肺组织。&#160;应使用针将拉钩固定于手术平台上。&#160;</li>
	<li>此时心脏应已可见，但部分心脏仍被肺组织覆盖。用弯头镊子轻轻夹起心包膜，将其拉开，并将组织向拉钩后方滑动。在此操作过程中，肺组织将随之抬起并远离心脏。</li>
</ol>
4. 定位左前降支
<ol>
	<li>通过解剖显微镜在心脏表面定位左前降支（LAD）。LAD 从心尖附近沿心脏壁中线向下延伸，穿过左心室。LAD 呈鲜红色，并有明显的搏动。此处的静脉有时会被误认为 LAD，但适当的照明有助于区分这两条血管。若照明过强，则可能难以分辨血管之间的颜色差异。</li>
	<li>使用直径约 1–2 mm 的无菌棉球碎片准备结扎 LAD。将棉球碎片置于左心房与左心室之间，可抬高左心房，有助于暴露 LAD 并明确其位置。若无法找到 LAD，可将碎片进一步推入，使左心房抬得更高，从而显露 LAD 起始处的主动脉。</li>
</ol>
5. 左前降支结扎
<ol>
	<li>结扎线的理想位置位于左心耳尖端下方约 2 mm 处。可利用肺动脉干作为标志，帮助识别左心耳。或者，也可将结扎位置视为距离左回旋支分叉处 1–2 mm 的点。使用弯头镊子在预定结扎点正下方的部位轻轻施加压力，这有助于更清晰地观察动脉，同时有助于固定心脏位置，便于打结。镊子每次施压时间不得超过 5 秒，避免过度压迫心脏而影响其泵血功能。</li>
	<li>在解剖显微镜下，使用锥形针将 6–0 丝线从 LAD 下方穿过。进针时需精准操作，若进针过深，针头可能进入左心室腔；若过浅，则可能损伤 LAD。若 LAD 受损，应取出针线并缝合 LAD 以控制出血；若出血无法控制，则建议对&#160;动物实施安乐死。</li>
	<li>将缝线打成一个松散的双结，留出一个直径为 2–3 mm 的环，将一段长 2–3 mm 的 PE-10 导管置于环内8。</li>
	<li>收紧缝线环，使其紧贴动脉和导管，再打一个额外的滑结固定环线，注意避免损伤心室壁。如需永久性结扎，可直接打结闭合 LAD9。通过观察左心室前壁是否在结扎后数秒内出现颜色变苍白，来确认 LAD 是否成功闭塞。</li>
	<li>移除牵开器，使用动脉夹夹紧皮肤以暂时关闭切口。缺血维持的时间取决于实验设计，通常为 20、30、45 或 60 分钟。在 LAD 动脉闭塞期间，小鼠应持续连接呼吸机。</li>
</ol>
6. 再灌注
<ol>
	<li>缺血结束后，移除无损伤血管夹，并插入胸腔牵开器以暴露结扎线。解开结扎线的结并移除PE-10导管。在15–20秒内观察左心室前壁恢复粉红色，以确认再灌注成功。</li>
	<li>若计划在再灌注后进行2%氯化三苯基四氮唑（TTC）和蓝色染色，则应保留缝线。若无需染色，可将缝线移除。</li>
	<li>再灌注时间取决于实验设计，通常为1小时至24小时。</li>
</ol>
7. 胸腔关闭与术后护理
<ol>
	<li>通过缝合切口关闭胸腔rd 用4-0丝线缝合肋间间隙。必须确保肺组织远离缝线，以免在缝合过程中被夹住。rd 和 4th 将肋骨进行缝合。在打结时，用持针器对胸部施加轻微压力，有助于减少胸腔内可能残留的空气。</li>
	<li>使用4-0丝线连续缝合所有肌层。使用尼龙线连续缝合皮肤，也可选择间断缝合方式关闭皮肤。</li>
	<li>缝合完成后，停止异氟烷的气流，同时继续供应氧气。当小鼠开始移动胡须或尾巴，并出现自主呼吸尝试时，将小鼠从呼吸机上移除，气管插管仍保留在气管内。</li>
	<li>仔细观察动物，直至小鼠恢复正常的呼吸模式，然后拔除气管插管。应缓慢拔出导管，以避免口腔分泌物被吸入。</li>
	<li>观察小鼠 3-5 分钟，确认无呼吸窘迫后，将其放回笼中。若术后观察到脱水迹象，可通过腹腔注射给予最多 0.5 ml 无菌生理盐水。</li>
	<li>术后镇痛时，应在手术前皮下注射阿片类镇痛药（布托啡诺，0.1 mg/kg）&#160;动物可自主行走后，每隔4-6小时追加给药一次，持续24小时。术后12小时检查动物有无痛苦迹象。采用可存活手术模拟心肌梗死时，需在术后恢复期间评估疼痛与痛苦程度。目前公认的最佳实践是在侵入性操作后的最初24小时内给予镇痛处理，并根据体重下降或疼痛体征等指征酌情追加给药。对于永久性结扎模型，应每日监测体重，以帮助评估动物恢复情况。</li>
	<li>布洛芬（Motrin）是一种具有抗炎、镇痛和解热作用的非甾体抗炎药（NSAID），或其他非甾体抗炎药，可在手术前2天至术后7天内以0.2 mg/ml的溶液形式加入动物饮水中给予&#160;丁丙诺啡&#160; 以管理任何额外的疼痛/不适。</li>
</ol>
8. 心肌梗死面积的测量
<ol>
	<li>在预定的再灌注时间结束时，对小鼠进行麻醉和插管。沿中线切开胸部皮肤至剑突。打开腹部及肋骨下方的膈肌，并从中锁骨线两侧切开。</li>
	<li>暴露心脏，然后在相同位置重新结扎左前降支（LAD）。插管至主动脉，以便将10%酞菁蓝缓慢直接注入主动脉，使心脏染色，以区分缺血区与非缺血区10。</li>
	<li>迅速取出心脏，并用30 mM KCl（氯化钾溶液）冲洗，以停止心脏跳动，便于更一致地切片。将心脏在-20 °C下冷冻至少4小时，然后使用心脏切片模具将心脏切成1 mm厚的切片11。</li>
	<li>将心脏切片在37 °C下用2% TTC孵育40分钟。梗死区域呈白色，而存活组织则染成红色。</li>
	<li>用10%甲醛固定染色后的切片过夜，以增强梗死区与正常组织之间的对比度。拍摄切片图像，并使用ImageJ软件计算风险区域（AAR）、非缺血区及梗死面积。</li>
</ol>
9. 心脏酶水平的测定
通过门静脉采血并经离心分离血清，测定小鼠血清中的心肌肌钙蛋白I（cTnI）水平。采用定量快速cTnI检测试剂盒测定血清cTnI水平12。

<ol><li>Abarbanell, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+of+myocardial+and+vascular+injury%5BTitle%5D)+AND+%22J+Surg+Res%22%5BJournal%5D)">Animal models of myocardial and vascular injury.</a> J Surg Res. 162, 239-249 (2010).</li>
<li>Gao, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+and+efficient+model+of+coronary+artery+ligation+and+myocardial+infarction+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">A novel and efficient model of coronary artery ligation and myocardial infarction in the mouse.</a> Circ Res. 107, 1445-1453 (2010).</li>
<li>Virag, J. A., Lust, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coronary+artery+ligation+and+intramyocardial+injection+in+a+murine+model+of+infarction%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Coronary artery ligation and intramyocardial injection in a murine model of infarction.</a> J Vis Exp. , (2011).</li>
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<li>Shao, Y., Redfors, B., Omerovic, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modified+technique+for+coronary+artery+ligation+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Modified technique for coronary artery ligation in mice.</a> J Vis Exp. , (2013).</li>
<li>Klocke, R., Tian, W., Kuhlmann, M. T., Nikol, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surgical+animal+models+of+heart+failure+related+to+coronary+heart+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovasc+Res%22%5BJournal%5D)">Surgical animal models of heart failure related to coronary heart disease.</a> Cardiovasc Res. 74, 29-38 (2007).</li>
<li>Nossuli, T. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+chronic+mouse+model+of+myocardial+ischemia-reperfusion%3A+essential+in+cytokine+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Heart+Circ+Physiol%22%5BJournal%5D)">A chronic mouse model of myocardial ischemia-reperfusion: essential in cytokine studies.</a> Am J Physiol Heart Circ Physiol. 278, 1049-1055 (2000).</li>
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<li>Borst, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+employed+for+induction+and+analysis+of+experimental+myocardial+infarction+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Physiol+Biochem%22%5BJournal%5D)">Methods employed for induction and analysis of experimental myocardial infarction in mice.</a> Cell Physiol Biochem. 28, 1-12 (2011).</li>
<li>Diepenhorst, G. M., van Gulik, T. M., Hack, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complement-mediated+ischemia-reperfusion+injury%3A+lessons+learned+from+animal+and+clinical+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Surg%22%5BJournal%5D)">Complement-mediated ischemia-reperfusion injury: lessons learned from animal and clinical studies.</a> Ann Surg. 249, 889-899 (2009).</li>
<li>Benavides-Vallve, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+strategies+for+echocardiographic+evaluation+of+left+ventricular+function+in+a+mouse+model+of+long-term+myocardial+infarction%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">New strategies for echocardiographic evaluation of left ventricular function in a mouse model of long-term myocardial infarction.</a> PLoS One. 7, 41691(2012).</li>
<li>Bamberg, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accuracy+of+dynamic+computed+tomography+adenosine+stress+myocardial+perfusion+imaging+in+estimating+myocardial+blood+flow+at+various+degrees+of+coronary+artery+stenosis+using+a+porcine+animal+model%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Radiol%22%5BJournal%5D)">Accuracy of dynamic computed tomography adenosine stress myocardial perfusion imaging in estimating myocardial blood flow at various degrees of coronary artery stenosis using a porcine animal model.</a> Invest Radiol. 47, 71-77 (2012).</li>
</ol>

诺亚·韦斯莱德博士是 TRIM-edicine, Inc. 的创始人兼首席科学官。

小鼠心肌缺血-再灌注模型是模拟临床急性或慢性心脏病的一种有效的心血管研究方法13,14。研究人员已投入大量努力，开发并优化可在多种动物体内诱发心肌缺血事件及再灌注损伤的外科手术方法。尽管不同动物模型系统各有优势，但小鼠因其独特的特性而在心肌缺血-再灌注（I/R）研究中受到广泛关注。其中一个主要原因是小鼠系统的遗传可操作性强。目前可获得的大量基因修饰小鼠品系，以及针对特定科学问题相对容易构建新模型的能力，在其他动物模型系统中均无与伦比。另一个推动小鼠在心血管研究中应用日益广泛的原因，是专为小鼠设计的手术器械和其他实验工具的可获得性不断提高。小鼠模型相对较低的成本也是其被广泛使用的重要因素。随着临床前研究对严谨性的要求不断提高，需要使用更多的动物进行实验，而在资源需求较少的情况下，更易于纳入足够数量的动物，从而使实验设计更为切实可行。尽管小鼠模型具有诸多优势，但也存在一些局限性，尤其是在考虑小鼠与人类心血管生理学之间的差异时。许多较大的动物模型（如犬和猪）在多数方面比小鼠更接近人类心血管生理特征。另一个缺点是小鼠体型较小，操作其微小心脏需要更高的外科手术技巧，特别是在定位前降支冠状动脉（LAD）并可重复地结扎以在左心室...

心肌梗死（MI）的动物模型在研究缺血性心脏病复杂病理生理学方面具有重要意义1。缺血-再灌注（I/R）损伤是MI期间心肌损伤的主要因素之一。通过冠状动脉闭塞引起的初始缺血性损伤，在MI患者中可通过血管成形术及时恢复灌注而得以减轻。尽管这一干预措施显著降低了急性MI导致的死亡人数，但血液重新流入缺血区域会引发I/R损伤，进而导致心肌细胞死亡。心肌质量的这种丧失会导致心输出量下降，并促进心力衰竭的发展。因此，研究I/R损伤引起心肌细胞死亡的机制是心血管研究中的一个重要方向。外科冠状动脉结扎是一种有效的实验技术，可用于在多种动物（包括大鼠、犬和猪）中建立MI模型。不同实验室已发表多种建立小鼠I/R损伤心脏模型的方法2,3。为了深入理解这些机制，我们必须拥有能够重现MI病理多个方面的可靠动物模型。此类模型的建立对于测试治疗MI及其相关I/R损伤的治疗策略也至关重要。
目前可用于在实验动物中模拟心肌梗死（MI）的外科技术大多涉及开胸手术，以暴露左前降支动脉（LAD），随后用结扎线将其阻断一定时间，从而诱发缺血事件。之后可解除结扎，使缺血区域重新灌注，进而形成缺血/再灌注（I/R）损伤。这些方法的一个主要局限在于，结扎线在左前降支上的位置往往难以精确重复，导致由此方法诱导的心肌梗死严重程度存在差异。大多数现有技术仅粗略描述了左前降支在心脏前壁的大致位置。由于左前降支的分支模式和走向在不同动物个体中可能存在变异，其位置并非固定不变，容易混淆4,5，从而在手术过程中引发潜在并发症6。结扎位置不当可能导致左心室梗死面积的不一致，甚至完全影响模型的特异性。本文介绍一种改良的小鼠心肌I/R及永久性结扎方法，可提高结扎线在左前降支上定位的准确性。通过采用特定的初始切口和内部解剖操作，并结合手法抬高心房，以更清晰地辨识左前降支及其从主动脉发出的位置。明确左前降支的位置及其起源点，可实现对该血管进行可重复的精确结扎。该心肌I/R与永久性结扎模型不仅能够减少术后梗死面积的变异，还可降低术中大出血的发生率。

<table><tbody><tr><td>PhysioSuite 配备 RightTemp 恒温加热系统</td><td>Kent Scientific Corp</td><td>PS-RT</td><td></td></tr><tr><td>光源</td><td>Zeiss</td><td>KL 1500 LCD</td><td></td></tr><tr><td>小鼠心脏切片基质</td><td>Zivic Miller</td><td>HSMS001-1</td><td></td></tr><tr><td>微孔板 - 底座、盖子 &amp;amp; Mat（6.0 × 10 × 0.75）</td><td>Fine Science Tools</td><td>6100A</td><td></td></tr><tr><td>2,3,5-三苯基氯化四氮唑</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T8877</td><td></td></tr><tr><td>布托啡诺（Buprenex 注射剂）</td><td>Reckitt Benkiser Healthcare</td><td>NDC 12496-0757-1</td><td></td></tr><tr><td>布比卡因</td><td>Hospira</td><td>NDC 0409-1163-01</td><td></td></tr><tr><td>异氟烷</td><td>Abbott</td><td>NDC 5260-04-05</td><td></td></tr><tr><td>聚维酮碘溶液&amp;nbsp;</td><td>普渡制药</td><td>25655-41-8</td><td></td></tr><tr><td>小鼠心肌肌钙蛋白T（cTnT）ELISA</td><td>加美亚生物医学公司</td><td>KT-58997</td><td></td></tr><tr><td>精细剪刀</td><td>精细科学工具</td><td>14040-10</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 镊子</td><td>Fine Science Tools</td><td>11251-30</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #3 镊子</td><td>Fine Science Tools</td><td>11231-30</td><td></td></tr><tr><td>卡斯特罗维霍显微持针器</td><td>Fine Science Tools</td><td>12060-01</td><td></td></tr><tr><td>细长针持</td><td>Fine Science Tools</td><td>12005-15</td><td></td></tr><tr><td>圆柄持针钳</td><td>Fine Science Tools</td><td>12075-12</td><td></td></tr><tr><td>Omano 三目体视显微镜</td><td>显微镜.com</td><td>OM99-V6</td><td></td></tr><tr><td>SB2 支架臂与通用臂</td><td>Microscope.com</td><td>V6</td><td></td></tr><tr><td>气管插管，0.5 mm，1/16 英寸 Y型</td><td>Kent Scientific Corp</td><td>RSP05T16</td><td></td></tr><tr><td>用于啮齿类动物和小型动物的麻醉系统</td><td>VetEquip, Inc</td><td>901807</td><td></td></tr><tr><td>4-0 丝线锥形缝合线</td><td>Sharpoint&amp;trade; 产品</td><td>DC-2515N</td><td></td></tr><tr><td>6-0 蚕丝锥形缝合线</td><td>Sharpoint&amp;trade; 产品</td><td>DC-2150N</td><td></td></tr></tbody></table>

通过左前降支动脉结扎建立心肌缺血-再灌注损伤的小鼠模型

A Murine Model of Myocardial Ischemia-reperfusion Injury through Ligation of the Left Anterior Descending Artery

急性或慢性心肌梗死（MI）是导致高发病率和高死亡率的心血管事件。要阐明MI期间的病理机制并开发有效的治疗策略，需要能够可重复地模拟临床发病情况，并反映与MI相关的病理生理变化的方法学。本文描述了一种在小鼠模型中诱导心肌梗死的手术方法，可用于短期缺血-再灌注（I/R）损伤以及永久性结扎研究。该方法的主要优势在于便于定位左前降支冠状动脉（LAD），从而能够准确结扎该动脉，以诱导小鼠心脏左心室发生缺血。对LAD动脉结扎位置的精确控制可提高梗死面积的可重复性，进而获得更可靠的研究结果。结扎操作的更高精度将改进模拟小鼠心肌梗死的标准手术方法，减少为获得具有统计学意义结果所需使用的实验动物数量，并加深我们对心肌梗死后心脏功能障碍机制的理解。此小鼠心肌梗死模型还可用于针对心肌梗死后心肌损伤治疗手段的临床前测试。

再灌注24小时后，通过酞菁蓝染料和氯化三苯基四氮唑（TTC）分析梗死面积和风险区（AAR），结扎左前降支（LAD）可通过观察缝合远端心肌组织变白以及前壁功能障碍来确认。再灌注可通过心肌组织恢复红色以及前壁运动部分恢复来验证。
梗死区域（白色）应可与风险区域（红色）及非风险区域（蓝色）相区分。应用酞菁蓝染料（图1A）可清晰显示左前降支（LAD）阻塞所致的心肌缺血范围，而未用蓝色染料染色的心脏仅能显示梗死区域（图1B）。梗死面积的大小取决于缺血持续时间。重要的是，假手术动物（接受除缺血与再灌注外的所有手术操作）的心肌肌钙蛋白I（cTnI）水平显著低于经历心肌梗死的动物（图2），表明假手术未引起明显的心脏病理改变，而缺血/再灌注损伤足以导致这一广泛使用的心肌梗死生物标志物水平升高。
<img alt="组织生长实验；培养皿样本；再生医学研究；显微镜分析。" ...

我们介绍一种外科手术方法，用于诱导实验性缺血/再灌注（I/R）损伤，以模拟小鼠模型中的心肌梗死（MI），该方法可更清晰地定位左前降支动脉（LAD）上的结扎位置，从而提高小鼠MI实验的可重复性。

急性或慢性心肌梗死（MI）是导致高发病率和高死亡率的心血管事件。建立其病理机制……

该实验的总体目标是通过阻断流向心脏部分区域的血液以产生缺血再灌注损伤。为模拟心肌梗死，首先进行开胸手术以暴露左前降支动脉（LAD）；随后在第二步中，用缝线结扎LAD以阻断血流。随后经过一段缺血期，移除缝线使动脉恢复血液再灌注。最后一步是关闭外科手术切口。最终，心肌梗死的严重程度可通过血清生物标志物水平分析以及心脏组织的组织学检查来评估。我们现有的模拟疟疾感染方法的主要优势在于，它易于找到发光二极管（LED）并将缝线置于正确位置。视觉演示之所以极为重要，是因为这些操作非常难以掌握，而文字描述无法充分传达这些操作的复杂性。该操作流程相对复杂，通常情况下，操作者缺乏相关经验，可能在识别LED或控制术中意外出血方面遇到困难。这种方法的一个意义在于，它可以用于测试治疗性化合物在治疗心肌梗死方面的有效性。由于这些方法必须使用动物模型才能有效测量，因此我首先将一段至少10厘米长的丝线缝合线固定在手术平台上。然后将缝合线绕过麻醉小鼠的前上门齿，拉紧小鼠，并将小鼠的尾巴固定在平台上，四肢固定在身体两侧。用聚维酮碘和酒精清洁剃毛的手术部位后，将平台放置好，使小鼠头部朝向实验台末端，然后在皮肤上做一条0.5厘米长的颈正中切口。分离甲状腺叶的峡部，暴露胸骨甲状肌，在该肌肉下方可见气管。接下来，取出18号套管针的内针，然后用一只手使用弯头镊子将小鼠舌头轻轻向上移动。通过颈部皮肤切口找到气管，然后用另一只手轻轻插入套管插管，直至在气管内看到插管。现在，将动物呼吸机设置为以每分钟0.4升的流速向氧气中输送2%异氟烷，通过改良的Y形连接器将插管与呼吸机相连，以对动物进行人工通气；通过观察胸部是否对称扩张可确认气管插管位置正确。取下尾部的胶带，轻柔地将小鼠翻转，使其呈右侧卧位，以备后续手术操作。然后再次用胶带将尾巴和腿部固定在平台上，以进行开胸手术。首先，在左侧胸骨边缘外约两毫米处，沿左前肢与躯干连接位置的方向，做一长约一厘米的斜切口，切口位置约为左前肢与躯干连接处下方一至两毫米处。浅胸静脉位于此区域附近，切口应以切口的外侧端接近该静脉但不切入静脉为宜。切开胸肌以暴露下方的肋骨，注意避免意外损伤血管。然后在第三肋间隙距胸骨边缘（即内乳动脉所在位置）至少2毫米处做一6至8毫米的切口，以打开胸腔，注意不要损伤该动脉。接着将自制的胸腔拉钩插入切口，轻轻牵拉使切口张开至8至10毫米宽。注意避开肺组织，此时心脏应部分显露于肺下方。使用弯头镊子轻轻提起心包膜，将其拉开，然后将组织滑至牵开器后方。现在使用解剖显微镜定位左前降支冠状动脉（LAD），该动脉从靠近心尖处沿心脏壁中线向下延伸，穿过左心室，在心脏表面呈现鲜红色并有明显的搏动。有时心静脉会被误认为是LAD，但适当的照明有助于区分这两条血管。如果光照过强，可能难以分辨血管之间的颜色差异。接下来，将一段1至2毫米的棉絮置于左心房与左心室之间。为抬高左心房并有助于暴露左前降支（LAD）及其位置，可利用肺动脉干固定心脏位置，并通过轻柔施加压力来简化结扎操作——压力应施加在预定结扎点稍下方约2毫米处，即略低于左心耳尖端的位置。然后使用锥形针将6-0丝线从LAD下方穿过，注意不要进入左心室腔或损伤LAD。用缝线打一个松散的双结，留出直径2至3毫米的环。随后将一段长2至3毫米的PE 10导管穿过该环，并收紧环结，使其固定在动脉和导管周围。通过再打一个滑结固定环线，注意不要损伤心室壁。通过观察左心室前壁是否出现苍白或变色来确认左前降支（LAD）是否阻塞，结扎后数秒内应出现该变化。然后移除牵开器，用动脉夹夹住皮肤使其闭合，以在缺血期间暂时关闭切口；之后移除动脉夹，并插入胸腔牵开器以暴露结扎线。然后解开结扎线，移除 PE 10 导管。15 至 20 秒后，通过观察左心室前壁是否恢复粉红色来确认再灌注是否成功。最后，关闭胸腔，用四针自体丝线缝合第三肋间空间的切口。打结时注意保持缝线远离肺组织，避免损伤。用持针器对胸部施加轻微压力，以尽量减少胸腔内可能残留的空气。接着，使用连续的4-0蚕丝线缝合胸部所有肌层，然后用尼龙线行另一道连续缝合关闭皮肤。缝合完成后，停止异氟烷的供给，同时继续输送氧气。然后密切观察动物，直至其恢复正常的呼吸模式后拔管，缓慢移除气管插管以避免口腔分泌物误吸。应用伊文思蓝染料可显示左前降支（LAD）发生闭塞的心脏区域，而未被蓝染的心肌则仅显示再灌注24小时后的梗死区域。白色区域应可与红色的危险区域以及无危险的区域区分开来。蓝色表示梗死面积的大小取决于缺血持续的时间。重要的是，假手术动物（接受除缺血和再灌注外的所有手术操作）的心肌肌钙蛋白I水平较低，而经历心肌梗死的动物该水平显著升高。这表明假手术不会引起明显的心脏病理改变，而缺血-再灌注损伤足以引起这一广泛使用的心肌梗死生物标志物的升高。观看本视频后，您应能充分理解如何在小鼠中进行存活型手术以模拟心肌梗死。在此手术操作之后，可采用其他方法，如心脏组织学染色，以确定梗死面积以及不同治疗方案的有效性。需要牢记的是，由于该操作属于侵入性手术，必须妥善管理动物的疼痛与应激反应，并依据当地、所在机构及国家的相关指南，通过给予镇痛药物来有效控制疼痛。进行本实验时需特别注意：实验设计应围绕您所要解决的具体科学问题展开。例如，如果需要造成严重的梗死，可能需要在手术期间延长缺血时间。

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关键词：心肌梗死，小鼠模型，左前降支冠状动脉，永久性结扎，开胸手术，心肌缺血，动物模型，心血管疾病

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