纳米谐波再生研究
2014年5月1日
提供用于体外标记的人类胚胎干细胞的二次谐波产生的纳米颗粒协议的细节。方法通过对多光子显微镜和其分化成心肌人类胚胎干细胞群的调查也被提出。
以下实验的总体目标是以 3D 实时和高空间分辨率对源自人胚胎干细胞的心脏串珠簇进行体外监测。这是通过首先培养和扩增胚胎干细胞直到它们形成 Embry 小体来实现的。接下来，将跳动的团簇解剖并电镀在聚四氟乙烯或 PTFE 多孔过滤器上，这使它们可以作为空气长期保持。
然后用谐波纳米颗粒标记液体培养物，然后跳动的簇，以进行实时多光子显微镜检查。获得的结果允许在微观尺度上分析心脏收缩的空间伸长和频率。所以这些纳米颗粒的主要优点是你可以使用任何波长，尤其是红外线，所以你可以更深入地进入组织，而且随着时间的推移，它们也非常稳定。
因此，我们可以在很长的时间范围内监控我们的长期流程。这种干细胞培养方法可以帮助在三个维度上回答心肌细胞功能收缩领域的关键问题。特别是心脏成熟和组织工程。
个体新疾病方法应注意，谐波纳米颗粒的标记程序只能用于多光子显微镜，不能转移到其他类型的成像系统。我们在 2005 年首次提出了使用谐波纳米粒子的想法。这些纳米颗粒在荧光染料和量子点方面具有优势。
事实上，它们的信号不会随着时间的推移而消失，可用于长时间监测显影样本。样品制备的视觉演示对于不同步骤的效率和可重复性至关重要，尤其是在进行药物检测时，也可以应用于不同的组织或疾病。组织建模。
根据文本方案培养和扩增人胚胎干细胞或 ESC 并与温热的胶原酶孵育 4 次 10 分钟后，将集落片段收集在 2 毫升新鲜分化的培养基或 DM 中，并以 115 倍重力离心 3 分钟。培养，以超低附着物悬浮的菌落片段。六孔板放置 4 天，让它们形成胚胎体或 ebs。
然后将新形成的 EBS 接种在 0.1% 明胶包被的 24 孔板上 15 至 30 天，直到出现跳动簇。去除 PBS 并使用 acutus，离心和复苏后将集落解离成单细胞，将细胞悬浮在 DM 培养基板中，每瓶 2 毫升。井室并在 37 摄氏度下孵育一天。
培养 2 至 4 周后，收集新形成的 EBS，并在 0.1% 明胶包被的 24 孔板上每孔板 3 板。识别跳动的心肌细胞簇，并使用细长、锐切的糊状移液器，手动解剖它们。每个插件放置四个 PTFE 过滤器，并将每个过滤器放入六孔板的孔中。
在每个过滤器中加入 1 毫升 DM 后，在每个 PTFE 过滤器上添加一个解剖的跳动簇。要标记簇，请将带有跳动簇的 PTFE 过滤器转移到 3.5 厘米的玻璃底培养皿中。以每毫升 50 微克的浓度加入 1 毫升二次谐波产生纳米颗粒，并在 37 摄氏度下孵育 30 分钟以进行非线性光学成像。
将标记的 HEB 或心脏跳动簇转移到成像室后，在白光照明下使用宽视野成像来识别分化的 EBS 或主动跳动簇中的感兴趣结构。执行快速的低分辨率三维扫描以重建心脏簇的整体形态，并在簇体积内选择一个图像平面，其中包含几个可见的二次谐波产生纳米颗粒进行实时监测。心脏簇收缩将显微镜光学扫描仪设置为最快模式，允许以多赫兹的频率采集二维图像。
在评估跳动活动之前，根据此处演示的文本协议使用 MATLAB 软件分析图像。对 PTFE 滤光片的非线性光学响应进行表征，以确保裸露的衬底对光子荧光非常弱，并且不能阻止测量相关的生物样品和分离的发射。在 epi 检测模式下，可以通过衬底成像来轻松获得二次谐波产生纳米颗粒。
在此图中，显示了标记心脏结构和 EBS 的二次谐波生成纳米颗粒叶片。红色、黄色和绿色对应于 NADH 自发荧光，而强烈的蓝色二次谐波点来自孤立的二次谐波产生纳米颗粒。请注意，与量子点或上转换纳米粒子相比，良好的光学对比度和相对稀疏的标记。
该图说明了标记为心脏跳动簇的二次谐波产生纳米颗粒的切片视图。如本影片所示，高速记录 3D 结构以监测第二个单元中的收缩模式。谐波产生纳米颗粒聚集以保持高采集速度以解析 NP 运动。
整体采集灵敏度不足以记录细胞自发荧光和二次谐波产生的二次谐波发射。对电影帧进行的纳米粒子图像分析表明，在同一心脏簇内，位移在几微米左右，并且对于普通二次谐波产生纳米粒子运动的进出频率是恒定的。掌握细胞制备技术后，如果作得当，押注集群解剖气液培养物和产羔可以在 24 到 36 小时内完成。
特别是使用这种技术时，必须避免露天接触以防止污染。按照此程序，可以应用其他方法，例如使用多个电极阵列进行电生理记录，以回答其他问题，例如将动作电位曲线与三维跳动频率相关联。我们基于谐波纳米粒子检测非线性信号的新技术可以进一步发展用于体内研究，感染用于成像的波长，从而更深入地渗透到组织中。
一种可能的发展可能是将干细胞衍生结构整合到再生医学应用中。
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概述
本文介绍了一种使用二次谐波生成纳米粒子对人类胚胎干细胞（hESCs）进行体外标记的协议。它详细说明了通过多光子显微镜研究hESCs及其分化为心脏簇的方法。
关键研究组成部分
科学领域
- 干细胞研究
- 心脏生物学
- 显微技术
背景
- 人类胚胎干细胞可以分化为各种细胞类型。
- 监测心脏珠链簇对于理解心脏发育至关重要。
- 二次谐波生成纳米粒子在成像方面提供优势。
- 多光子显微镜为实时分析提供高空间分辨率。
研究目的
- 实时监测源自hESCs的心脏珠链簇。
- 分析心脏收缩的空间延展和频率。
- 利用纳米粒子进行更深层次的组织成像。
使用的方法
- 培养和扩增hESCs以形成胚体。
- 在PTFE多孔过滤器上解剖和铺设跳动簇。
- 用谐波纳米粒子标记跳动簇。
- 进行实时多光子显微镜分析。
主要结果
- 成功监测了显微尺度上的心脏收缩。
- 展示了纳米粒子随时间的稳定性。
- 能够使用各种波长进行更深层次的组织穿透。
- 洞察了心脏簇行为的动力学。
结论
- 该方法允许有效的体外监测心脏簇。
- 二次谐波生成纳米粒子增强了成像能力。
- 这种方法可以推进从干细胞的心脏发育理解。
常见问题
Executive Industry Relevance
Labeling human embryonic stem cell-derived cardiac clusters with second harmonic generation nanoparticles (HNPs) enables high-resolution, real-time 3D monitoring of tissue dynamics critical for regenerative research. This approach provides stable, deep-tissue imaging for extended observation of cardiac maturation and functional contraction, supporting predictive confidence in early discovery and tissue engineering workflows. The method advances portfolio decision-making by enabling quantitative, reproducible analysis of stem cell-derived tissue constructs.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables quantitative interrogation of cardiomyocyte function and maturation in 3D tissue models.
- Supports mechanistic de-risking by providing direct visualization of contractile behavior in stem cell-derived systems.
- Facilitates functional target validation for cardiac tissue engineering and regenerative medicine research.
Screening & Assay Development
- Prepares validated, labeled cardiac clusters for downstream multiphoton imaging assays.
- Delivers reproducible, quantitative readouts of contraction frequency and displacement patterns.
- Supports assay standardization and scalability for compound evaluation in disease-relevant systems.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with translational biomarker strategies by enabling 3D functional analysis of cardiac constructs.
- Provides continuity from discovery-stage tissue modeling to preclinical validation of regenerative therapies.
- Reduces biological risk by supporting predictive assessment of tissue integration and function.
Pipeline & Workflow Integration
This method integrates into the discovery-to-preclinical continuum by enabling hypothesis testing, functional validation, and quantitative analysis of stem cell-derived cardiac tissues.
- Discovery Biology: Supports mechanistic studies of cardiac differentiation and contractility in engineered tissues.
- Screening: Provides robust, quantitative imaging outputs for evaluating functional endpoints.
- Analytics: Enables measurement of displacement and contraction frequency for comparative analysis.
- Translational Research: Bridges in vitro tissue modeling with preclinical assessment of regenerative strategies.
- Enterprise Reuse: Offers a reusable imaging and analysis platform for diverse tissue engineering applications.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in cardiac tissue research.
- Operational Value: Delivers stable, reproducible imaging over long-term experiments.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and capital efficiency in regenerative portfolio development.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of tissue engineering and regenerative medicine programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in stem cell culture, tissue engineering, and multiphoton microscopy.
- Needs access to advanced imaging platforms and quantitative analysis software (e.g., MATLAB).
- Demands cross-team standardization of labeling and imaging protocols for reproducibility.
- Adaptation to other tissue types or disease models may require protocol optimization.
- Labeling with HNPs is limited to multiphoton microscopy and not transferable to other imaging modalities.
