长期活体免疫荧光成像技术用于观察组织基质成分：基于落射荧光与双光子显微镜的方法 落射荧光显微镜，双光子显微镜，活体成像，免疫荧光，细胞外基质，胶原蛋白，基底膜，组织重塑，肿瘤微环境，炎症，纤维化

本实验的总体目标是通过对携带黑色素瘤的小鼠耳部进行活体免疫荧光成像，研究肿瘤组织中基质成分的动态变化。首先将表达GFP的B16F10黑色素瘤细胞接种至小鼠耳部，随后对手术耳部进行手术操作，分离腹侧与背侧耳皮肤，从而暴露肿瘤组织。

然后对耳背暴露的组织进行免疫染色。最后，将动物准备用于活体成像。最终，采用荧光体视显微镜或双光子显微镜观察肿瘤细胞及其基质成分的定位与动态行为。

与其它活体成像方法相比，该技术的主要优势在于，我们能够在纤维状和网状的细胞外基质环境中，对肿瘤细胞与基质相关细胞（如免疫细胞）之间的动态相互作用进行成像。因此，该方法有助于解答肿瘤生物学领域中的关键问题，例如肿瘤细胞如何与其物理微环境相互作用，进而为理解肿瘤的进展机制提供重要线索。实验操作的某些部分将由本实验室的高级科学家Vita Kki进行演示。在准备用于注射的肿瘤细胞时，首先培养B16F10 GFP黑色素瘤细胞。

离心后，将细胞转移至一个1.5毫升离心管中，再次离心，除去上清液，仅保留紧贴细胞沉淀上方的一薄层培养基，将细胞重悬形成浓稠的细胞悬液，随后将该细胞悬液加载至10微升体积的Hamilton注射器中。取下连接的33号针头的针帽，将20微升细胞悬液加至针头腔顶部。

然后回拉活塞，直至吸入五微升（5 µL）的悬液至注射器内。使用注射麻醉剂对C57BL/6小鼠进行麻醉后，剃除小鼠头部的毛发，清除耳部及周围区域的毛发，并用水冲洗。使用胶带将耳部近端边缘固定于食指指尖。

将 Hamilton 注射器针头插入 C57 黑六小鼠耳部的背部真皮与软骨之间，从近端向远端穿透耳部约 2 至 3 毫米。注入细胞悬液后，缓慢将针头从皮肤中退出。让肿瘤细胞在 7 至 9 天内形成实体瘤，并使用荧光显微镜监测肿瘤生长情况。

使用湿润的氧气和异氟烷混合气体对小鼠进行麻醉后，将小鼠置于37°C的加热垫上，并轻轻夹捏脚趾以确认动物已充分麻醉。在眼睛上涂抹眼用软膏，并在整个实验过程中将小鼠保持在由直肠热敏电阻控制的加热垫上。

接下来，将带有肿瘤的耳朵轻轻放置在一堆玻璃载片上。然后使用小条的胶带，用解剖刀沿小鼠耳廓的对耳轮切开耳腹侧皮肤，固定耳缘的前部和后部。借助弯头镊子将耳部的胶带移除。

轻轻剥离腹侧真皮和软骨，使其与背侧真皮分离。用林格氏液冲洗耳部，以进行免疫荧光染色。将针对细胞外基质分子的一抗加入封闭缓冲液中，滴加于暴露的耳部组织，然后盖上盖玻片。

使用约五毫升林格缓冲液清洗耳部两次，每次孵育15分钟。在封闭缓冲液中加入适当的二抗或链霉亲和素。加盖盖玻片，孵育15分钟后，同前法清洗两次。将开放的真皮区域折叠入EM mencia conki中，并用无菌擦拭巾干燥外部未打开的耳部真皮。

将耳部置于一叠玻璃载片上，并在耳部前侧和后侧的背缘涂抹0.5微升手术胶，以固定耳部，用于两小时或更短时间的成像。在固定好的耳部上方加入新配制的无菌山梨酸林格缓冲液，并加盖盖玻片。然后使用配备双透镜的荧光体视显微镜对耳部进行成像。

用于长期成像。将连接至含有山梨酸林格液储液器的针头出口置于盖玻片下，距离耳部约0.5厘米处。使用蠕动泵以每分钟1 µL的速度持续向腔室输送缓冲液。

打开采集软件。调节增益、荧光强度、放大倍数和曝光时间图像，选择包含肿瘤细胞以及染色的细胞外基质蛋白的多个视野，使用硅脂进行多光子显微镜活体成像，从耳部基底部开始。

在耳朵周围构建一个直径约两厘米、高两到三毫米的环形壁。用山梨酸林格液填充该环形区域。将小鼠放置在加热垫上的载物台上，加热垫温度设置为37摄氏度，并根据文本方案配置显微镜的参数设置。

如图所示，经过免疫染色后，可根据形态学特征区分多种结构。对于胶原蛋白四或前连蛋白等基底膜成分，尤其是通常无法通过二次谐波生成（SHG）检测到的结构蛋白，可实现经典的基质检测方法的可视化。

例如，我们发现 tens 和 C 沉积在肿瘤间质的不同位置，而肿瘤微环境中产生的纤维状胶原所受的力可能导致肿瘤基质的扩张或收缩，从而引起肿瘤血管系统的重塑，类似于伤口愈合过程。在此，我们展示了可以进行双光子时间序列显微成像，同时对免疫标记的 tens 和 C 基质进行成像，即使在高光子密度的双光子显微镜下，也能最大程度减少荧光染料的光漂白。在本视频中，覆盖于预先用胶原四染色的暴露真皮上的肿瘤细胞黏附于组织，并成群地沿着血管和脂肪组织部位的基底膜开始集体迁移。

掌握整个耳部切开及免疫染色流程后，操作时间约为两小时。观看本视频后，您应能够充分理解如何利用表观荧光或双光子显微镜技术，通过活体免疫染色方法研究肿瘤中的细胞与基质相互作用。