人中性粒细胞流动室粘附实验

报道定量中性粒细胞粘附的方法。此方法创建类似于血管遇到了动态流环境。它使中性粒细胞粘附到任何纯化黏附分子（配体）或类似体内环境与剪切应力的上下文内皮细胞基板（HUVEC）的调查。

该程序的总体目标是使用流室测定法测量中性粒细胞的牢固粘附，该测定法允许在剪切应力存在下进行人中性粒细胞粘附。这是通过首先制备纯化的粘附分子或内皮细胞表面（例如人脐静脉、内皮细胞或 ve）的底物来实现的。第二步是使用称为离心法的两层 PHI 从人外周血中分离中性粒细胞。

接下来，组装流动室，以便在剪切应力下将分离的人嗜中性粒细胞注射到粘附、配体或 ve 的基材上。最后一步是在流动室中记录中性粒细胞粘附事件，然后仔细定量牢固粘附。最终，流室测定用于显示中性粒细胞对纯化的粘附分子和 HX 表面的牢固粘附。

这种方法可以帮助回答自身免疫领域的关键问题，例如已知与自身免疫发展相关的组织分子中遗传变异的功能重要性。对系统性红斑狼疮上睑下垂患者的遗传学研究表明，变异和 Abeta 双整合素（一种参与中性粒细胞坚硬粘附的蛋白质）具有很强的相关性。我们开发了这个测定系统来评估这种称为 Mac one 的 beta 2 内分泌中遗传变异的功能后果，对牢固粘附 准备用于流动室的培养皿。

向每个 35 毫米组织培养皿中加入 1 毫升纤维蛋白和明胶溶液，并移液数次以确保整个板表面被涂覆。去除多余的纤连蛋白和明胶溶液，将板风干至少 30 分钟。为了优化蛋白质基质的形成，使用胰蛋白酶 EDTA 将 500， 000 个细胞接种到每个包被的组织培养皿中，收获已培养至 80% 至 90% 汇合的人脐静脉内皮细胞或 qve。

向每个培养皿中加入 2 毫升生长培养基，并在 37 摄氏度下孵育。应每天目视检查 5% CO2 细胞，每两天更换一次培养基。让细胞生长到 80% 到 90% 汇合。

要开始此过程，请使用记号笔或笔在 35 毫米组织培养皿板的中心画一个直径为 0.5 厘米的圆圈。20 微升每毫升 20 微克蛋白质，标记区域的溶液。使用移液器吸头涂抹蛋白质，一种覆盖直径为 0.5 厘米的圆圈内整个区域的溶液。

重要的是不要触摸或刮擦盘子的表面。将组织培养皿在 37 摄氏度下孵育 1 小时。接下来，用 1 毫升 PBS 将每种蛋白质在包被板中洗涤 3 次。

从第三个洗涤板中取出 PBS 后，在标记区域加入 50 微升 1% BSA，以阻止板上的非特异性结合。在 4 摄氏度下孵育 2 小时。两个小时后。

用 1 毫升 PBS 洗涤堵塞的板 3 次。准备用于涂层的 FC 粘附受体配体嵌合蛋白溶液，本实验和 ICAM，将使用每毫升 25 微克的 FC Kyra 和 0.5 微克/毫升的 P 选择素 FC Kyra。用 50 微升底物涂覆标记区域，将组织培养皿在 4 摄氏度下孵育过夜。

餐具应在两天内使用，并且不应让涂层区域变干。如有必要。添加 PBS 以保持板上的 50 微升溶液。

本研究的中性粒细胞是从已给予书面知情同意书的参与者的血液中分离出来的。通过静脉切开术将血液收集到抗凝血采血管或 vacutainer 中后，用 PBS 一比一稀释血液，执行此程序中的所有步骤。在室温下，准备一个两层 phy 调用，用于在 50 毫升离心管中分离外周血单核细胞或 p BMC 和中性粒细胞。

首先，添加 15 毫升重 PHI 呼叫，然后小心地将 10 毫升轻 fi 呼叫层叠在重 fi 呼叫之上。轻 fi 调用层和重 fi 调用层之间应有明显的边界。最后，小心地将 25 毫升稀释的血液样本放在 Light fi call 上，不要干扰 PHI。

调用层离心后，在室温下将试管离心 30 分钟，应存在多层。红细胞较少的中性粒细胞层介于轻 phi 和重 phi 之间。使用移液管收获物调用，将嗜中性粒细胞层转移到新的 50 毫升试管中，并加入 PBS 至最终体积为 50 毫升。

以 225 倍 G 离心 10 分钟。离心后，在室温下，可能仍有红细胞与中性粒细胞混合。吸出上清液至 10 毫升。

马克·雷苏斯。短暂悬浮中性粒细胞红细胞沉淀，低速涡旋，然后再次用 50 毫升 PBS 洗涤，吸出上清液以去除污染的红细胞。通过短暂的低速涡旋将沉淀的细胞重悬于残留的 PBS 中。

加入 25 毫升水，轻轻涡旋 10 秒钟。到虱子。红细胞加入 25 毫升 1.8% 氯化钠，立即以 225 倍 G 离心混合 10 分钟。

现在应该将污染的红细胞躺着，留下白色的中性粒细胞沉淀。用 PBS 洗涤中性粒细胞沉淀，弃去上清液，并将分离的中性粒细胞重悬于含 10% FBS 的 RPMI 培养基中。在光学显微镜下用血细胞计数器测定细胞浓度后，用完整的 RPMI 10% FBS 培养基将细胞密度调节至每毫升 500， 000 个细胞。

在开始流速室粘附测定之前，用每毫升 20 ng的人 TNF α 引发 VE 4 到 6 小时，以上调和刺激粘附分子的表达。VE 准备就绪后，组装流通室。将含有汇合 VE 的 35 毫米培养皿放在显微镜台上。

出于本视频的目的，将仅检查中性粒细胞对 VE 的粘附，但相同的程序适用于研究中性粒细胞与纯化粘附分子的粘附，将平行板流通室与注射泵和真空系统连接起来，并为中性粒细胞输入留出一条管路。将流通室插入板顶部并固定流通室组件。在连接到显微镜的计算机上启动视频录制程序。

调整显微镜的视野和焦距，直到看到具有完全生长的 VE 的清晰视野。使用注射泵，用 RPMI 介质冲洗流通室。确保腔室或中性粒细胞输入线内没有气泡。

使用注射泵以规定的速度将嗜中性粒细胞注入流动室。录制视频 由于中性粒细胞粘附会迅速发生，因此 4 到 5 分钟的视频通常足以定量粘附事件以进行分析。该视频剪辑显示了中性粒细胞与 胡 E 包被流式室结合的示例。

贴壁细胞定义为在 5 秒内移动小于一个细胞直径的细胞。在 胡 e 涂层表面。此处显示的是中性粒细胞粘附在 ICAM、一个 P 选择素包被表面或 uve 包被表面的样品视频中不同时间点的屏幕截图。

在这两个实验中，中性粒细胞流速均为每分钟 350 微升，中性粒细胞密度为每毫升 500， 000 个细胞。在典型条件下，观察到 50 至 70 个人嗜中性粒细胞在 4 分钟的记录期内牢固地粘附在配体或 VE 包被的表面上。然而，中性粒细胞粘附分子的等位基因变体或底物中的等位基因变体可以通过用不同供体录制相似长度的视频来显着改变中性粒细胞的定量粘附。

性粒细胞，可以计算每分钟贴壁细胞的数量，以比较不同供体之间的粘附特性。在尝试此过程时，重要的是要记住目视检查中性粒细胞是否由分离诱导的细胞活化引起的细胞夹合。此外，可以对细胞活化进行平行流式细胞术评估，以确保细胞的活化状态在供体之间和实验之间匹配。

这项技术为自身免疫领域的研究人员铺平了道路，以探索基因型供体在原代人细胞中的细胞粘附，这些供体具有 β 两个整合素 MAC 1 的 CD 11 B 链的不同编码区等位基因。这些研究允许对这些等位基因变异在人体系统中的功能影响进行仔细和定量的评估。