BEST：条形码标记的四分体测序

本实验的总体目标是通过酵母杂交产生大量重组子代，同时保留哪些子代来源于同一原始四分体的信息。这一目标首先通过将用于杂交的杂合二倍体菌株用含有四分体特异性条形码和孢子形成特异性荧光报告基因的质粒文库进行转化来实现。第二步是将带有条形码的细胞转移至孢子形成培养基中。

这使得四分体能够形成，并在四分体中诱导GFP荧光报告基因的表达，而在未能产孢的细胞中则不表达。接下来，流式分选仪将带有荧光标记的四分体与其他细胞分离，并直接将其沉积到琼脂平板上，在此处四分体的外层包被被酶解消化。最后一步是使用玻璃珠将已消化的四分体中的孢子分离并均匀分散在琼脂平板表面，使每个孢子能够形成独立的菌落。

最终，将使用高通量多重 DNA 测序方案对通过该方法获得的菌株进行基因分型，以读取每种菌株的四特异性条形码。随后利用这些条形码鉴定单次减数分裂事件所产生的四种菌株。该技术相较于现有方法（如使用显微操作仪进行人工四孢子囊解剖）的主要优势在于，一名研究人员可在数小时内分离出数千个重组子代。

本研究中使用的二倍体酵母细胞此前已用条形码质粒文库进行转化，具体方法见配套文稿，并于负80摄氏度保存，以便从冷冻菌株中复苏细胞。在30摄氏度下，用5毫升YPD培养基加200微克/毫升G418振荡培养过夜。次日，用PBS将过夜培养物中的细胞洗涤三次，然后重悬于2毫升孢子形成培养基中，终体积为2毫升，含200微克/毫升G418。

在室温下振荡培养孢子形成培养物。每天监测孢子形成进程，直至不再有新的四分孢子形成。通常，当培养物中已出现形态良好的四分孢子且二分孢子相对较少时，此过程需要两到四天。

将培养物从振荡环境中取出，在室温下静置至少七天后再进行四分孢子分离。该操作中最困难的部分是获得良好的孢子分离效果。我们通过经验发现，在四分孢子分离前，将完成孢子形成的培养物在室温下静置至少一周而不进行振荡，可显著改善孢子的分离效果。

可以通过荧光激活细胞分选或流式细胞分选（fax）检测并分离来自孢子形成培养物的四分体，这是因为二倍体细胞中的条形码质粒还携带了一种孢子形成特异性的GFP融合蛋白。本文所述方案是为FACSAria II仪器开发的。开始该实验步骤时，将孢子化培养物上样至流式分选仪，并设置两个前向散射和侧向散射门，以排除碎片、成团细胞以及每个液滴中含多个细胞的情况。

应存在一群荧光细胞，当使用 PS 二质粒 GFP 报告构建体时，其中包括二分体和四分体，需在 GFP 对 FSC 的图中设门以包含这些荧光事件。根据菌株背景的不同，可能需要额外设门以去除包含四分体及其他细胞的聚集体。检查荧光事件的 FSC 直方图。

在此示例中，左侧峰中的事件主要为四分体，右侧峰中的事件通常为带有出芽的四分体；应用最终门控，包含FSC较低且主要为四分体的事件，如红色条带所示。通过将约1,500个四分体分选至载玻片上，并统计四分体与非四分体的比例，来检查门控策略的效率。使用相差显微镜在400倍放大倍数下，仅需计数约200个已分选的事件即可准确估算四分体百分比，但分选约1,500个事件可减少在载玻片上寻找细胞所花费的时间。

这些明场图像放大 600 倍。在分选孢子四分体后，左侧显示四分体的示例，右侧显示非四分体的示例。通过将 25 个四分体分选到显微镜载玻片上，并在 400 倍放大下使用相差显微镜观察液滴中的细胞，定期检查分选仪报告事件数量的准确性。

每个液滴中应含有25个四分体。重复三到四次，以评估本次运行中fax仪器的变异程度。将所需数量的YPD加G四18琼脂平板置于37摄氏度培养箱中预热至少1.5小时，放置位置应靠近fax分选仪，以备后续操作使用。

分选方案的一个关键特征是能够将荧光分选的四分孢子准确地靶向到含有X溶液混合物的琼脂平板上的特定位置。为此，首先将一个带有标记的96孔板放置在分选仪的自动细胞沉积单元上。接着，设计一种分选布局，将25个四分孢子分选至96孔板中的一个孔内。

采用每孔25个四联体的分选模式可获得分离良好的菌落。选择靠近平板中央的孔，例如D5孔。

从37摄氏度培养箱中取出一叠10个琼脂平板，带到分选仪旁。取其中一个琼脂平板，用移液器将25 µL ZY溶液滴加到平板中心附近的琼脂表面。然后将该平板放置在定位用的96孔板上，使X液滴对准目标位置。

选择之前确定的孔位。即 D5 孔。开始分选，并将 25 条幼鱼分选至琼脂平板上的 Zy 液滴中央。

取出并盖上培养板。对每块培养板重复上述分选操作，直至在叠放的每块板上的 zamo 液滴中均分选出 25 个四分体。将含有四分体的培养板叠放后放回 37 摄氏度培养箱中。

将下一叠10个培养皿移至分选器，并重复分选操作。在含有四分孢子的琼脂培养皿于37摄氏度下孵育1.5小时后，即可进行孢子分离。开始此操作时，向每个培养皿中加入15至25个无菌的3毫米玻璃珠，将培养皿分为两叠（每叠5个），振荡3至5分钟。

最佳的孢子分离效果可通过将培养皿 rigidly 从一侧移动到另一侧或从前向后实现。不要以导致 beads 沿培养皿外缘旋转的方式移动培养皿。操作结束后，将 beads 留在培养皿上。

将带有珠子的一面朝上的培养皿叠放至30摄氏度培养箱中。从37摄氏度培养箱中取出下一叠培养皿，使用珠子重复孢子分离步骤。在分离孢子后的第二天，将所有培养皿于30摄氏度培养箱中过夜培养。

从30摄氏度培养箱中小心取出培养板，避免扰动玻璃珠。培养板上应已形成微小菌落。将培养板小心且迅速地倒置在深容器上方，以移除玻璃珠。

倒置平板后轻敲其底部，有助于使粘附在平板上的珠子脱落。容器应足够深，以接住脱落的珠子，防止珠子弹起后撞击琼脂平板。计数每个平板上的菌落数量，并利用菌落数来估算孢子分离与回收的效率。

例如，对于存活率接近 100% 的杂交，每个平板接种 25 个四分体，若平板上菌落数量充足（如高于 65 个）且存活率较高，则每个平板可获得总共约 100 个菌落。将每个菌落中的杂交转化细胞转移至含有 YPD 液体培养基并添加 G418 的 96 孔板中的独立孔内。同时记录哪些孔中的菌落来源于同一琼脂平板。

该信息将用于后续辅助四分体的分配。使用软件可以显著提高从四分体中分离孢子的速度。尽管当前版本的方法在效率上相比手动解剖略有损失，但已利用二项分布根据成功回收的所有孢子比例，计算出至少有一个成功回收的孢子并形成1、2、3或4个菌落的四分体的预期比例。

该图可作为本研究中最终组装成三孢子或四孢子子囊孢子（tetras）的菌株数量的粗略参考。随着每块平板上菌落数量的增加，回收得到的完整子囊孢子数量也随之增加。在149块琼脂平板上接种了约25个辐射单位（rads）的样本，其孢子活力经手动解剖测定接近100%。

每个平板上观察到的最大菌落数为80，表明有20个孢子未能形成独立的菌落。每个平板上的平均菌落数为62。从61个含有65个或更多菌落的平板中，共收集并测序了3,354个菌落。在通过测序质量控制的3,700个菌株中，有2,665个（占72%）可通过计算被分配到三个或四个孢子四分体中。一旦掌握。

该技术每小时可处理超过一千个四分孢子。然而，若操作时间超过三小时，则需要协助。