Name: 血管再生在中枢神经系统中使用的小鼠视网膜评估 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-06-23T18:45:00.000+00:00
Duration: 7 min 32 s
Description: 了解利用氧诱导视网膜病变小鼠模型评估中枢神经系统血管再生的方法。通过玻璃体内注射和荧光素血管造影技术，研究人员可研究缺血性损伤后的血管功能恢复机制。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

PS 担任加拿大视网膜细胞生物学研究讲席教授，并获得阿尔康研究学会新研究者奖。本研究工作得到了加拿大卫生研究院（221478）、加拿大糖尿病协会（OG-3-11-3329-PS）、加拿大自然科学与工程研究理事会（418637）以及加拿大盲症基金会的资助。魁北克视觉健康研究网络也提供了支持。

伦理声明：所有动物实验均遵循视觉与眼科研究协会（ARVO）制定的《眼科与视觉研究中动物使用声明》以及加拿大动物护理委员会的动物护理指南。
1. 氧诱导视网膜病变（OIR）
<ol>
	<li>将小鼠仔鼠的出生日期记录为P0。</li>
	<li>记录动物进入O时的所有体重2 以确保体重范围合适。注意：对于 P17 的 C57BL/6 小鼠，体重应在 5 至 7.5 g 之间，以获得最大的 NV32为了保持环境的一致性，建议使用同窝幼鼠作为对照组（包括基因修饰小鼠以及接受实验处理的小鼠）。在评估病毒载体效应时，必须考虑病毒的嗜性，并给予足够时间以实现病毒递送的转基因充分表达。对于表达迅速的病毒载体，例如3rd 慢病毒的制备24,25,33 建议使用。</li>
	<li>将P7阶段的小鼠幼崽（C57BL/6或所需品系）与CD1代乳母鼠放入设定为75% O₂的氧舱中2 5天27环境湿度和温度在整个实验过程中保持恒定。2&#160;暴露&#160;注意：配备有集中供氧系统的科研设施2 是理想选择，并可避免频繁更换空的O2 水箱。若使用转基因或基因敲除小鼠，需确保对照组和实验组小鼠来自同一供应商，以限制同品系内的遗传漂变30,29.&#160;</li>
	<li>在P12时，将小鼠从氧舱中取出，并将动物放回常氧环境中2.</li>
</ol>
2. 玻璃体内注射递送化合物至内视网膜 （在评估药理学化合物或重组蛋白作用时）
<ol>
	<li>在P14阶段，使用2%异氟烷（氧气流速为2 L/min）对小鼠进行麻醉（或选用经动物保护委员会批准的其他麻醉剂）。为确认麻醉效果，需用镊子依次夹捏小鼠的尾巴、后肢足部和耳朵。</li>
	<li>将小鼠腹部朝下放置。</li>
	<li>使用装有斜面拉制玻璃针头的无菌10 µl注射器，在眼球后部角膜缘处以45°角注射最大体积为1 µl的待研究化合物溶液或对照溶剂（生理盐水），注意避开晶状体。注：拉制的玻璃针头通过一滴环氧树脂固定于注射器上。</li>
	<li>用棉签在小鼠眼部涂抹一滴润滑性眼膏（理想情况下含抗生素）。</li>
	<li>将小鼠放回笼中并与哺乳母鼠共同饲养。&#160;随后需密切监测小鼠状态，直至其完全苏醒并能自由活动。</li>
</ol>
3. 通过荧光素血管造影评估血管灌注和屏障功能（完整性） 
<ol>
	<li>使用2%异氟烷与2 L/min氧气混合气体对小鼠进行麻醉（或选用经动物保护委员会批准的其他麻醉剂）。为确认麻醉效果，依次用镊子夹捏小鼠尾部、后肢足部和耳朵。注意：通常在P17（出生后第17天）进行再生评估，建议同时在P19和P21进行分析，以确定血管完整性是否随时间保持稳定。</li>
	<li>麻醉成功后，称量小鼠体重。</li>
	<li>使用解剖剪在腹部正中线处做切口。&#160;注意：解剖器械应定期检查并磨利。</li>
	<li>从侧方剪开肋骨，并用镊子抬起胸廓。&#160;注意：应尽可能从侧方剪切，以避免损伤心脏。</li>
	<li>清除心脏周围的组织后，用止血钳夹闭降主动脉。</li>
	<li>使用25 G针头将荧光素-葡聚糖缓慢注入左心室。注意：若研究血管屏障功能，应使用70 kDa荧光素-葡聚糖，因其在血管完整性受损时会从血管渗出；若需对血管进行铸型，则使用2 MDa荧光素-葡聚糖。关键步骤：1）为确保均匀分布，需先离心荧光素-葡聚糖，取上清液进行注射；2）为防止血管收缩，应使用预温的荧光素-葡聚糖溶液；3）循环时间不应超过4分钟。</li>
	<li>注射后2&#160;分钟&#160;，使用手术剪将小鼠断头处死。</li>
</ol>
4. 去核与眼球固定
注意：在评估血管再生速率时，首先在P12收集视网膜，此外还需在P14和P17进行收集。增加采样时间点的数量可更准确地确定再血管化速率24。
<ol>
	<li>倾斜小鼠头部，使其侧放。</li>
	<li>使用解剖剪去除覆盖眼睛的皮肤和眼睑。</li>
	<li>将弯头镊置于眼球下方，轻轻向上提起，直至视神经被切断。</li>
	<li>将小鼠头部翻转至另一侧，重复相同步骤（步骤&#160;4.2 和 4.3）。</li>
	<li>为确保固定剂更好渗透，使用 30 G 针头在眼球前房处刺一个小孔。</li>
	<li>将眼球转移至含有 4% 多聚甲醛（PFA）的离心管中，在室温下固定 1 小时。</li>
	<li>去除 PFA，用预冷的 PBS 溶液洗涤眼球 4 次。</li>
</ol>
5. 视网膜解剖
<ol>
	<li>将小鼠眼球置于含有冷PBS的培养皿中，并在体视显微镜下进行视网膜解剖。</li>
	<li>使用显微解剖剪去除眼球周围多余的脂肪/组织。</li>
	<li>用显微解剖剪剪除角膜。</li>
	<li>使用两把镊子，从周边向视神经方向仔细剥离巩膜并弃去。</li>
	<li>用镊子夹住晶状体（角膜下方的白色小球），将其从眼杯中取出。操作时可用一把镊子作为支撑，另一把镊子夹住并小心提起晶状体，将其移除。</li>
	<li>使用小号毛刷（0号）和镊子从视网膜内侧分离玻璃体血管。</li>
	<li>用镊子移除连接在视盘上的玻璃体血管束。</li>
	<li>将解剖好的视网膜转移至含有PBS的2 ml微量离心管中，置于冰上，待染色实验开始前保存。</li>
</ol>
6. 视网膜血管染色
<ol>
	<li>4 °C 条件下，在含有 1 mM CaCl₂ 的 PBS 溶液中加入荧光标记的 isolectin B4（如罗丹明标记的凝集素或其他），将分离的视网膜组织置于其中，避光孵育过夜，同时轻轻振荡。2 （建议使用2 mg/ml的isolectin B4溶液按1:100比例稀释）。整个染色过程中，需用铝箔或不透光箔包裹离心管，避免光照。</li>
	<li>次日，去除染色液，并用PBS洗涤视网膜3次&#160;在室温下用 PBS 孵育 10 分钟。</li>
</ol>
7. 视网膜平铺标本的制备
<ol>
	<li>将视网膜感光细胞面朝下转移至载玻片上，使用外科手术刀进行四条深度相等且间距均匀的放射状切口，将视网膜均分为四个大小相等的象限。切割过程中，用刷子固定视网膜，防止其移动。</li>
	<li>使用两支浸有PBS的刷子，小心地将各象限的感光细胞面朝下展平，并将视网膜浸入封片剂中以防止光漂白。然后小心地将盖玻片覆盖在封片后的视网膜表面，避免施加压力，并确保盖玻片下无气泡积聚。</li>
</ol>
8. 血管闭塞（VO）和新生血管形成（NV）的成像与定量分析，方法如前所述31
<ol>
	<li>使用落射荧光显微镜在10倍放大倍数下拍摄整体安装的视网膜图像。</li>
	<li>在图像编辑软件中打开视网膜图像，拼接图像并测量总视网膜面积和无血管区域面积。面积可用像素表示。</li>
	<li>通过将无血管区域的像素数除以总视网膜区域的像素数，计算血管闭塞（VO）的程度。</li>
	<li>通过将新生血管（NV）的像素数除以总视网膜区域的像素数，计算新生血管（NV）的程度，方法如文献31所述。</li>
</ol>

<ol><li>Carmeliet, P., Tessier-Lavigne, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Common+mechanisms+of+nerve+and+blood+vessel+wiring%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Common mechanisms of nerve and blood vessel wiring.</a> Nature. 436, 193-200 (2005).</li>
<li>Eichmann, A., Thomas, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+Parallels+between+Neural+and+Vascular+Development%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Perspect+Med%22%5BJournal%5D)">Molecular Parallels between Neural and Vascular Development.</a> Cold Spring Harb Perspect Med. 3, (2012).</li>
<li>Larrivee, B., Freitas, C., Suchting, S., Brunet, I., Eichmann, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Guidance+of+vascular+development%3A+lessons+from+the+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Guidance of vascular development: lessons from the nervous system.</a> Circ Res. 104, 428-441 (2009).</li>
<li>Stefater Iii, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+angiogenesis+by+a+non-canonical+Wnt-Flt1+pathway+in+myeloid+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Regulation of angiogenesis by a non-canonical Wnt-Flt1 pathway in myeloid cells.</a> Nature. 474, 511-515 (2011).</li>
<li>Checchin, D., Sennlaub, F., Levavasseur, E., Leduc, M., Chemtob, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potential+role+of+microglia+in+retinal+blood+vessel+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Potential role of microglia in retinal blood vessel formation.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 47, 3595-3602 (2006).</li>
<li>Quaegebeur, A., Lange, C., Carmeliet, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+neurovascular+link+in+health+and+disease%3A+molecular+mechanisms+and+therapeutic+implications%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">The neurovascular link in health and disease: molecular mechanisms and therapeutic implications.</a> Neuron. 71, 406-424 (2011).</li>
<li>Yamamoto, Y., Craggs, L., Baumann, M., Kalimo, H., Kalaria, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Review%3A+molecular+genetics+and+pathology+of+hereditary+small+vessel+diseases+of+the+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropathol+Appl+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Review: molecular genetics and pathology of hereditary small vessel diseases of the brain.</a> Neuropathol Appl Neurobiol. 37, 94-113 (2011).</li>
<li>Brun, A., Englund, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+white+matter+disorder+in+dementia+of+the+Alzheimer+type%3A+a+pathoanatomical+study%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Neurol%22%5BJournal%5D)">A white matter disorder in dementia of the Alzheimer type: a pathoanatomical study.</a> Ann Neurol. 19, 253-262 (1986).</li>
<li>Prat, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Migration+of+multiple+sclerosis+lymphocytes+through+brain+endothelium%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Neurol%22%5BJournal%5D)">Migration of multiple sclerosis lymphocytes through brain endothelium.</a> Arch Neurol. 59, 391-397 (2002).</li>
<li>Rule, R. R., Schuff, N., Miller, R. G., Weiner, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gray+matter+perfusion+correlates+with+disease+severity+in+ALS%5BTitle%5D)+AND+%22Neurology%22%5BJournal%5D)">Gray matter perfusion correlates with disease severity in ALS.</a> Neurology. 74, 821-827 (2010).</li>
<li>Antonetti, D. A., Klein, R., Gardner, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diabetic+retinopathy%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Diabetic retinopathy.</a> N Engl J Med. 366, 1227-1239 (2012).</li>
<li>Hartnett, M. E., Penn, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+and+management+of+retinopathy+of+prematurity%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Mechanisms and management of retinopathy of prematurity.</a> N Engl J Med. 367, 2515-2526 (2012).</li>
<li>Sapieha, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinopathy+of+prematurity%3A+understanding+ischemic+retinal+vasculopathies+at+an+extreme+of+life%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Retinopathy of prematurity: understanding ischemic retinal vasculopathies at an extreme of life.</a> J Clin Invest. 120, 3022-3032 (2010).</li>
<li>Chen, J., Smith, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinopathy+of+prematurity%5BTitle%5D)+AND+%22Angiogenesis%22%5BJournal%5D)">Retinopathy of prematurity.</a> Angiogenesis. 10, 133-140 (2007).</li>
<li>Cheung, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diabetic+retinopathy+and+systemic+vascular+complications%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Retinal+and+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Diabetic retinopathy and systemic vascular complications.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 27, 161-176 (2008).</li>
<li>Smith, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Through+the+eyes+of+a+child%3A+understanding+retinopathy+through+ROP+the+Friedenwald+lecture%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Through the eyes of a child: understanding retinopathy through ROP the Friedenwald lecture.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 49, 5177-5182 (2008).</li>
<li>Caballero, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ischemic+vascular+damage+can+be+repaired+by+healthy%2C+but+not+diabetic%2C+endothelial+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Ischemic vascular damage can be repaired by healthy, but not diabetic, endothelial progenitor cells.</a> Diabetes. 56, 960-967 (2007).</li>
<li>Wang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((VEGF-mediated+STAT3+activation+inhibits+retinal+vascularization+by+down-regulating+local+erythropoietin+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Pathol%22%5BJournal%5D)">VEGF-mediated STAT3 activation inhibits retinal vascularization by down-regulating local erythropoietin expression.</a> Am J Pathol. 180, 1243-1253 (2012).</li>
<li>Ritter, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myeloid+progenitors+differentiate+into+microglia+and+promote+vascular+repair+in+a+model+of+ischemic+retinopathy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Myeloid progenitors differentiate into microglia and promote vascular repair in a model of ischemic retinopathy.</a> J Clin Invest. 116, 3266-3276 (2006).</li>
<li>Saito, Y., Geisen, P., Uppal, A., Hartnett, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+NAD%28P%29H+oxidase+reduces+apoptosis+and+avascular+retina+in+an+animal+model+of+retinopathy+of+prematurity%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Vis%22%5BJournal%5D)">Inhibition of NAD(P)H oxidase reduces apoptosis and avascular retina in an animal model of retinopathy of prematurity.</a> Mol Vis. 13, 840-853 (2007).</li>
<li>Connor, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+dietary+intake+of+omega-3-polyunsaturated+fatty+acids+reduces+pathological+retinal+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Increased dietary intake of omega-3-polyunsaturated fatty acids reduces pathological retinal angiogenesis.</a> Nat Med. 13, 868-873 (2007).</li>
<li>Banin, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T2-TrpRS+inhibits+preretinal+neovascularization+and+enhances+physiological+vascular+regrowth+in+OIR+as+assessed+by+a+new+method+of+quantification%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">T2-TrpRS inhibits preretinal neovascularization and enhances physiological vascular regrowth in OIR as assessed by a new method of quantification.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 47, 2125-2134 (2006).</li>
<li>Dorrell, M. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maintaining+retinal+astrocytes+normalizes+revascularization+and+prevents+vascular+pathology+associated+with+oxygen-induced+retinopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Maintaining retinal astrocytes normalizes revascularization and prevents vascular pathology associated with oxygen-induced retinopathy.</a> Glia. 58, 43-54 (2010).</li>
<li>Joyal, J. -S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ischemic+neurons+prevent+vascular+regeneration+of+neural+tissue+by+secreting+semaphorin+3A%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Ischemic neurons prevent vascular regeneration of neural tissue by secreting semaphorin 3A.</a> Blood. 117, 6024-6035 (2011).</li>
<li>Binet, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+ER+Stress+Impedes+Myeloid-Cell-Induced+Vascular+Regeneration+through+IRE1alpha+Degradation+of+Netrin-1%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metab%22%5BJournal%5D)">Neuronal ER Stress Impedes Myeloid-Cell-Induced Vascular Regeneration through IRE1alpha Degradation of Netrin-1.</a> Cell Metab. 17, 353-371 (2013).</li>
<li>Fukushima, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sema3E-PlexinD1+signaling+selectively+suppresses+disoriented+angiogenesis+in+ischemic+retinopathy+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Sema3E-PlexinD1 signaling selectively suppresses disoriented angiogenesis in ischemic retinopathy in mice.</a> J Clin Invest. 121, 1974-1985 (2011).</li>
<li>Smith, L. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxygen-induced+retinopathy+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Oxygen-induced retinopathy in the mouse.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 35, 101-111 (1994).</li>
<li>Lange, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetics+of+retinal+vaso-obliteration+and+neovascularisation+in+the+oxygen-induced+retinopathy+%28OIR%29+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22Graefes+Arch+Clin+Exp+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">Kinetics of retinal vaso-obliteration and neovascularisation in the oxygen-induced retinopathy (OIR) mouse model.</a> Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol. 247, 1205-1211 (2009).</li>
<li>Connor, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+oxygen-induced+retinopathy+in+the+mouse%3A+a+model+of+vessel+loss%2C+vessel+regrowth+and+pathological+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Quantification of oxygen-induced retinopathy in the mouse: a model of vessel loss, vessel regrowth and pathological angiogenesis.</a> Nature Protocols. 4, 1565-1573 (2009).</li>
<li>Stahl, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mouse+retina+as+an+angiogenesis+model%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">The mouse retina as an angiogenesis model.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 51, 2813-2826 (2010).</li>
<li>Stahl, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Computer-aided+quantification+of+retinal+neovascularization%5BTitle%5D)+AND+%22Angiogenesis%22%5BJournal%5D)">Computer-aided quantification of retinal neovascularization.</a> Angiogenesis. 12, 297-301 (2009).</li>
<li>Stahl, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Postnatal+Weight+Gain+Modifies+Severity+and+Functional+Outcome+of+Oxygen-Induced+Proliferative+Retinopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Postnatal Weight Gain Modifies Severity and Functional Outcome of Oxygen-Induced Proliferative Retinopathy.</a> Am J Pathol. 177, 2715-2723 (2010).</li>
<li>Cerani, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuron-Derived+Semaphorin+3A+is+an+Early+Inducer+of+Vascular+Permeability+in+Diabetic+Retinopathy+via+Neuropilin-1%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Neuron-Derived Semaphorin 3A is an Early Inducer of Vascular Permeability in Diabetic Retinopathy via Neuropilin-1.</a> Cell Metabolism. 18, 505-518 (2013).</li>
<li>Sapieha, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Eyeing+central+neurons+in+vascular+growth+and+reparative+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Eyeing central neurons in vascular growth and reparative angiogenesis.</a> Blood. 120, 2182-2194 (2012).</li>
<li>Dorfman, A., Dembinska, O., Chemtob, S., Lachapelle, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+manifestations+of+postnatal+hyperoxia+on+the+retinal+structure+and+function+of+the+neonatal+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Early manifestations of postnatal hyperoxia on the retinal structure and function of the neonatal rat.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 49, 458-466 (2008).</li>
<li>Dorfman, A. L., Joly, S., Hardy, P., Chemtob, S., Lachapelle, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+oxygen+and+light+on+the+structure+and+function+of+the+neonatal+rat+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Doc+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">The effect of oxygen and light on the structure and function of the neonatal rat retina.</a> Doc Ophthalmol. 118, 37-54 (2009).</li>
<li>Chopp, M., Zhang, Z. G., Jiang, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurogenesis%2C+angiogenesis%2C+and+MRI+indices+of+functional+recovery+from+stroke%5BTitle%5D)+AND+%22Stroke%22%5BJournal%5D)">Neurogenesis, angiogenesis, and MRI indices of functional recovery from stroke.</a> Stroke. 38, 827-831 (2007).</li>
<li>Li, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Angiogenesis+and+improved+cerebral+blood+flow+in+the+ischemic+boundary+area+detected+by+MRI+after+administration+of+sildenafil+to+rats+with+embolic+stroke%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Angiogenesis and improved cerebral blood flow in the ischemic boundary area detected by MRI after administration of sildenafil to rats with embolic stroke.</a> Brain Res. 1132, 185-192 (2007).</li>
<li>Robinson, R., Barathi, V. A., Chaurasia, S. S., Wong, T. Y., Kern, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Update+on+animal+models+of+diabetic+retinopathy%3A+from+molecular+approaches+to+mice+and+higher+mammals%5BTitle%5D)+AND+%22Dis+Model+Mech%22%5BJournal%5D)">Update on animal models of diabetic retinopathy: from molecular approaches to mice and higher mammals.</a> Dis Model Mech. 5, 444-456 (2012).</li>
<li>Chia, R., Achilli, F., Festing, M. F., Fisher, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+origins+and+uses+of+mouse+outbred+stocks%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">The origins and uses of mouse outbred stocks.</a> Nat Genet. 37, 1181-1186 (2005).</li>
<li>Jenuth, J. P., Peterson, A. C., Shoubridge, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue-specific+selection+for+different+mtDNA+genotypes+in+heteroplasmic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Tissue-specific selection for different mtDNA genotypes in heteroplasmic mice.</a> Nat Genet. 16, 93-95 (1997).</li>
<li>Mattapallil, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Rd8+mutation+of+the+Crb1+gene+is+present+in+vendor+lines+of+C57BL%2F6N+mice+and+embryonic+stem+cells%2C+and+confounds+ocular+induced+mutant+phenotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+ophthalmolog.%2C+%26+visual+science%22%5BJournal%5D)">The Rd8 mutation of the Crb1 gene is present in vendor lines of C57BL/6N mice and embryonic stem cells, and confounds ocular induced mutant phenotypes.</a> Investigative ophthalmolog., & visual science. 53, 2921-2927 (2012).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

在缺血性神经组织中，刺激新生健康血管生长的最有效方法是什么？干预并加速自然发生的血管再生在治疗上是否合理？在缺血性视网膜病变或中风等神经缺血性疾病中，血管退化与神经元功能下降相关35-38。因此，为了对抗早期损伤，在疾病发生初期及时恢复局部微循环可能具有治疗益处。在眼部疾病背景下，可加速缺血视网膜再血管化的实验模型已被证明能够减少病理性新生血管形成21-25,34，因此这一策略值得进一步研究。&#160;
自20年前引入以来，OIR模型27彻底改变了视网膜血管生成研究领域30。本文提供了该模型的另一项应用，用于研究调控缺血性视网膜生理性血管再生的潜在策略。理想的动物模型应具备多个标准，包括与人类病理生理学的相似性、高度可重复性、操作快速以及理想情况下的低成本。OIR小鼠模型满足所有这些标准，且可在不到3周的时间内完成。
尽管有诸多列出的优点，但缺点包括目前在分析前需要处死小鼠，因此利用现有的成像工...

在整个中枢神经系统发育过程中，神经、免疫细胞和血管形成了高度耦合的网络，以确保充足的组织灌注并实现感觉信息的传递1-5。血管系统的破坏会导致组织氧合不足和代谢供应受损，这一点正日益被认识到是神经退行性疾病发病机制中的重要成因6。例如，脑内血管丢失以及神经血管单元的恶化，与血管性痴呆、脑白质血管病变7以及伴有小动脉和小血管狭窄的阿尔茨海默病相关8。此外，血管屏障功能受损被认为参与了多发性硬化9和肌萎缩侧索硬化症的发病过程10。
与本方案中描述的视网膜模型直接相关，糖尿病性视网膜病变11和早产儿视网膜病变12,13等致盲性疾病均表现为早期血管退变阶段。随后，神经血管性视网膜所承受的缺血应激会触发第二阶段过度且病理性新生血管形成，这一过程可能源于对恢复氧气和能量供应的代偿性反应14-16。克服在疾病进展中起核心作用的缺血应激的一种有吸引力的策略，是在神经视网膜的缺血区域特异性地重建功能性血管网络（图 2&#160;和 图 3）。诱导受控的血管生成反应，对于一种将抗血管生成治疗（如抗VEGF疗法）视为标准治疗手段的疾病而言，可能看似违反直觉。然而，支持该策略有效性的证据正不断积累。例如，已有研究通过引入内皮前体细胞17、抑制穆勒细胞表达VEGF所导致的其他促血管生成因子下调18、注射骨髓源性祖细胞19、抑制NADPH氧化酶诱导的细胞凋亡20、增加膳食中ω-3多不饱和脂肪酸摄入21、使用色氨酰tRNA合成酶的羧基末端片段进行治疗22，以及直接给予VEGF或FGF-2以保护胶质细胞23，优雅地证明了在缺血性视网膜病变中促进“生理性样”血管再生的可行性。此外，我们已证明，在缺血性视网膜病变中调控经典的神经元导向信号分子（如Semaphorins或Netrins），可加速视网膜内健康血管的再生，从而减少病理性血管生成24,25。在直接的临床意义上，上述多项动物研究提供了证据表明，在视网膜病变的早期缺血阶段促进血管再生，可显著减轻威胁视力的视网膜前新生血管形成19,23,24,26，这很可能通过减轻缺血负担实现。
设计能够促进功能性血管再生的治疗策略，对血管生物学家而言仍是一项重大挑战。本文介绍了一种实验系统，该系统采用氧诱导视网膜病变（oxygen-induced retinopathy, OIR）小鼠模型，以探索调控视网膜内血管再生的策略。该模型由 Smith 建立 等 1994年27该模型可作为人类增殖性视网膜病变的替代模型，其方法为将出生7天的小鼠幼崽暴露于75%氧气环境中2 直至P12，随后将仔鼠重新暴露于常氧环境2-张力（图1）。这种范式大致模拟了早产儿所处的一种情况&#160;以 O₂ 通风2幼鼠暴露于高氧环境可引发视网膜毛细血管和微血管的退化，并产生可重复的血管闭塞（VO）区域，通常在离开氧气舱后进行评估。2 在P12时，尽管最大VO面积在48小时达到&#160;（P9）暴露于O后2 28在小鼠中，无血管的血管缺失区（VO区）在重新暴露于常氧环境后的一周内会自发再生，最终完全实现血管化。图2。将经历OIR的小鼠重新暴露于常氧环境也会引发视网膜前新生血管形成（NV）（在P17时达到高峰），通常以此评估抗血管生成治疗方案的疗效。在最典型的形式中，OIR模型为研究氧诱导的血管退变及评估破坏性视网膜前新生血管形成的程度提供了一种高度可重复且可量化的工具。29-31.
可利用氧诱导视网膜病变（OIR）模型研究多种探索性治疗范式对中枢神经系统血管再生的调节作用，包括药理学化合物、基因治疗、基因敲除等方法。在出生后第12天（P12，脱离高氧环境后血管闭塞达到峰值）至出生后第17天（P17，病理性新生血管达到峰值）的时间窗口内，可逐步评估特定干预手段对血管再生长的影响。治疗对病理性新生血管的影响可同时快速、简便地进行评价，该方法已由Stahl及其同事进行了详尽描述30,31。本文提供一种简单、分步的操作流程，用于研究药理学化合物、潜在治疗药物、病毒载体对神经视网膜生理性再血管化的调节作用，或用于研究候选基因在转基因小鼠或基因敲除小鼠中的功能影响。

<table><tbody><tr><td>C57Bl/6 小鼠（也可使用其他品系；不同品系间的血管生成反应存在差异）</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CD1 哺乳期母鼠</td><td>自选供应商</td><td></td><td></td></tr><tr><td>直型手术剪</td><td>World Precision Instruments</td><td>14192</td><td></td></tr><tr><td>直型解剖剪</td><td>World Precision Instruments</td><td>14393</td><td></td></tr><tr><td>眼科剪（Vannas 型）</td><td>Harvard Apparatus</td><td>72-8483</td><td></td></tr><tr><td>弯齿虹膜镊</td><td>World Precision Instruments</td><td>15915</td><td></td></tr><tr><td>刷子 362R 型号 0</td><td>Dynasty</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dumont #3 镊子；直型</td><td>World Precision Instruments</td><td>500338</td><td></td></tr><tr><td>手术刀片，型号 10</td><td>Bard-Parker</td><td>371110</td><td></td></tr><tr><td>罗丹明标记的 Griffonia（Bandeiraea）simplicifolia 凝集素 I</td><td>Vector Laboratories, Inc</td><td>RL-1102</td><td></td></tr><tr><td>显微镜载玻片</td><td>VWR</td><td>16004-368</td><td></td></tr><tr><td>Fluoromount G 封片剂</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>17984-25</td><td></td></tr><tr><td>Zeiss Axio Observer Z1 倒置相差与荧光显微镜</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Leica MZ9.5 体视显微镜</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>异硫氰酸荧光素标记葡聚糖，分子量 70000</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>46945</td><td></td></tr></tbody></table>

利用小鼠视网膜评估中枢神经系统中的血管再生

Assessment of Vascular Regeneration in the CNS Using the Mouse Retina

啮齿类动物的视网膜可能是研究中枢神经系统（CNS）内神经与血管相互作用的最易获取的哺乳动物系统。人们日益认识到，多种神经退行性疾病（如阿尔茨海默病、多发性硬化症和肌萎缩侧索硬化症）均存在血管功能受损的特征。此外，儿童及劳动年龄人群失明的最主要原因（分别为早产儿视网膜病变和糖尿病性视网膜病变）均以血管退化及生理性血管再生失败为特征。本技术论文的目的是提供一种详细的研究视网膜中中枢神经系统血管再生的实验方案。该方法可用于阐明缺血性损伤后导致血管生长失败的分子机制。同时，也可用于探索促进并恢复健康血管网络的潜在治疗手段。通过所述方法获得的研究结果，可能为糖尿病或早产相关的缺血性视网膜病变提供治疗途径，并可能对其他中枢神经系统血管疾病产生积极意义。

氧诱导视网膜病变（OIR）模型被广泛用于研究视网膜中由氧诱导的血管退化及由缺血诱导的病理性新生血管形成，该模型对目前用于治疗眼部疾病的抗血管生成疗法的开发起到了重要作用27,29,30。利用该模型获得的研究结果可大致外推至增殖性糖尿病视网膜病变和早产儿视网膜病变等缺血性视网膜病变30。
本文介绍了一种利用该模型研究血管再生的替代方法。我们将描述本实验室近期发表的一项关于缺血性视网膜再生策略的实例。在该研究中，我们证明持续的神经元缺血会激活内质网（ER）应激，并通过其效应分子之一——内切核糖核酸酶IRE1α，切割经典神经导向因子netrin-1的mRNA。我们发现，将Netrin-1递送至眼内可激活视网膜髓系细胞的修复性血管生成程序，从而加速氧诱导视网膜病变（OIR）后神经组织的再血管化25。此外，我们还提供了通过慢病毒介导的IRE1α沉默实现血管再生加速的实例。
所述实验范式...

啮齿类动物的视网膜长期以来被视为观察大脑的一个易于接近的窗口。在本技术论文中，我们提供了一种利用小鼠氧诱导性视网膜病变模型来研究缺血性损伤后中枢神经系统内血管再生失败机制的实验方案。该系统还可用于探索促进视网膜和中枢神经系统内功能性血管再生的策略。

啮齿类动物的视网膜可能是研究中枢神经系统（CNS）内神经血管相互作用最易获取的哺乳动物系统。

本实验的总体目标是探索在缺血性损伤后促进视网膜及中枢神经系统内功能性血管再生的策略。首先采用氧诱导视网膜病变的小鼠模型，随后通过玻璃体内注射将化合物递送至眼部。通过荧光素血管造影验证血管灌注和屏障功能。最后一步是摘取眼球并分离视网膜。随后对视网膜进行染色、封片，再进行成像。最终，免疫荧光显微镜可用于评估玻璃体内治疗后或基因修饰小鼠中血管再生的速率。我们所介绍的技术提供了一种高度可重复且简便的系统，用于评估中枢神经系统内的血管再生情况。该技术基于氧诱导视网膜病变的Smith模型，对于设计治疗中枢神经系统缺血的策略具有重要帮助。该方法有助于解答关于驱动或抑制中枢神经系统（CNS）血管功能性再生的分子机制的关键问题。它可用于研究基因、药理学化合物的影响，或阐明启动血管生长的病理机制。除了眼部疾病外，该技术还可推广至中枢神经系统的其他区域，例如大脑和脊髓。成功将化合物注射到小鼠仔鼠的玻璃体腔内并妥善处理新鲜组织需要一定的操作经验。实验开始时，将出生后第7天（P7）的小鼠仔鼠与其CD1代乳母鼠一同放入氧浓度设定为75%的氧舱中。五天后，将动物从氧舱中取出，并恢复至正常饲养条件。随后在P12或P14阶段，进行玻璃体内注射，以将化合物递送至视网膜内层。麻醉小鼠后，需用镊子依次夹捏其尾部、后足和耳朵，以确认麻醉效果。应提前准备好连接10微升注射器并带有环氧树脂液滴的拉制斜面玻璃针。注射部位位于眼球后部角膜缘。以45度角插入针头并注射目标化合物。在眼部涂抹药膏后，将小鼠放回笼中并与代孕母鼠一同饲养，同时开始离心荧光素葡聚糖溶液并收集上清液，以防止血管收缩。注射前需将荧光素葡聚糖溶液预热。接下来，确认麻醉小鼠的镇静深度。准备就绪后，使用解剖剪在腹部正中线处做一切口。打开胸腔并清除心脏周围的外周组织后，夹闭降主动脉。将一支装有预热荧光素葡聚糖的25号针头插入左心室，并灌注该溶液。注射后两分钟内，处死动物并将其头部侧放。使用解剖剪去除覆盖眼睛的皮肤和眼睑。接下来，将弯头镊子置于眼球下方，轻轻向上提起，直至视神经被切断。将小鼠头部转向另一侧，重复上述步骤。为确保固定液更好地渗透，在眼球前房处刺一个小孔。使用30号针头将眼球转移至含有4%多聚甲醛的离心管中，在室温下固定1小时。固定结束后，吸除PFA溶液，用冰冻PBS洗涤眼球4次。将眼球置于含有冷PBS的培养皿中，并在体视显微镜下进行定位。就位后，使用显微解剖剪去除眼球周围多余的组织，并剪开角膜。用两对镊子从周边向视神经方向剥离巩膜。用镊子夹住晶状体并从眼杯中取出。使用一对镊子作为支撑，另一对镊子夹住并小心提起和移除晶状体。用小毛刷和镊子从视网膜内侧剥离玻璃体动脉。接下来，用镊子移除连接于视盘的玻璃体动脉束。将解剖好的视网膜转移至含有 PBS 的 2 毫升微量离心管中，并置于冰上。在开始染色程序之前，解剖好的视网膜需先在 4°C 条件下

assessment-of-vascular-regeneration-in-the-cns-using-the-mouse-retina

Research

科研

JoVE Journal

Neuroscience

神经科学

血管再生在中枢神经系统中使用的小鼠视网膜评估

来源： Portela-Lomba, M., et. al. 轴突切断的大鼠视网膜神经节神经元与嗅鞘胶质细胞的共培养，作为成年神经元轴突再生的体外模型。J. Vis. Exp. (2020)。本视频展示了与永生化人嗅鞘胶质细胞共培养的轴突切断大鼠视网膜神经节细胞（RGNs）中轴突再生的成像与定量分析。RGNs...

轴切大鼠视网膜神经节细胞中轴突再生的成像与定量分析

新生小鼠视网膜为血管生成提供了一个特征明确的生理学模型，可在体内环境中研究不同基因或药物对血管生成的调控作用。准确可视化血管丛的免疫荧光染色对于此类研究的成功至关重要。...

对新生小鼠视网膜进行整体免疫荧光染色以研究血管生成 在体内的

本视频展示了一种利用临床3 T磁共振扫描仪对 naïve 小鼠视觉投射通路进行增强磁共振成像的方法，并可用于对急性视神经 crush 损伤及敲除小鼠（p50KO）中慢性视神经退行性变开展重复性和纵向的 in vivo...

体内小鼠视神经纤维完整性的对比增强MRI成像

用于观察血管再生的工具需要对血管树进行对比成像的方法。本视频展示了一种精细的注射技术，可用于实现血管树的最佳对比效果，并阐述了利用µCT及连续组织学切片对所得样本进行详细分析所带来的潜在优势。...

正常小鼠70%部分肝切除术后血管与实质再生的可视化

活体成像是研究健康与疾病状态下生物学的有力工具。本方案描述了使用标准双光子显微镜对小鼠视网膜进行经瞳孔成像的方法。同时展示了多种活体成像技术，用于对视网膜中多个细胞群体进行荧光标记。...

经瞳孔双光子活体小鼠视网膜成像

本方案详细描述了小鼠视网膜平铺片的制备与免疫荧光染色及分析方法。同时详细介绍了小鼠幼崽的荧光素眼底血管造影（FFA）技术及图像处理方法。...

监测氧诱导视网膜病变小鼠模型中视网膜血管的动态生长

本文介绍了一种使用玫瑰红（rose...

视网膜静脉阻塞小鼠模型的优化以减少变异性的研究

本文介绍了一种成熟且可重复的凝集素染色实验方法，适用于整体视网膜标本，以及用于定量测量在增殖性和非增殖性视网膜病变中常发生变化的血管参数所需的相关实验方案。...

非增殖性和增殖性视网膜病变小鼠全层视网膜血管参数的定量分析

本文介绍了视网膜静脉阻塞（RVO）研究中荧光素眼底血管造影（FA）和光学相干断层扫描（OCT）图像的三种数据分析方案。...

体内 小鼠视网膜血管损伤检测指标以促进可重复性

本实验方案介绍了一种简单且经济的方法，通过离体电穿孔技术在活体小鼠视网膜中定量分析顺式调控元件（即增强子/启动子）的活性。文中详细描述了DNA制备、视网膜分离、电穿孔、视网膜离体培养以及固定后的分析与定量过程。...

量化活性 顺式-利用外植体电穿孔技术研究小鼠视网膜中的调控元件

了解利用氧诱导视网膜病变小鼠模型评估中枢神经系统血管再生的方法。通过玻璃体内注射和荧光素血管造影技术，研究人员可研究缺血性损伤后的血管功能恢复机制。

利用小鼠视网膜评估中枢神经系统中的血管再生

探索更多视频