Name: 细胞标记和注射胚胎发展小鼠心脏 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-04-17T16:35:00.000+00:00
Duration: 7 min 20 s
Description: 学习小鼠胚胎心脏细胞标记与注射技术，用于追踪细胞命运和局部调控基因表达。该方法结合显微注射与成像分析，揭示心脏发育中特定基因和细胞的功能重要性。

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作者感谢Leducq基金会（MITRAL）和法国国家研究局（ANR Specistem资助）对本研究的资助。

1. 准备
动物实验操作
获得动物伦理委员会的批准，并遵循机构关于病毒、人胚胎干细胞（HuESC）和/或诱导多能干细胞（iPSC）（如适用）操作、小鼠操作、获取小鼠胚胎以及实施小鼠手术的指导方针。对于定时交配，发现阴栓当天记为胚胎发育第（E）0.5天，即交配后0.5天。
<ol>
	<li>显微注射针 
	对于 子宫外 显微注射，使用拉针仪/磨针仪将玻璃毛细管（外径1.2 mm的硼硅酸盐毛细管）拉制成内部尖端直径为1或10 μm、尖端呈锐利锥形的玻璃微针，分别用于注射DNA或细胞。对于超声介导注射，使用定制的无菌针头，其外径/内径（OD/ID）为1.14 mm/0.53 mm，针尖部分外径/内径为50/35 μm。</li>
	<li>硅胶填充的培养皿： 
	按照说明书所述准备硅胶。将洁净的直径为60 mm的玻璃培养皿倒入约1 cm厚的弹性体层。避免产生气泡。</li>
	<li>仪器： 
	在手术过程中及手术前，保持所有外科器械的无菌状态。</li>
	<li>DNA制备： 
	将3 μg DNA和12 μl Opti-MEM加入一个离心管中。在另一管中加入3 μl Lipofectamine 2000和12 μl Opti-MEM。室温孵育5分钟，混合两种溶液。立即使用。</li>
	<li>细胞制备： 
	制备10的悬浮液6 细胞/ml DMEM（Dulbecco改良Eagle培养基，高糖，含50%大鼠血清）。每8-10个胚胎使用50 μl终末细胞悬液即可。</li>
	<li>染料制备： 
	使用绿色荧光染料CDCFDA-SE，溶于DMSO中配制成25 mg/ml的储存液。分装为20 µl每管，于-20 °C保存。使用前用无菌生理盐水或PBS稀释100倍至200倍。</li>
	<li>病毒制备： 
	使用商用 3rd 生成表达PGK-GFP的慢病毒，滴度约为~109-1010 转导单位/毫升 DMEM。关于慢病毒的制备，参见 Tiscornia 等.14 穿戴个人防护装备，安全使用并妥善处理病毒。</li>
</ol>
2. 收集E9.5和E10.5胚胎用于 离体 注射
<ol>
	<li>在胚胎发育第9.5天或10.5天处死一只怀孕小鼠。</li>
	<li>用70%乙醇对小鼠的胸部和腹部进行消毒。</li>
	<li>沿腹中线做一纵向切口以打开腹腔，在室温下将子宫角取出并置于PBS中，经两次PBS洗涤后转移至盛有M16培养基的硅胶包被培养皿中。</li>
	<li>用昆虫针将子宫角固定在硅胶层上，使子宫的血管化面朝下。</li>
	<li>用精细镊子切开子宫表面，并在表面下方约1 mm处切下一小块蜕膜组织。</li>
	<li>轻轻展开蜕膜壁，将卵黄囊中的胚胎取出。</li>
	<li>在细胞注射前，将胚胎保存在37 °C的M16培养基中。注射时，将每个胚胎转移至盛有预热至37 °C的M16培养基的硅胶包被培养皿中。</li>
</ol>
3. 在体视显微镜下进行 DNA 或细胞注射
<ol>
	<li>用 Hamilton 注射器从玻璃移液管后端填充液体，并轻轻摇动移液管以去除管尖的气泡。</li>
	<li>将移液管安装到显微注射持针器上；设定持针压力为 50 hPa（用于 DNA）或 30 hPa（用于细胞），注射压力为 150 hPa（用于 DNA）至 300 hPa（用于细胞）。设定注射时间为 0.2 秒（用于 DNA）或 0.5 秒（用于细胞）。这些参数可能因显微注射仪和移液管类型的不同而略有调整。</li>
	<li>通过卵黄囊将胚胎固定在硅胶底部，注意不要触碰胚胎本体。观察心脏所在区域，并在该区域正上方切开卵黄囊。</li>
	<li>在胚胎周围插入 4 根固定针，以防止细胞注射过程中发生移动。</li>
	<li>使用显微操作器（设为手动模式），缓慢将移液管尖端以 45° 角置于心包上方、待注射心脏区域的正上方 (图 1)。</li>
	<li>将移液管移入目标区域并触发注射，随后尽快抽出移液管。确保在 DNA 或细胞注射后心脏正常搏动。</li>
</ol>
4. 胚胎、离体心脏及外植体培养
<ol>
	<li>将E9.5胚胎培养于25% M2培养基和75%大鼠血清中，添加青霉素/链霉素，于37 °C预热，并用40% O2供氧。</li>
	<li>在25 ml玻璃试管中加入2 ml培养基，轻轻放入胚胎，在拧紧管盖前用40% O2供氧。于37 °C孵育最多36小时，同时旋转或振荡（30转/分钟）。</li>
	<li>在所需时间点（例如24小时），使用精细镊子小心解剖心脏，通过先切断胚胎头部来分离心脏，避免直接接触心脏组织；通过牵拉远端流出道可轻松取出心脏。</li>
	<li>将分离的心脏继续在含50%胎牛血清（FCS）的DMEM培养基中培养36–48小时，培养时置于Matrigel包被的插入式培养插件中，放入12孔板内。有关心脏培养的改进方案，请参见Dyer &amp;#38; Patterson (2013)15。</li>
	<li>对感兴趣区域进行任何外植培养。例如，可解剖房室管（AVC）区域，并将其置于I型胶原凝胶上培养48小时16。</li>
</ol>
5. 心脏超声引导注射 我n 子宫内
<ol>
	<li>超声设备与显微注射仪的设置：
	<ol>
		<li>使用配备40 MHz探头的高分辨率超声系统，并将显微注射装置安装在导轨上。</li>
		<li>将显微注射仪的注射体积设定为每次注射69 nl。有关显微注射仪的编程操作，请参阅制造商提供的显微注射手册。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>显微注射装置的准备与注射操作：
	<ol>
		<li>将玻璃微量移液管插入显微注射仪中。为确保注射效率，首先通过吸取矿物油至最大体积来涂覆移液管内壁，然后将油排出，仅在针尖内保留1–2 mm的油柱。</li>
		<li>吸取注射液至最大容量。操作时注意避免针尖接触任何表面，以免针尖变钝，导致注射困难。</li>
		<li>为在注射过程中稳定含有胚胎的子宫角，使用一个中间带有圆孔（直径2.5 cm）的改良型培养皿，圆孔上方覆盖一层中心切有小切口的薄硅胶膜，并将其置于手术切口部位上方。通过在培养皿边缘下方放置3–4团黏土，将其固定在小鼠操作台上。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>注射操作步骤：
	<ol>
		<li>在麻醉前，对处于目标胚胎发育阶段的妊娠小鼠腹部进行剃毛以去除毛发，并使用化学脱毛剂处理腹部以清除残留毛发，随后用70%乙醇进行消毒。</li>
		<li>通过面罩给予妊娠小鼠氧气/异氟烷进行麻醉。初始麻醉使用3–5%异氟烷（溶于100%氧气），后续操作过程中维持1–1.5%浓度。通过轻捏小鼠脚爪和/或尾巴来确认其是否已充分麻醉。</li>
		<li>将小鼠仰卧位放置于加热至37 °C的小鼠操作台上，并用润滑剂覆盖眼睛，以防止角膜脱水。</li>
		<li>在电极上涂抹导电胶，将小鼠脚爪固定于电极上以监测心率、呼吸频率和心电图（ECG）。插入直肠温度计以监测体温。</li>
		<li>首先通过超声成像观察并计数胚胎，以确认小鼠妊娠状态。在腹部涂抹超声耦合剂，将扫描探头置于膀胱上方。为保持一致性，应先定位膀胱，再从膀胱位置开始，分别计数左侧和右侧子宫角内的胚胎。确保胚胎心脏正常搏动。</li>
		<li>若确认小鼠妊娠，使用黏土将培养皿固定于预定切口位置上方。轻轻按压培养皿使其与腹部直接接触。</li>
		<li>移开培养皿，再次对腹部进行消毒。在阴道上方约0.75–1 cm处做一条1.5–2 cm长的腹正中切口，打开腹腔和腹膜。注意避免损伤内脏器官。</li>
		<li>用镊子将左侧或右侧子宫角轻轻拉出，通过培养皿的硅胶膜小切口将其引出，并再次用黏土固定培养皿。避免过度牵拉或操作，以防子宫血管出血，导致母鼠和/或胚胎过早死亡。</li>
		<li>再次计数胚胎，以准确记录哪些胚胎已被注射。</li>
		<li>在子宫角上涂抹超声耦合剂，以便成像心脏并防止脱水。</li>
		<li>对首个待注射胚胎进行成像，检查胚胎心脏是否正常搏动，并记录胚胎的头尾方向和左右方位。如有必要，可轻微调整子宫角位置以确保正确方位。若调整困难，则转向下一个胚胎。</li>
		<li>小心用显微注射针穿刺子宫，将针头以45°角置于胚胎上方，略位于心包外侧（图3）。若需标记心外膜细胞，应以四腔心视图成像心脏，并将针头指向房室沟（图3）。若需调整角度，应先将针头退出，再重新定位。切勿在子宫内调整针头角度，以免针头断裂。避免穿刺其他组织，如肢体或胎盘。</li>
		<li>将针头移至心包壁并以轻柔但迅速的动作穿刺。通常会有一定阻力，但移动过快可能导致针尖刺入心脏本身。针尖最终应位于房室沟的心包腔内。若发生心包出血，血细胞会呈现白色雪花状图案。若出现此情况，应停止对该胚胎注射，并转向另一胚胎。</li>
		<li>注入注射液。每次最多向心包腔内注射700 nl，以避免对心脏发育产生不良影响。通过观察心包囊轻微、短暂的肿胀来确认注射是否到位。</li>
		<li>注射完成后，将针头退出，并确认仍可排出注射液，以确保针头未被组织碎片堵塞。</li>
		<li>调整操作台位置，以便成像并注射下一个胚胎。每侧子宫角最多注射3–4个胚胎，以避免麻醉时间过长，保留对侧子宫角作为对照胚胎，并确保操作未干扰胚胎正常发育。</li>
		<li>完成目标数量胚胎的注射后，清除多余的超声耦合剂，将子宫角轻柔地放回腹腔原位。</li>
		<li>关闭母体腹腔：使用一层缝线缝合腹膜和腹肌，再用第二层缝线缝合皮肤。</li>
		<li>给予小鼠首次镇痛药物注射。在停止麻醉前15分钟注射一次0.05–0.1 mg/kg的丁丙诺啡，并在之后每12小时追加一次，共追加三次。</li>
		<li>停止麻醉，监测小鼠术后恢复情况。将妊娠小鼠单独饲养于笼中，直至达到所需的随访周期。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Thomson, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+stem+cell+lines+derived+from+human+blastocysts%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts.</a> Science. 282, 1145-1147 (1998).</li>
<li>Takahashi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+adult+human+fibroblasts+by+defined+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors.</a> Cell. 131, 861-872 (2007).</li>
<li>Mummery, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+human+embryonic+stem+cells+and+induced+pluripotent+stem+cells+to+cardiomyocytes%3A+a+methods+overview%5BTitle%5D)+AND+%22Circ.+Res%22%5BJournal%5D)">Differentiation of human embryonic stem cells and induced pluripotent stem cells to cardiomyocytes: a methods overview.</a> Circ. Res. 111, 344-358 (2012).</li>
<li>Badylak, S. F., Taylor, D., Uygun, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-organ+tissue+engineering%3A+decellularization+and+recellularization+of+three-dimensional+matrix+scaffolds%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Biomed.+Eng%22%5BJournal%5D)">Whole-organ tissue engineering: decellularization and recellularization of three-dimensional matrix scaffolds.</a> Annu. Rev. Biomed. Eng. 13, 27-53 (2011).</li>
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<li>Van Vliet, P., Zaffran, S., Wu, S., Puceat, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+cardiac+development%3A+a+view+from+stem+cells+to+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovasc.+Res%22%5BJournal%5D)">Early cardiac development: a view from stem cells to embryos.</a> Cardiovasc. Res. In press, (2012).</li>
<li>Cai, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+myocardial+lineage+derives+from+Tbx18+epicardial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A myocardial lineage derives from Tbx18 epicardial cells.</a> Nature. 454, 104-108 (2008).</li>
<li>Boulland, J. L., Halasi, G., Kasumacic, N., Glover, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Xenotransplantation+of+human+stem+cells+into+the+chicken%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Xenotransplantation of human stem cells into the chicken.</a> J. Vis. Exp. , (2010).</li>
<li>Liu, A., Joyner, A. L., Turnbull, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alteration+of+limb+and+brain+patterning+in+early+mouse+embryos+by+ultrasound-guided+injection+of+Shh-expressing+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mech.+Dev%22%5BJournal%5D)">Alteration of limb and brain patterning in early mouse embryos by ultrasound-guided injection of Shh-expressing cells.</a> Mech. Dev. 75, 107-115 (1998).</li>
<li>Pierfelice, T. J., Gaiano, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrasound-guided+microinjection+into+the+mouse+forebrain+in+utero+at+E9.5%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Ultrasound-guided microinjection into the mouse forebrain in utero at E9.5.</a> J. Vis. Exp. , (2010).</li>
<li>Nagy, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cre+recombinase%3A+the+universal+reagent+for+genome+tailoring%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">Cre recombinase: the universal reagent for genome tailoring.</a> Genesis. 26, 99-109 (2000).</li>
<li>Buckingham, M. E., Meilhac, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracing+cells+for+tracking+cell+lineage+and+clonal%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Cell%22%5BJournal%5D)">Tracing cells for tracking cell lineage and clonal.</a> Dev. Cell. 21, 394-409 (2011).</li>
<li>Phoon, C. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+tools+for+the+developmental+biologist%3A+ultrasound+biomicroscopy+of+mouse+embryonic+development%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatr.+Res%22%5BJournal%5D)">Imaging tools for the developmental biologist: ultrasound biomicroscopy of mouse embryonic development.</a> Pediatr. Res. 60, 14-21 (2006).</li>
<li>Tiscornia, G., Singer, O., Verma, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+and+purification+of+lentiviral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Production and purification of lentiviral vectors.</a> Nat. Protoc. 1, 241-245 (2006).</li>
<li>Dyer, L. A., Patterson, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Novel+Ex+vivo+Culture+Method+for+the+Embryonic+Mouse%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vix.+Exp%22%5BJournal%5D)">A Novel Ex vivo Culture Method for the Embryonic Mouse.</a> J. Vix. Exp. , (2013).</li>
<li>Runyan, R. B., Markwald, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Invasion+of+mesenchyme+into+three-dimensional+collagen+gels%3A+a+regional+and+temporal+analysis+of+interaction+in+embryonic+heart+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Invasion of mesenchyme into three-dimensional collagen gels: a regional and temporal analysis of interaction in embryonic heart tissue.</a> Dev. Biol. 95, 108-114 (1983).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

上述描述的心内 ex vivo 注射方案旨在维持中期（E9.5–E11.5）小鼠胚胎心肌功能至少48小时。这些注射方法可实现对DNA或细胞的特定空间靶向注射。图1-3 中展示的少数示例验证了该技术可用于阐明发生在特定心脏区域（如心内膜或心外膜细胞的上皮-间质转化，EMT）的发育过程的 ex vivo 和 in vivo 分子机制。尤为重要的是，这些方案提供了一个在合适的胚胎环境中追踪注射细胞（如人胚胎细胞或人胚胎干细胞衍生物）迁移与命运的机会，这是此前尚未解决的挑战。in vivo 标记（如 图3 中的心外膜细胞）可通过染料或病毒的饱和或梯度稀释，实现对细胞（亚）群的短期和长期谱系示踪，而无需依赖Cre/lox技术（尽管联合使用这些技术也可能具有应用价值）。
在应用这些方案时观察到几个关键步骤。首先，胚胎对光极为敏感。因此，建议在体视显微镜下练习注射方案，以便每枚胚胎的操作可在15分钟内高效且高重复性地完成。同样，整个超声介导的注射过程应控制在...

十多年前，人类胚胎干细胞（HuESCs）已从人类囊胚中分离获得1自那时起，这些细胞已成为人类发育生物学中诸多未解问题的重要研究领域。人类胚胎干细胞（HuESCs）也为再生医学带来了希望。近年来，研究人员已从患者特异性的体细胞中成功生成人类诱导多能干细胞（iPSCs），为遗传性疾病的研究提供了新的模型2许多 体外 胚胎干细胞或诱导性多能干细胞向多种细胞谱系（包括心肌谱系）分化的实验方案3，已有报道。通常通过RNA和蛋白质表达分析、免疫染色和/或 体外 功能测试。然而，多能干细胞的衍生物必须被置于适当的胚胎环境中，以检测其是否完全获得与相应胚胎细胞相同的细胞命运，以及是否能够真实重现其胚胎对应细胞的发育过程 体内 功能会响应区域信号。尽管组织工程学前景广阔，但目前尚无法提供所有已知和未知的适当信号 体内 发育中的胚胎组织4,5.
利用染料或逆转录病毒载体对胚胎（包括小鼠胚胎）细胞进行标记，为心脏发育过程中细胞谱系的胚胎起源提供了重要信息6例如，将染料注入小鼠胚胎的心包腔 离体，随后 体外 离体心脏培养，用于标记心外膜细胞及其后代7然而，染料标记和逆转录病毒细胞标记主要应用于器官发育尚不完善的早期小鼠胚胎，或更易于操作的鸡胚胎8. 一个例外是大脑，在胚胎中更容易进行靶向操作9,10这种方法尚未应用于跳动的胚胎小鼠心脏。
为了补充使用染料或病毒进行的直接标记，并在更晚期的小鼠胚胎及成年小鼠中进行谱系示踪，研究人员已将细胞标记方法与利用Cre/Lox技术的转基因小鼠分析相结合。然而，Cre/Lox方法11存在一些局限性，这些局限性源于用于驱动重组酶表达的基因组调控区域在时空特异性方面的限制，以及Cre/Lox重组效率的不确定性12。此外，该方法无法完全回答由细胞迁移驱动的细胞命运获得这一特定问题，因为它只能在启动Cre表达的调控区域被激活后标记前体细胞。同时&#160;，由于明显的伦理问题，该方法也无法应用于人类胚胎。
鉴于这些局限性，我们设计了一系列新的实验方案，用于在胚胎发育E9.5及之后阶段，将多种细胞标记试剂（如荧光染料、病毒、shRNA等基因表达调控因子、基于DNA的细胞标记载体或细胞本身）注射到小鼠胚胎心脏的特定区域。
DNA/细胞注射采用体视显微镜和一种简单的显微注射装置相结合的方法 离体 胚胎培养至48小时，或分离心脏或胚胎外植体培养48–72小时。我们还报道了一种通过超声介导的显微注射技术在小鼠胚胎心脏中的应用方案 在子宫内 该技术可实现对胚胎发育过程的监测13 并可实现对注射物和/或标记细胞的长期随访。
我们发现，这些方法能够保持器官的功能，并提供比常规方法更具代表性的环境 体外 测试干细胞潜能，同时提供了追踪标记或注射细胞迁移以监测其命运的机会。最终，这将有助于更深入地理解区域组织的模式形成及关键生物学过程。

<table><tbody><tr><td>&lt;强&gt;装置/硬件&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>40 MHz 换能器</td><td>VisualSonics</td><td>MS550S</td><td></td></tr><tr><td>显微注射仪</td><td>VisualSonics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>显微注射仪</td><td>Eppendorf</td><td>5242</td><td></td></tr><tr><td>显微操作仪&amp;nbsp;</td><td>Eppendorf</td><td>5171</td><td></td></tr><tr><td>氮</td><td></td><td></td><td>需要加压注射器</td></tr><tr><td>轨道系统</td><td>VisualSonics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>旋转器</td><td></td><td></td><td>在培养箱内旋转含有胚胎的玻璃管</td></tr><tr><td>标准培养箱</td><td></td><td></td><td>5% CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;, 37 &amp;#176;C</td></tr><tr><td>体视显微镜</td><td>蔡司</td><td>发现。V8</td><td></td></tr><tr><td>Vevo 2100</td><td>VisualSonics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;强&gt;显微注射&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>硼硅酸盐毛细管</td><td>世界精密仪器公司</td><td>KTW-120-6</td><td>1.2-&amp;mu;m 外径</td></tr><tr><td>移液管拉制仪</td><td>Sutter</td><td>Model P87</td><td></td></tr><tr><td>显微注射针</td><td>Origio-Humagen</td><td>C060609</td><td>外径/内径 1.14 毫米/53 毫米，配 50/35 &amp;mu;m OD/ID 尖端</td></tr><tr><td>汉密尔顿注射器&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>培养皿</td><td></td><td></td><td>10厘米直径</td></tr><tr><td>矿物油</td><td>Sigma</td><td>M8410</td><td></td></tr><tr><td>硅膜</td><td>Visualsonics</td><td></td><td>4.3 x 4.3 厘米</td></tr><tr><td>培乐多</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>异氟烷</td><td>Vet One</td><td></td><td></td></tr><tr><td>脱毛剂&amp;nbsp;</td><td>Nair</td><td></td><td></td></tr><tr><td>眼用润滑剂</td><td>Optixcare</td><td>31779</td><td></td></tr><tr><td>导电凝胶（Signa）</td><td>Parker</td><td></td><td></td></tr><tr><td>缝合</td><td>Sofsilk 5-0</td><td>S1173</td><td></td></tr><tr><td>超声耦合凝胶</td><td>Aquasonic</td><td></td><td></td></tr><tr><td>布托啡诺（盐酸布托啡诺）</td><td>Reckitt Benckiser Pharmaceuticals Inc.</td><td>NDC 12496-0757-1</td><td>0.05-0.1 mg/kg 生理盐水</td></tr><tr><td>&lt;强&gt;其他&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>硅弹性体</td><td>道康宁</td><td>Sylgard 184</td><td></td></tr><tr><td>玻璃培养皿</td><td>Fine Science Tools</td><td></td><td>60 mm 直径</td></tr><tr><td>昆虫针</td><td>Fine Science Tools</td><td>26002-20</td><td></td></tr><tr><td>&lt;强&gt;培养基与培养试剂&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>OptiMEM 培养基</td><td>Life Technologies</td><td>51985026</td><td></td></tr><tr><td>M2 培养基</td><td>Sigma</td><td>M7167</td><td></td></tr><tr><td>杜尔贝科&amp;rsquo;s Eagle 培养基</td><td>Lonza</td><td>BE12-640F</td><td>高葡萄糖和50%大鼠血清</td></tr><tr><td>M16 培养基</td><td>Sigma</td><td>M7292</td><td></td></tr><tr><td>大鼠血清</td><td>让维埃</td><td>ODI 7158</td><td></td></tr><tr><td>青霉素/链霉素</td><td>Life Technologies</td><td>15140-12</td><td></td></tr><tr><td>氧气 40%</td><td>气液</td><td></td><td>需要为胚胎培养基供氧</td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>Fisher</td><td>RVJ35882</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>BD</td><td>356230</td><td></td></tr><tr><td>I型胶原蛋白</td><td>BD</td><td>354236</td><td>用于组织块培养的培养皿包被</td></tr><tr><td>培养皿</td><td>杜彻/橙色</td><td>131020</td><td></td></tr><tr><td>&lt;强&gt;注射剂&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CDCFDA-SE</td><td>Invitrogen/Molecular Probes</td><td>C1165</td><td>25 mg/ml DMSO。-20℃保存 &amp;#176;C. 使用前用生理盐水稀释1:100-200。</td></tr><tr><td>表达PGK-GFP的慢病毒&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td>~8E9 转导单位/ml DMEM</td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000</td><td>Life Technologies</td><td>11668019</td><td></td></tr></tbody></table>

发育中胚胎小鼠心脏的细胞标记与注射

Cell Labeling and Injection in Developing Embryonic Mouse Hearts

测试胚胎干细胞或多能干细胞衍生物的命运 体外 方案已导致有争议的结果，这些结果不一定反映其 体内 潜能。理想情况下，这些细胞应被置于适当的胚胎环境中，以获得其确定的表型。此外，利用染料或逆转录病毒载体标记细胞后在小鼠中进行的细胞谱系示踪研究，大多仅局限于器官发育尚不完善的早期小鼠胚胎。为克服这些局限性，我们设计了标准的以及超声介导的显微注射方案，可在小鼠胚胎发育至E9.5及更晚阶段时，将多种试剂靶向注射至心脏的特定区域。 &#160;胚胎外植体或胚胎随后进行培养或继续发育 在子宫内这些试剂包括荧光染料、病毒、shRNA 或干细胞来源的前体细胞。我们的方法能够在监测标记和/或注射细胞的迁移与命运的同时，保持器官的功能。这些技术可拓展至其他器官，将有助于解决发育生物学中的关键生物学问题。

使用上述注射方案，可将细胞标记和/或注射至小鼠胚胎心脏中。作为概念验证，展示了多个示例，其中采用了该注射方案以及相应的 离体 AVC外植体、离体心脏或全胚胎培养被联合使用（图1).
图1展示了细胞注射前胚胎的制备过程。将E9.5胚胎从蜕膜中取出，同时保持卵黄囊的完整性（图1A）。在心脏上方切开卵黄囊（图1B）。将移液管靠近（图1C）并注入细胞。心脏保持原有形态（图1D）并持续搏动。
为了研究发育生物学中更具体的生物学问题，例如上皮-间质转化（EMT），将针对调控心内膜细胞向内皮-间质转化所需蛋白的shRNA注射到E9.5期房室管（AVC）外植体中（图2A）。对照胚胎则注射空载体骨架。同样，在E10.5时将由HuES细胞衍生的、在Sox9启动子调控下表达GFP...

我们描述了一系列方法，用于在小鼠胚胎发育第9.5天（E9.5）及之后阶段，向胚胎内注射染料、DNA载体、病毒和细胞，以监测来源于胚胎或 pluripotent 细胞的内源性细胞及移植细胞的命运和表型。

测试胚胎干细胞或多能干细胞衍生物在体外实验方案中的命运时，已产生有争议的结果，这些结果不一定反映……

本实验的总体目标是对小鼠胚胎心脏进行细胞、染料或DNA的注射。为了研究细胞命运或实现基因表达的局部操控，首先从怀孕小鼠体内解剖出胚胎，并暴露其胚胎心脏。随后将DNA、染料或细胞注射至心脏中特定的目标区域。随后，在胚胎孵育后，取出心脏并进行体外培养。最后，通过显微镜观察确定注射或标记细胞的命运。最终，通过共聚焦显微镜或明场及落射荧光显微镜监测注射、标记或基因修饰细胞的命运，揭示特定基因和细胞在心脏发育过程中的功能重要性。与现有的小鼠转基因等方法相比，该技术的主要优势在于，我们能够将实验室培养或基因修饰的细胞在体内进行局部且精确地注射。这使得我们可以在适当的微环境中对这些细胞进行研究。接下来将由我以及来自实验室的博士研究生 Emily Aar 演示该实验操作。根据实验方案，在准备好仪器、试剂和溶液后，从安乐死的怀孕小鼠体内收集 E 9.5 和 E 10.5 胚胎。首先用 70% 乙醇对胸部进行消毒，沿腹中线做切口打开腹腔，取出子宫角，并将其转移至室温 PBS 中。在 PBS 中再清洗两次后，将其转移至盛有硅胶的培养皿中。使用 M 16 培养基，用昆虫针将子宫角固定在硅胶层上，使子宫的血管化面朝下。然后使用精细镊子切开子宫表面，并在表面以下一毫米处切除蜕膜。展开蜕膜壁，轻轻取出卵黄囊中的胚胎。在进行细胞注射前，将其保存在37摄氏度的M16培养基中以备注射。首先，使用汉密尔顿注射器从后端向玻璃移液管中加入DNA或细胞，并轻轻振荡移液管以去除气泡。然后将移液管尖端安装到显微注射持针器上，并根据以下参数设置注射仪。接着，通过卵黄囊将胚胎固定在硅胶底部，注意不要触碰胚胎本体。然后确定心脏区域，并在该区域上方切开心包膜。在胚胎周围插入四枚固定针，以防止细胞注射过程中发生移动。将显微操作仪设为手动模式，缓慢将移液器尖端以45度角置于心包上方，正对需要注射的心脏区域。将移液器移至目标区域，触发注射并尽快取出移液器。在DNA或细胞注射后，确保心脏正常跳动。使用本视频中所述的注射方案来研究上皮向间充质的转化过程，在E 9.5时期，向房室管（AVC）外植体注射了一种S-H-R-N-A，该分子可下调内膜细胞内皮-间充质转化所必需的一种蛋白质。对照胚胎则注射了空骨架载体。同样，在E 10.5时期，将由HUES细胞衍生的、在SOX9启动子调控下表达GFP的内皮前瓣膜细胞注射到房室管（AVC）中，随后进行48小时的离体心脏培养。这些细胞获得了类似于内源性心内膜细胞的上皮-间质转化（EMT）标志物，例如periostin。本文所示的离体方法相对简单，但仅限于最长48至72小时的短期随访。然而，文本方案中描述的超声引导注射操作虽然在技术上更具挑战性，却能够实现长期甚至出生后的宫内随访。本文展示了通过子宫内注射染料或病毒载体来标记特定心脏区域细胞的方法。利用该方法，可使用荧光染料或病毒特异性地标记心外膜细胞，并可通过更换细胞类型或注射物质对该方法进行拓展。在完成该操作后，可进一步进行胚胎培养等实验，以探究基因、分子的长期作用，或组织发育后形态发生等长期效应。该技术为心脏发育生物学与遗传学领域的研究人员开辟了道路。它使我们能够探索新基因的世界，同时在适当的胚胎环境中研究人类细胞命运。当缺乏可用的转基因小鼠品系时，这一方法尤为有用。

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Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

细胞标记和注射胚胎发展小鼠心脏

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本方案介绍了一种基于电穿孔技术在发育中鼠心心脏细胞中进行转基因操作的详细方法学框架。所提供的视频资料将有助于学习和掌握这一多功能技术。...

一种高效转基因方法用于小鼠胚胎心脏的基因递送

学习小鼠胚胎心脏细胞标记与注射技术，用于追踪细胞命运和局部调控基因表达。该方法结合显微注射与成像分析，揭示心脏发育中特定基因和细胞的功能重要性。

发育中胚胎小鼠心脏的细胞标记与注射

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