Name: 人中性粒细胞流动室粘附实验 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-07-02T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 42 s
Description: 学习使用流动室实验技术定量分析人中性粒细胞在剪切应力下的粘附特性。该方法通过分离外周血中性粒细胞并组装流动室系统，可研究粘附分子与内皮细胞的相互作用机制。

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本研究由狼疮研究研究所（纽约，纽约）、美国国立卫生研究院 P01-AR49084 项目、R21-DA026956 项目以及 UL1-TR00165 项目资助。我们感谢 Robert P. Kimberly 博士的持续支持。

本研究招募的所有供体均签署了书面知情同意书，且本研究已获得阿拉巴马大学伯明翰分校机构审查委员会的批准。
1. 人脐静脉内皮细胞的原代培养与传代
<ol>
	<li>培养人脐静脉内皮细胞（HUVEC） 体外 在完全生长培养基中培养，该培养基由内皮细胞基础培养基（见材料列表）添加内皮细胞生长因子组成。 
	注意：本研究中使用的生长因子包括：5 ng/ml 人重组表皮生长因子（hEGF）、1.0 mg/ml 氢化可的松、50 mg/ml 庆大霉素和 50 ng/ml 两性霉素-B（GA-1000）、2% 胎牛血清（FBS）、0.5 ng/ml 血管内皮生长因子（VEGF）、10 ng/ml 肝素化人碱性成纤维细胞生长因子（hFGF-B）、20 ng/ml 人重组胰岛素样生长因子（R3-IGF-1）、1 µg/ml 抗坏血酸和 22.5 µg/ml 肝素。完全培养基最初在 37 °C 下配制，随后可于 4 °C 保存，并在1周内使用&#160;准备月份</li>
	<li>为细胞培养瓶准备培养基时，将完全培养基加入75 cm²培养瓶中2 组织培养瓶（1 ml/5 cm）2）然后将烧瓶置于37 °C、5% CO₂条件下平衡2 在湿润的培养箱中孵育至少30分钟。将人脐静脉内皮细胞（HUVEC）直接接种至该已平衡的培养瓶中，接种密度为2,500–5,000个细胞/cm²。2.</li>
	<li>在培养基平衡的同时，将原代 HUVEC 冻存管在 37 °C 水浴中快速解冻。通过涡旋振荡使细胞在原冻存管中充分分散，随后直接加入含有预平衡完全培养基的培养瓶中，使细胞密度达到 2,500–5,000 个细胞/cm²。2轻轻摇动培养瓶以均匀分散细胞，然后将培养瓶放回培养箱中。这些细胞现代表第1代st 传代</li>
	<li>每两天更换一次培养基，直至细胞融合度达到70-80%。</li>
	<li>现在可以使用胰蛋白酶/EDTA从培养瓶中收获HUVECs。首先从培养瓶中吸除培养基，随后用PBS洗涤以去除细胞上残留的蛋白质和钙离子。加入0.25%胰蛋白酶-EDTA溶液，2–6分钟内应在光学显微镜下观察到细胞脱落。</li>
	<li>当90%的细胞从培养板上变圆并脱离时，加入等体积的2倍浓度胰蛋白酶抑制剂以终止消化。为便于收集细胞，再加入等量的完全培养基。将脱离的细胞转移至无菌的15 ml离心管中。</li>
	<li>在室温下以 225 × g 离心脱落的细胞 5 分钟。吸除上清液，然后将细胞重悬于 2–3 ml 完全培养基中。使用血细胞计数板和台盼蓝染色测定细胞浓度和活力。</li>
	<li>为了利用收获的细胞进行研究，将额外的75 cm²培养瓶重新接种细胞2 细胞密度为10,000个细胞/cm²的培养瓶2 并进入步骤2.2。或者，细胞可在此时冷冻以供后续研究。进行细胞冷冻时，于室温下以225 × g离心5分钟收集细胞。吸除上清液，将细胞沉淀重悬于含10% DMSO的FBS中，细胞浓度为1 × 106 细胞/ml。然后将细胞悬液转移至冻存管中，并置于细胞冻存盒内冷冻后，于 -80 °C 保存。</li>
</ol>
2. 人脐静脉内皮细胞层的制备
<ol>
	<li>使用冷冻 2nd 传代人脐静脉内皮细胞：复苏与培养。若使用处于活跃生长期的细胞，可直接进行步骤2.2。
	<ol>
		<li>解冻含有2的冻存管nd 将步骤1.8中的HUVECs在37 °C水浴中快速解冻。将细胞从冻存管转移至15 ml无菌离心管中，并加入10 ml生长培养基。</li>
		<li>在室温下以200 × g离心5分钟，弃去上清液以去除残留的DMSO。</li>
		<li>用完全培养基重悬细胞沉淀，并将细胞转移至75 cm²培养瓶中。2 烧瓶。加入培养基至总体积约20–25 ml，在37 °C、5% CO₂条件下培养2.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>每天观察细胞培养的融合度，并每两天更换一次培养基。通常在2-4天内，细胞融合度可达80%-90%，此时细胞可用于流室实验。</li>
	<li>为准备流室实验中使用的培养皿（见第5节），向一个35 mm组织培养皿中加入1 ml浓度为10 µg/ml的纤连蛋白溶液和0.05%（w/v）明胶，用移液器反复吹打数次，确保整个培养皿表面被均匀覆盖。去除多余的纤连蛋白和明胶溶液，将培养皿在空气中干燥至少30分钟，以优化蛋白质基质的形成。纤连蛋白和明胶溶液最多可重复使用10次。</li>
	<li>按照步骤1.5–1.7所述方法，使用胰蛋白酶-EDTA从步骤2.2中收获HUVEC细胞。将500,000个细胞接种至每个包被的组织培养皿中。每个培养皿中加入2 ml生长培养基，于37 °C、5% CO₂条件下培养2.</li>
	<li>让细胞按步骤2.2所述生长至融合。每天应进行显微观察，并每两天更换一次培养基。在进行流室实验前，使用20 ng/ml人TNF-α对HUVEC预处理4–6小时，以促进并诱导黏附分子的表达。</li>
</ol>
3. 纯化配体包被
<ol>
	<li>用记号笔或钢笔在35 mm组织培养皿的中央画一个直径为0.5 cm的圆。</li>
	<li>在标记区域内加入20 µl浓度为20 µg/ml的蛋白A。用移液枪头将蛋白A溶液均匀涂布，使其完全覆盖直径0.5 cm的圆形区域。注意不要触碰或刮伤培养皿表面。37 °C孵育1小时。</li>
	<li>用1 ml PBS（pH 8.0）将蛋白A包被的培养皿洗涤3次&#160;。</li>
	<li>在标记区域内加入50 µl 1% BSA以封闭培养皿上的非特异性结合位点。4 °C孵育2小时。</li>
	<li>同第3.3步，用1 ml PBS将封闭后的培养皿洗涤3次&#160;。</li>
	<li>配制用于包被的Fc黏附受体配体融合蛋白溶液。本实验中使用的是在PBS（pH 8.0）中浓度为25 µg/ml的ICAM-1/Fc融合蛋白溶液和浓度为0.5 µg/ml的P-Selectin/Fc融合蛋白溶液。</li>
	<li>在标记区域内加入50 µl底物溶液，4 °C过夜孵育。包被后的培养皿应在两天内使用，且包被区域不得干燥。必要时可添加PBS，以维持培养皿上50 µl的溶液量。</li>
</ol>
4. 中性粒细胞分离（所有步骤均在室温下进行）
<ol>
	<li>在获得知情同意后，通过静脉穿刺采集受试者血液至含抗凝剂的采血管或真空采血管（EDTA 或肝素）。采血后，在分离前以 PBS 按 1:1 比例稀释血液。</li>
	<li>在 50 ml 离心管中制备两层 Ficoll 液用于分离外周血单个核细胞（PBMC）和中性粒细胞。首先加入 15 ml 高密度 Ficoll（参见材料列表，ρ=1.118–1.120），然后小心地在高密度 Ficoll 上层叠加 10 ml 低密度 Ficoll（参见材料列表，ρ=1.077–1.080）。低密度与高密度 Ficoll 之间应形成清晰的界面。最后，将 25 ml 稀释后的血液样本小心地叠加在低密度 Ficoll 上层，避免扰动 Ficoll 层。</li>
	<li>在室温下以 250 × g 离心 30 分钟。注意：离心过程中应关闭离心机转子刹车，以减少离心结束时转子减速对细胞分离层的潜在扰动。离心后，从上至下依次可见以下各层：最上层为血浆，其下为位于低密度 Ficoll 上方的 PBMC 层，中性粒细胞层（含少量红细胞，RBC）位于低密度与高密度 Ficoll 之间，随后是高密度 Ficoll 层，最底层为红细胞。</li>
	<li>用移液管收集并转移中性粒细胞层至新的 50 ml 离心管中，加入 PBS 至终体积 50 ml，于室温下以 225 × g 离心 10 分钟。
	<ol>
		<li>离心后，中性粒细胞中可能仍混有红细胞。吸除上清液至剩余 10 ml。通过轻轻振荡离心管（或短暂低速涡旋）重悬中性粒细胞与红细胞沉淀，再用 50 ml PBS 洗涤一次。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>第二次洗涤后，吸除上清液。为去除污染的红细胞，通过振荡（或短时涡旋）将沉淀细胞在残留的 PBS 中重悬，加入 25 ml H2O，轻柔涡旋 10 秒以裂解红细胞。
	<ol>
		<li>加入 25 ml 1.8% NaCl 溶液，并立即在室温下以 225 × g 离心 10 分钟。此时污染的红细胞应已被裂解，留下白色中性粒细胞沉淀。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>用 PBS 洗涤中性粒细胞沉淀。</li>
	<li>将分离得到的中性粒细胞重悬于含 10% 胎牛血清（FBS）的 RPMI 培养基中，使用血细胞计数板在光学显微镜下测定细胞浓度。</li>
	<li>用完全 RPMI-10% FBS 培养基将细胞密度调整至 500,000 个细胞/ml。</li>
</ol>
5. 流动腔黏附实验
<ol>
	<li>
	组装流室。将含有融合生长的 HUVECs 或纯化的黏附受体配体的 35 mm 培养皿放置在显微镜载物台上。将平行板流室连接至注射泵和真空系统，并留出一条通路用于中性粒细胞输入。将流室置于培养皿上方并固定流室组件13。（见图1）
	</li>
	<li>启动连接显微镜的计算机上的视频录制程序。调节显微镜的视野和焦距，直至观察到清晰的视野，其中包含完全生长的 HUVEC 细胞或配体包被区域内的视野。</li>
	<li>使用注射泵以 RPMI 培养基冲洗流室。确保流室内或中性粒细胞输入管路中无气泡存在。</li>
	<li>如需要，可用低剂量（10-8 M）fMLP 对中性粒细胞进行 10 分钟的预激活处理。此步骤可使不同供体来源的中性粒细胞基础激活水平保持一致14。</li>
	<li>使用注射泵以设定流速（本研究中采用 350 µl/min，相当于剪切应力为 1.5 dynes/cm2）将中性粒细胞注入流室。开始视频录制。由于中性粒细胞黏附可能发生较快，通常录制 4–5 分钟的视频已足以用于定量分析黏附事件。</li>
	<li>黏附细胞的定义为：在 HUVEC 或配体包被表面，5 秒内移动距离小于一个细胞直径的细胞15,16。根据此标准，统计录制视频视野中黏附细胞的总数。通过记录不同供体中性粒细胞在相同时长下的视频，可计算每分钟黏附细胞数，从而比较不同供体间的黏附特性。</li>
</ol>

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

本方案指导在剪切应力条件下对轻微活化的中性粒细胞进行分离与纯化，以精确量化中性粒细胞黏附。中性粒细胞黏附是炎症过程中的关键环节。已有研究表明，该过程中多种分子的遗传变异可增加自身免疫性疾病的发生风险1,2一种能够定量评估人中性粒细胞牢固黏附能力的检测系统是必需的。本方案所述方法可在受控条件下，精确且定量地测定中性粒细胞的牢固黏附潜能 体外 在单纯剪切应力环境下的中性粒细胞黏附情况。该方法因而能够对不同基因型个体间的中性粒细胞黏附进行直接的定量比较，以确定黏附分子遗传变异在其中的重要性14.
该方法中的多个步骤需要仔细考虑，以获得高度定量且可重复的结果。在制备HUVEC时，使用流动腔前必须确保细胞达到100%汇合。若使用纯化配体包被的表面，包被区域绝不能干燥，以避免配体变性。此外，人中性粒细胞的制备对实验成功至关重要。从血液中分离中性粒细胞的关键问题包括轻柔操作、尽量减少涡旋以避免细胞活化，以及将细胞保持在室温条件下（即 血液不应在冰上保存，离心步骤应在室温下进行，并尽可能在最短时间内完成细胞分离和实验操作。此外，也可采用其他中性粒细胞分离方法来制备适用于这些检测的细胞。17,18.
从实际操作角度来看，使用 freshly isolated 的人中性粒细胞进行黏附实验应在受试者静脉采血后3-6小时内开始&#160;。由于中性粒细胞对操作极为敏感，采血与实验之间的长时间间隔可能影响实验结果。在进行流式腔实验前，精确测定中性粒细胞浓度也是获得准确且可重复结果的必要步骤。
在流室实验过程中，必须仔细监控视频记录，以确保在整个实验期间流速保持恒定且无湍流现象。若出现流速变化或存在湍流，则需要重复实验。实验结束后，还需通过显微镜评估剩余的中性粒细胞，以确认中性粒细胞未发生聚集。此时若出现聚集现象，表明中性粒细胞已被激活，这可能在实验过程中显著改变中性粒细胞的密度。
流室可在室内产生接近均匀的剪切应力（τ=6Qμ/(wh2)，其中 Q=流速，μ=动态黏度，w=流室宽度，h=流室高度15）。在我们的研究中，中性粒细胞黏附实验采用 350 µl/min 的流速，由此产生的剪切应力为 1.5 dynes/cm2（w=0.25 cm，h=0.01 in.，黏度采用 37 °C 下水的黏度（0.007 poise）作为 RPMI 培养基黏度的近似值）。对于特定的流室，可通过调节流速以实现不同水平的剪切应力，从而模拟不同的生理条件。人体血管中典型的生理剪切应力范围为 0.5–5.0 dynes/cm13,16。其他血管及其他动物中的剪切应力值列于表 1113,16,19&#160;20中。
尽管我们的方法主要聚焦于人中性粒细胞黏附的研究，但该方法并不局限于中性粒细胞，只需进行简单修改，即可轻松应用于其他细胞类型的黏附或滚动研究。此外，该方法中的底物也可根据不同的实验目的进行更换。
尽管本方案易于适应不同的研究，但仍存在一些局限性。本方案在此处的实施需要大量原代细胞用于分析，这可能限制了从小型动物获取的原代细胞的分析应用。此外，需要将纯化的黏附配体以具有活性/可及性的构象固定在表面，这可能会限制可使用的配体范围。使用Fc融合蛋白可显著提高配体在板表面形成正确构象的可能性。尽管如此，本方法仍具有显著的灵活性，可用于对黏附事件进行定量分析。这些研究将极大增进我们对黏附受体-配体对以及这些蛋白中遗传变异潜在功能重要性的理解，并有助于揭示其在人类疾病发病机制中的作用。

现已认识到，β2整合素及其ICAM配体中的遗传变异与自身免疫性疾病的发生相关1,2。为了理解这些变异如何参与自身免疫性疾病的发病机制，有必要确定来源于携带这些变异个体的细胞中这些变异的功能性后果。此类功能研究有助于阐明自然发生的遗传变异如何在健康和疾病状态下调控免疫应答的机制。以系统性红斑狼疮（SLE）为例，目前我们已知ITGAM（CD11b）及其配体ICAM-1的变异与疾病的发生密切相关1,2。由于中性粒细胞在炎症反应中起关键作用，对中性粒细胞黏附的定量研究可能揭示ITGAM/ICAM遗传变异如何影响炎症反应的机制。
中性粒细胞牢固黏附于内皮细胞（EC）是一个高度调控的过程，在炎症反应中发挥关键作用3,4。中性粒细胞的牢固黏附发生在其最初在内皮细胞上滚动和被捕获之后，最终可在体内导致跨内皮迁移。in vivo。这些过程涉及多种黏附分子，包括内皮细胞上的ICAM-1、ICAM-2、P-选择素、E-选择素以及中性粒细胞上的β2整合素5-9。因此，精确量化携带不同黏附分子等位基因变异的供体中性粒细胞的黏附能力，对于理解这些遗传变异的功能性及病理学后果至关重要。
流动室的实验应用可产生 体外 具有类似于血管环境中所观察到的流体剪切应力的环境 体内10-12确实，结合人脐静脉内皮细胞（HUVEC）的流室实验可以模拟 体内 血管环境。利用该方法，可研究细胞对内皮细胞的整体黏附特性。此外，流动腔室的高度可控环境还可用于评估细胞与纯化的黏附配体（如ICAM-1）的结合，从而有助于特定受体-配体相互作用的研究。
本文介绍一种利用流动腔黏附实验系统来研究人外周血中性粒细胞对人脐静脉内皮细胞（HUVEC）及纯化配体基质黏附特性的方法。利用表达不同黏附分子等位基因变异体的供体细胞进行该方法，可评估这些遗传变异如何影响人中性粒细胞的牢固黏附。

<table><tbody><tr><td>0.25% 胰蛋白酶/EDTA</td><td>Life technologies</td><td>25200-056</td><td>含酚红</td></tr><tr><td>2x 胰蛋白酶抑制剂</td><td>Life technologies</td><td>R-002-100</td><td></td></tr><tr><td>35 mm 组织培养皿</td><td>Corning Inc.</td><td>430165</td><td>标准组织培养处理表面</td></tr><tr><td>75 cm&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt; 组织培养瓶</td><td>Corning Inc.</td><td>430641</td><td>标准组织培养处理表面</td></tr><tr><td>CCD 相机</td><td>Dage-MTI</td><td>Model 300T-RC</td><td></td></tr><tr><td>细胞冻存容器&amp;nbsp;</td><td>Biocision</td><td>BCS-045</td><td></td></tr><tr><td>EBM-2</td><td>Lonza Inc.</td><td>CC-3156</td><td>HUVEC 增殖基础培养基</td></tr><tr><td>EGM-2 Bulletkit</td><td>Lonza Inc</td><td>CC-4176</td><td>基础培养基用 HUVEC 生长因子</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Life technologies</td><td>10082-147</td><td>认证，热灭活</td></tr><tr><td>明胶</td><td>Sigma</td><td>G9391</td><td>来源于牛皮</td></tr><tr><td>血细胞计数板</td><td>Fisher scientific</td><td>02-671-51B</td><td></td></tr><tr><td>纤维连接蛋白</td><td>Sigma</td><td>F2006</td><td>来源于人血浆</td></tr><tr><td>流式腔室</td><td>Glyco Tech</td><td>31-001</td><td>适用于 35 mm 培养皿的圆形流式腔室</td></tr><tr><td>fMLP</td><td>Sigma</td><td>47729</td><td></td></tr><tr><td>Histopaque-11191</td><td>Sigma</td><td>11191</td><td>高密度 Ficoll</td></tr><tr><td>HUVEC</td><td>Lonza Inc.</td><td>CC-2517A</td><td></td></tr><tr><td>ICAM-1</td><td>R&amp;D Systems</td><td>720-IC</td><td>Fc 嵌合体</td></tr><tr><td>淋巴细胞分离液</td><td>Mediatech Inc.</td><td>25072CV</td><td>低密度 Ficoll</td></tr><tr><td>显微镜</td><td>Zeiss</td><td>Axiovert 100</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 培养基</td><td>Life technologies</td><td>11875</td><td>含 L-谷氨酰胺和酚红</td></tr><tr><td>蛋白 A</td><td>Sigma</td><td>P6031</td><td>用 PBS 重悬</td></tr><tr><td>P-选择素</td><td>R&amp;D Systems</td><td>137-PS</td><td>Fc 嵌合体</td></tr><tr><td>注射泵</td><td>KD Scientific</td><td>KDS270</td><td></td></tr><tr><td>TNF-&amp;#945;</td><td>Life technologies</td><td>PHC3015</td><td>重组人源蛋白</td></tr><tr><td>台盼蓝溶液，0.4%</td><td>Life technologies</td><td>15250-061</td><td></td></tr></tbody></table>

人中性粒细胞流室黏附实验

Human Neutrophil Flow Chamber Adhesion Assay

中性粒细胞牢固黏附于内皮细胞在生理与病理状态下的炎症过程中发挥着关键作用。中性粒细胞牢固黏附的过程涉及多种不同的黏附分子，包括β整合素家族成员2 整合素家族及其与ICAM家族的对应受体。最近，在β2 据报道，整合素和ICAMs与自身免疫性疾病相关。因此，研究携带这些黏附分子不同等位基因形式的个体中性粒细胞的定量黏附能力，对于阐明自身免疫发病机制具有重要意义。流动腔系统中的黏附实验可模拟类似于血管内环境的流体剪切应力条件。 体内在此，我们介绍一种利用流动腔实验系统来研究人外周血中性粒细胞对人脐静脉内皮细胞（HUVEC）及纯化配体底物定量黏附特性的方法。通过该方法，可评估并比较不同黏附受体等位基因变异供者的中性粒细胞黏附能力。该方法亦可经修改后用于评估其他原代细胞类型或细胞系的黏附特性。

中性粒细胞结合涂有纯化配体（ICAM-1/P-选择素）的流动腔室的示例图2)或中性粒细胞结合人脐静脉内皮细胞包被的流动腔实验（图3如图所示，在持续流动条件下，中性粒细胞会持续积累并黏附于包被表面或人脐静脉内皮细胞（HUVEC）。在我们典型的实验条件下，可在四分钟的记录期间观察到50–70个中性粒细胞牢固黏附于包被表面或HUVEC。然而，中性粒细胞黏附分子的等位变异，或底物（纯化配体或HUVEC）中的等位变异，可能显著改变中性粒细胞黏附的定量结果。14.
我们还评估了在研究中观察到的中性粒细胞黏附事件的时间依赖性。尽管我们保持恒定的流动条件，但细胞的黏附特性仍可能随时间发生变化。然而，在本研究相对较短的时间范围内，我们并未观察到黏附速率随时间呈现一致性的差异。例如，1-2分钟时间点的黏附情况与3-4分钟时间点之间的黏附情况相比，并未表现出持续的差异。当然，如果在黏附实验过程中对细胞进行了刺激，则可能预期其黏附特性会随时间发生改变。
在我们的研究中，为排除分离过程诱导的中性粒细胞活化影响，我们在实验前特意用低剂量fMLP（10-8 M）对细胞进行10分钟的预刺激。内皮细胞（本研究中为HUVEC）也需要预先激活，以促进黏附分子的表达上调，从而实现白细胞牢固黏附的最佳条件。若未经预处理，内皮细胞（HUVECs）几乎无法支持中性粒细胞的黏附。在本研究中，我们采用10 ng/ml TNFα处理4–6小时后再使用。IL-1β（10 ng/ml）和LPS（0.5–1 µg/ml）也可用于内皮细胞的预激活。重要的是，未处理的HUVEC可作为阴性对照，以确保细胞黏附是由特异性的（受体介导的）中性粒细胞-内皮细胞相互作用所引起。此外，也可使用抗受体抗体阻断特定受体，以评估黏附的特异性。
<img alt="流动室实验显微镜装置示意图；图中显示了注射泵、真空装置和中性粒细胞（PMN）流动控制系统。" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/51410/51410fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51410/51410fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图1"> 
图1. 显微镜载物台上流动室的配置。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51410/51410fig1highres.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="细胞运动的延时显微图像，显示每分钟的动态变化。" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/51410/51410fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51410/51410fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 2"> 
图 2. 中性粒细胞在不同时间点黏附于 ICAM-1/P-选择素包被表面的示例视频截图（A：0 分钟时间点，B：1 分钟时间点，C：2 分钟时间点，以及 D：4 分钟时间点）。ICAM-1 的浓度为 25 µg/ml，P-选择素的浓度为 0.5 µg/ml。中性粒细胞的流速为 350 µl/min，细胞密度为 500,000 个细胞/ml。
<img alt="显示细胞迁移研究中四个时间点细胞培养生长情况的显微延时图像。" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/51410/51410fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51410/51410fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图3"> 
图3. 中性粒细胞在不同时间点黏附于HUVEC包被表面的示例视频截图（A：0分钟时间点，B：1分钟时间点，C：2分钟时间点，以及D：4分钟时间点）。中性粒细胞流速为350 µl/min，细胞密度为500,000 个细胞/ml。
<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>物种</td>
			<td>位置</td>
			<td>剪切应力 (dynes/cm2)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human</td>
			<td>颈总动脉</td>
			<td>11.6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human</td>
			<td>臂动脉</td>
			<td>6.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human</td>
			<td>股总动脉</td>
			<td>4.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human</td>
			<td>肾上主动脉</td>
			<td>7.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human</td>
			<td>膈上主动脉</td>
			<td>4.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human</td>
			<td>浅股动脉</td>
			<td>4.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human</td>
			<td>微静脉</td>
			<td>0.5-5.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human</td>
			<td>视网膜第一级小动脉</td>
			<td>40.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human</td>
			<td>视网膜第二级小动脉</td>
			<td>0.001</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human</td>
			<td>视网膜第一级小静脉</td>
			<td>23.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human</td>
			<td>视网膜第二级小静脉</td>
			<td>0.43</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dog</td>
			<td>颈总动脉</td>
			<td>15.8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit</td>
			<td>颈总动脉</td>
			<td>23.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat</td>
			<td>颈总动脉</td>
			<td>46.6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse</td>
			<td>颈总动脉</td>
			<td>64.8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dog</td>
			<td>股总动脉</td>
			<td>9.8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit</td>
			<td>股总动脉</td>
			<td>156.8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat</td>
			<td>股总动脉</td>
			<td>65.9</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1. 不同器官和不同物种中的样本剪切应力。
* 摘自参考文献13、16、19和20。

一种中性粒细胞黏附定量方法的报道。该方法可构建类似于血管内环境的动态流动条件，能够在类似生理流动的环境中研究中性粒细胞与纯化的黏附分子（配体）或内皮细胞基质（HUVEC）之间的黏附。 体内 具有剪切应力的环境。

中性粒细胞牢固黏附于内皮细胞在生理与病理状态下的炎症过程中发挥关键作用。中性粒细胞牢固黏附的过程……

本实验的总体目标是利用流动腔检测法测量中性粒细胞的牢固黏附，该方法可在剪切应力存在条件下研究人中性粒细胞的黏附行为。首先，需制备含有纯化黏附分子的基质或内皮细胞表面，例如人脐静脉内皮细胞（HUVECs）或ve。第二步，采用双层PHI细胞分离离心法从人外周血中分离中性粒细胞。接下来，组装流式腔室，以便在剪切应力条件下将分离的人中性粒细胞注入含有黏附分子、配体或血管内皮的基质表面。最后一步是在流式腔室内记录中性粒细胞的黏附事件，随后对牢固黏附进行精确的定量分析。最终，通过流式腔室实验可证明中性粒细胞对纯化的黏附分子及 HX 表面具有牢固黏附能力。该方法有助于解答自身免疫研究领域中的关键问题，例如与自身免疫性疾病发生相关的组织分子中遗传变异的功能重要性。针对系统性红斑狼疮患者开展的遗传学研究已证实，该疾病与Abeta2整合素（一种参与中性粒细胞牢固黏附的蛋白质）的基因变异存在显著关联。我们开发了该检测系统，用于评估该称为Mac-1的β2整合素基因变异对牢固黏附功能的影响，以准备用于流式腔室实验的培养皿。向每个35毫米的组织培养皿中加入一毫升纤维蛋白和明胶溶液，并用移液器反复吹打数次，以确保整个培养皿表面被均匀覆盖。去除多余的纤连蛋白和明胶溶液，将培养皿在空气中干燥至少30分钟。为优化蛋白质基质的形成，使用胰蛋白酶-EDTA消化并收集培养至80%至90%融合度的人脐静脉内皮细胞或qve细胞，将500,000个细胞接种到每个包被好的组织培养皿中。向每个培养皿中加入两毫升培养基，在37摄氏度下孵育。5%CO2 条件下的细胞应每天进行肉眼观察，并每两天更换一次培养基。让细胞生长至80%至90%融合度。开始此操作步骤时，使用记号笔或笔在35毫米组织培养皿的中央画一个直径为0.5厘米的圆。在标记区域内加入20微升浓度为20微克/毫升的蛋白A溶液。用移液枪枪头将蛋白A溶液均匀涂布，覆盖整个直径为0.5厘米的圆形区域。切勿触碰或刮擦培养皿表面。将组织培养皿在37摄氏度条件下孵育一小时。随后，用一毫升磷酸盐缓冲液（PBS）将每块包被有蛋白a的板子洗涤三次。从第三次洗涤的孔板中移除 PBS 后，在标记区域加入 50 微升 1% BSA，以阻断孔板上的非特异性结合。在 4°C 下孵育 2 小时。2 小时后。用一毫升 PBS 洗涤封闭后的平板三次。制备用于包被及本实验的 FC 黏附受体配体融合蛋白溶液，使用 ICAM-1 FC 融合蛋白（Kyra）浓度为每毫升 25 微克，P 选择素 FC 融合蛋白（Kyra）浓度为每毫升 0.5 微克。在标记区域加入 50 微升底物溶液，将组织培养皿在 4 摄氏度下孵育过夜。这些培养皿应在两天内使用，且包被区域不得干燥。如有必要，添加 PBS 以维持培养板上 50 µL 的溶液量。本研究中的中性粒细胞来源于已签署书面知情同意书的受试者血液。采集血液时，使用含抗凝剂的采血管或真空采血管，随后以磷酸盐缓冲液（PBS）将血液按1:1比例稀释，并在室温下于50毫升离心管中制备双层密度梯度分离液，用于分离外周血单个核细胞（PBMCs）和中性粒细胞。本步骤中所有操作均需在此条件下进行。首先，加入15毫升的高密度菲可液，然后小心地将10毫升的低密度菲可液叠加在高密度菲各液上方。低密度菲可液与高密度菲可液之间应形成清晰的分界线。最后，小心地将25毫升稀释后的血样叠加在低密度菲可液上方，注意不要扰动菲可液层。离心后，在室温下将各管以分层离心法离心30分钟，此时应出现多个分层。中性粒细胞层含有少量红细胞，位于轻密度和重密度Phi层之间。使用移液管吸取中性粒细胞层，并将其转移至新的50毫升离心管中，加入PBS至终体积为50毫升。在225 ×g下离心10分钟。离心后在室温下，中性粒细胞中可能仍混有红细胞。将上清液吸出至剩余10 mL。Mark Resus。通过短暂低速涡旋重悬中性粒细胞与红细胞沉淀，然后再次用50毫升PBS洗涤，吸除上清液以去除污染的红细胞。用残留的PBS通过短暂低速涡旋重悬沉淀的细胞。加入25毫升水，轻轻涡旋震荡10秒。对于虱子。红细胞则加入25毫升1.8%氯化钠溶液，并立即在225 × g条件下离心10分钟。此时，污染的红细胞应已被裂解，留下白色的中性粒细胞沉淀。用 PBS 洗涤中性粒细胞沉淀，弃去上清液，并将分离得到的中性粒细胞重悬于含 10% FBS 的 RPMI 培养基中。在光学显微镜下使用血细胞计数板确定细胞浓度后，用完全 RPMI 10% FBS 培养基将细胞密度调整至每毫升 500,000 个细胞。在开始流室黏附实验之前，先用 20 纳克/毫升的人 TNF-α 对血管内皮细胞（VE）刺激 4 至 6 小时，以促进黏附分子的上调和表达。当血管内皮细胞准备就绪后，组装流室。将含有融合单层血管内皮细胞的 35 毫米培养皿放置在显微镜载物台上。本视频仅考察中性粒细胞与血管内皮细胞（VE）的黏附，但相同步骤也适用于研究中性粒细胞与纯化黏附分子的黏附。将平行板流动腔室连接至注射泵和真空系统，并留出一条通路用于输入中性粒细胞。将流动腔室置于载玻片上方并固定腔室组件。启动连接显微镜的计算机上的视频录制程序。调节显微镜的视野和焦距，直至观察到清晰且完全发育的血管内皮（VE）。使用注射泵，用RPMI培养基冲洗流室。确保流室内或中性粒细胞输入管路中无任何气泡。使用注射泵以设定的速度将中性粒细胞注入流室。由于中性粒细胞黏附可能发生得较快，因此需要录制视频，通常录制 4 到 5 分钟的视频即可用于定量分析黏附事件。此视频片段展示了中性粒细胞结合至 HU E 包被的流室的示例。黏附细胞定义为在五秒内移动距离小于一个细胞直径的细胞。在 HU e 涂层表面。此处显示的是中性粒细胞黏附于 ICAM-1 和 P-选择素涂层表面或 uve 涂层表面的样本视频在不同时间点的截图。在两个实验中，中性粒细胞的流速均为每分钟 350 微升，细胞密度为每毫升 500,000 个细胞。在典型条件下，观察到在四分钟的记录期间，有 50 至 70 个中性粒细胞牢固地黏附于配体或 VE 涂层表面。然而，若存在中性粒细胞黏附分子的等位变异或基质中的等位变异，则可通过使用不同供体进行相同时长的录像，显著改变中性粒细胞黏附的定量结果。中性粒细胞，可通过计算每分钟黏附细胞的数量来比较不同供体之间的黏附特性。在进行该操作时，重要的是要通过肉眼检查中性粒细胞是否存在因分离过程中细胞活化引起的细胞聚集现象。此外，可同时进行流式细胞术评估细胞活化状态，以确保不同供体之间以及不同实验之间的细胞活化状态具有一致性。该技术为自身免疫研究领域的科研人员铺平了道路，使其能够利用具有不同编码区等位基因的基因型供体的原代人类细胞，探索β2整合素MAC-1的CD11b链在细胞黏附中的作用。这些研究使得对这些等位基因变异在人类体系中功能影响的细致且定量的评估成为可能。

human-neutrophil-flow-chamber-adhesion-assay

Research

科研

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学与感染

人中性粒细胞流动室粘附实验

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黏附频率检测 原位 细胞-细胞界面交叉连接分子相互作用的动力学分析

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