Name: 比色纸为基础的检测大肠杆菌沙门氏菌属，和单核细胞增生李斯特氏菌从农业用水大容量 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-06-09T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 50 s
Description: 学习使用改良摩尔拭子（MMS）和比色纸基分析装置检测农业用水中的食源性病原体。该方法可快速浓缩大体积水样中的大肠杆菌、沙门氏菌和李斯特菌，实现24小时内现场筛查，提升食品安全监测效率。

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我们衷心感谢美国农业部国家食品与农业研究所提供的资助，项目编号为 2009-01208 和 2009-01984。

1. 使用MMS从大量农业用水中浓缩细菌
<ol>
	<li>膜过滤装置（MMS）制备
	<ol>
		<li>裁剪一块4层纱布，尺寸为40 ×&#160;12 cm的矩形。</li>
		<li>沿两个轴向将纱布对折，得到一个20 ×&#160;6 cm的矩形。</li>
		<li>沿长边方向紧密卷起纱布，形成一个长约6 cm、直径约3&#160;cm的圆柱形拭子。</li>
		<li>将纱布拭子用铝箔包裹后进行高压灭菌，切勿对MMS卡盒进行高压灭菌。通过将卡盒浸泡于10%家用漂白剂中30分钟进行去污，并随后将其浸泡于硫代硫酸钠五水合物（Na2S2O3·5H2O）溶液（50 mg/L，用无菌水配制）中15分钟，以中和残留氯。</li>
		<li>将拭子插入MMS卡盒中。 
		注意：若使用非一次性MMS卡盒，请起始使用一块80 ×&#160;22 cm的4层纱布，将其折叠为40 ×&#160;11 cm，再卷成一个长约11 cm、直径约6 cm的圆柱体。</li>
		<li>组装MMS装置。</li>
		<li>将乙烯基管路连接至MMS两侧的出液口，确保管路完全贴合出液口，并将管路固定于蠕动泵上。确保蠕动泵上游的管路长度足以完成采样。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>细菌浓缩
	<ol>
		<li>通过以高速运行蠕动泵，采集至少10 L农业用水样品。</li>
		<li>采样完成后，将蠕动泵进样端从水样中取出，并继续运行泵，直至MMS无出流液体为止。</li>
		<li>若使用多通道装置同时处理多个样品，请分别收集每个MMS的出流液；当单个MMS过滤达到10 L时，关闭该MMS对应的阀门，并继续运行泵。
		<ol>
			<li>采样完成后，将蠕动泵进样端从农业用水中取出，打开多通道装置的所有阀门，并继续运行泵，直至所有MMS均无出流液体为止。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>当所有MMS的浓缩步骤完成后，小心地将乙烯基管路从MMS出液口上拆除，并用盖帽封闭MMS两侧的出液口。密封良好的MMS可在添加增菌培养基前保存最多12小时。</li>
</ol>
2. MMS 富集与样品制备
<ol>
	<li>增菌
	<ol>
		<li>拧开MMS的盖子，无菌操作加入20 ml适当的无菌增菌肉汤。每个选择性增菌使用一个MMS。或者，可进行非选择性增菌，以在同一份样品中同时扩增三种目标细菌。 
		注意：如果使用MMS卡匣的非一次性版本，在加入225 ml适当的增菌培养基之前，需无菌取出卡匣中的纱布滤膜并置于无菌袋中。
		<ol>
			<li>为增菌E. coli，加入20 ml添加8 mg/L盐酸万古霉素的缓冲蛋白胨水（BPW）。</li>
			<li>为增菌Salmonella spp.，加入20 ml添加Salmonella补充剂（4 ml/L）的BPW。</li>
			<li>为增菌L. monocytogenes，加入20 ml VIDAS UP Listeria（LPT）肉汤。</li>
			<li>若使用单个MMS对三种微生物同时进行非选择性增菌，使用通用预增菌肉汤（UPB）。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>将MMS盖子重新拧紧。确保出液口的盖帽已紧密封闭，以避免在增菌过程中发生泄漏或污染。</li>
		<li>将MMS置于摇床培养箱中培养，最长时间为18–24小时，转速为200 rpm。E. coli和Salmonella spp.的选择性增菌使用42 °C；L. monocytogenes的选择性增菌使用30 °C；非选择性增菌使用37 °C。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>样品制备
	<ol>
		<li>培养完成后，将MMS从培养箱中取出，打开其中一个出液口，轻轻挤出约0.5 ml至1.5 ml微量离心管中。或者，也可拧开MMS盖子，用移液器吸取0.5 ml过夜增菌液。 
		注意：如果使用MMS卡匣的非一次性版本，从袋中用移液器吸取0.5 ml增菌液。</li>
		<li>对于E. coli选择性增菌的比色分析，或对非选择性增菌样品的分析，使用探头式超声仪对0.5 ml增菌液在5 W、22 kHz条件下超声处理20秒。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 比色底物在µPAD中的制备与包埋
<ol>
	<li>为每个待测样品和目标准备足够的µPAD。检测大肠杆菌（E. coli）时，准备CPRG和X-Gluc µPAD；检测沙门氏菌（Salmonella spp.）时，准备MC µPAD；检测单核细胞增生李斯特菌（L. monocytogenes）时，准备X-InP µPAD。
	<ol>
		<li>配制HEPES缓冲液 [0.1 M HEPES 含 0.1% 牛血清白蛋白（BSA）]，用于显色底物，并根据所用底物调整缓冲液pH值：配制CPRG或X-Gluc时pH为7.5，MC时pH为9，X-InP时pH为7。</li>
		<li>在pH调整后的HEPES缓冲液中配制各底物的储备液，浓度分别为：3 mM（CPRG）、62.5 mM（X-Gluc）、15 mM（MC）、100 mM（X-InP）。储备液需避光保存。</li>
		<li>将µPAD置于无菌培养皿中，然后向µPAD的微点加入24 µl每种底物储备液。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 检测与数据分析
<ol>
	<li>检测
	<ol>
		<li>将6 µl富集后的样品加入培养皿中相应的µPAD微点内。</li>
		<li>将培养皿盖重新盖上，并用Parafilm密封。</li>
		<li>将样品与µPAD在37 °C下孵育最长3小时，以使微点显色并干燥。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>结果的目视检查
	<ol>
		<li>通过直接目视观察µPAD的颜色变化进行检测。 
		注：通常在富集18–24小时后，强阳性反应会产生明确的颜色变化，无需进一步确认，应判为阳性。</li>
		<li>通过观察嵌入CPRG的微点由黄色变为红紫色，以及嵌入X-Gluc的微点由无色变为蓝绿色，判断是否存在E. coli阳性样品。</li>
		<li>通过观察嵌入X-InP的微点由无色变为靛蓝色，判断是否存在L. monocytogenes阳性样品。</li>
		<li>通过观察嵌入MC的微点由无色变为紫红色，判断是否存在Salmonella spp.阳性样品。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>软件辅助数据分析 
	注：用于明确判断弱反应为阳性或阴性，并实现结果的半定量分析。
	<ol>
		<li>让µPAD完全干燥。</li>
		<li>使用平板扫描仪扫描µPAD。</li>
		<li>使用ImageJ软件处理图像。
		<ol>
			<li>&#34;打开”主菜单“文件”选项卡下的已扫描图像（或按“Clt+O”）以在ImageJ中进行分析。</li>
			<li>在主菜单“编辑”选项卡下选择“反相”（或按“Clt+Shift+I”）对图像进行反相处理。</li>
			<li>使用主菜单中的“分析”选项卡，选择“设置测量项…”以确定需报告的测量参数。</li>
			<li>确保勾选“平均灰度值”、“仅限阈值范围”和“显示标签”选项，然后点击“确定”。此设置将决定软件如何分析选定区域及其报告方式。</li>
			<li>使用“椭圆”工具绘制一个圈，标定需要测量的区域范围。</li>
			<li>在“分析”选项卡下选择“测量”（或按“Clt+M”）。软件将测量所定义区域内的平均灰度强度，并在弹出窗口中报告结果，该结果可复制并粘贴至Excel中进行进一步分析。 
			注：为获得更准确的分析结果，每个样品应至少进行两次技术重复。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Guidance+for+industry%3A+Guide+to+minimize+microbial+food+safety+hazards+for+fresh+fruits+and+vegetables%22">Guidance for industry: Guide to minimize microbial food safety hazards for fresh fruits and vegetables</a>. , U.S. Dept. of Health and Human Service, Food and Drug Administration, Center for Food Safety and Applied Nutrition (CFSAN). (1998).</li>
<li>Bisha, B., Pérez-Méndez, A., Danyluk, M. D., Goodridge, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+Modified+Moore+swabs+and+continuous+flow+centrifugation+for+concentration+of+Salmonella+and+Escherichia+coli+O157%3AH7+from+large+volumes+of+water%29%5BTitle%5D)+AND+%22J+Food+Prot%22%5BJournal%5D)">Evaluation of Modified Moore swabs and continuous flow centrifugation for concentration of Salmonella and Escherichia coli O157:H7 from large volumes of water).</a> J Food Prot. 74, 1934-1937 (2011).</li>
<li>Sbodio, A., Maeda, S., Lopez-Velasco, G., Suslow, T. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modified+Moore+swab+optimization+and+validation+in+capturing+E.+coli+O157%3AH7+and+Salmonella+enterica+in+large+volume+field+samples+of+irrigation+water%5BTitle%5D)+AND+%22Food+Res+Int%22%5BJournal%5D)">Modified Moore swab optimization and validation in capturing E. coli O157:H7 and Salmonella enterica in large volume field samples of irrigation water.</a> Food Res Int. 51, 654-662 (2013).</li>
<li>McEgan, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+Salmonella+spp.+from+large+volumes+of+water+by+modified+Moore+swabs+and+tangential+flow+filtration%5BTitle%5D)+AND+%22Lett+Appl+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Detection of Salmonella spp. from large volumes of water by modified Moore swabs and tangential flow filtration.</a> Lett Appl Microbiol. 56, 88-94 (2013).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Solicitation+Number%3A+FDA-SS-1116253%22">Solicitation Number: FDA-SS-1116253</a>. , Administration USFaD. (2013).</li>
<li>Jokerst, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+paper-based+analytical+device+for+colorimetric+detection+of+select+foodborne+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Development of a paper-based analytical device for colorimetric detection of select foodborne pathogens.</a> Analytical Chemistry. 84, 2900-2907 (1021).</li>
<li>Martinez, A. W., Phillips, S. T., Butte, M. J., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patterned+paper+as+a+platform+for+inexpensive%2C+low-volume%2C+portable+bioassays%5BTitle%5D)+AND+%22Angew+Chem+Int+Edit%22%5BJournal%5D)">Patterned paper as a platform for inexpensive, low-volume, portable bioassays.</a> Angew Chem Int Edit. 46, 1318-1320 (2007).</li>
<li>Martinez, A. W., Phillips, S. T., Wiley, B. J., Gupta, M., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FLASH%3A+A+rapid+method+for+prototyping+paper-based+microfluidic+devices%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">FLASH: A rapid method for prototyping paper-based microfluidic devices.</a> Lab on a Chip. 8, 2146-2150 (1039).</li>
<li>Abe, K., Suzuki, K., Citterio, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inkjet-printed+microfluidic+multianalyte+chemical+sensing+paper%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Inkjet-printed microfluidic multianalyte chemical sensing paper.</a> Analytical Chemistry. 80, 6928-6934 (1021).</li>
<li>Cheng, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Millimeter-scale+contact+printing+of+aqueous+solutions+using+a+stamp+made+out+of+paper+and+tape%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Millimeter-scale contact printing of aqueous solutions using a stamp made out of paper and tape.</a> Lab on a Chip. 10, 3201-3205 (1039).</li>
<li>Lu, Y., Shi, W. W., Jiang, L., Qin, J. H., Lin, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+prototyping+of+paper-based+microfluidics+with+wax+for+low-cost%2C+portable+bioassay%5BTitle%5D)+AND+%22Electrophoresis%22%5BJournal%5D)">Rapid prototyping of paper-based microfluidics with wax for low-cost, portable bioassay.</a> Electrophoresis. 30, 1497-1500 (2009).</li>
<li>Jokerst Rapid detection of pathogens using paper devices. US patent. , WO2012125781 A3 (2012).</li>
<li>T10-06 Colorimetric paper-based detection of Salmonella spp. and Escherichia coli from artificially contaminated irrigation river water. Bisha, B., et al. Internation Association for Food Protection Annual Meeting, Providence, RI, , (2012).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

本方案描述了一种用于检测农业用水中 E. coli、Salmonella spp. 和 L. monocytogenes 的整合方法。该方法结合了使用磁性微球（MMS）从大体积（10 L）农业用水中浓缩细菌、细菌增菌以及利用微流控纸基分析装置（µPADs）进行指示细菌存在的比色检测。MMS 程序能够应对水样中高含量的颗粒物，同时将细菌浓缩 10 倍，操作稳定、简便，适合经最低限度培训的人员在野外应用，且成本极低。通过引入细菌增菌步骤，可检测活菌，显著提高方法的灵敏度。增菌过程可扩增待测目标物，结合选择性培养基使用，还能抑制样本中非目标微生物的生长，从而减少可能导致假阳性结果的干扰。最终检测采用 µPADs 实现，提供了一种简单、经济且易于判读的方案，用于筛查重要的食源性致病菌。整个流程包括 MMS 浓缩、过夜增菌和比色检测，可在一天内完成，并能检测低至 0.1 CFU/mL 的细菌污染水平。
为了简化方法并降低污染的可能性，使用MMS作为细菌增菌的容器。将此增菌步骤加入流程中可提高检测的灵敏度、特异性，并增强方法的灵活性。尽管本...

为了减轻食源性疾病的负担，快速检测食源性致病因子，最好在实地环境中进行检测，这一点至关重要。常见的食源性细菌病原体检测策略包括生化特征分析、选择性和鉴别性培养、免疫学分离与检测以及分子检测。然而，这些方法受限于偶然性的污染、检测样本量小、食源性致病菌浓度通常较低、处理时间较长，和/或不适用于现场环境。此外，许多食品基质中的化合物会抑制检测和诊断应用。为提高微生物检出的可能性，美国食品药品监督管理局（FDA）建议，检测与大量新鲜农产品表面接触或作为农产品污染传播媒介的农业用水（如清洗水和灌溉水），是直接检测食品的一种可行替代方案1。即便如此，由于自然环境中病原体载量通常较低，加之代表性农业水样本身的稀释效应，使得病原体浓缩的样品前处理方法变得至关重要。此类方法需要采集大量水样（≥10 L），实现充分的病原体浓缩，并能与后续检测策略相兼容。
改良摩尔拭子（Modified Moore swabs，MMS）是一种廉价、简单且耐用的装置，用于从大量水样（≥10 L）中浓缩细菌2-4。MMS由一个塑料盒组成，盒内填充纱布，作为粗滤器，在使用蠕动泵将大量水样泵入盒内时起到过滤作用。MMS是一种非选择性的细菌浓缩方法（浓缩倍数≥10倍），可捕获处理液样本中的有机和无机颗粒物质，包括微生物。MMS对目标微生物具有优异的浓缩效果，这很可能是因为微生物通常附着在悬浮固体中的粉砂-黏土组分或有机微聚集体上3。MMS的坚固设计克服了其他水样细菌捕获与浓缩过滤方法的大多数缺点，例如滤膜堵塞、无法处理大体积样本、难以过滤高浊度样本以及成本高昂等问题。基于这些优势，美国食品药品监督管理局（FDA）建议将MMS纳入环境及与农产品相关样本采集的官方规程中5。
本文描述了一种从农业用水中浓缩、富集并检测大肠杆菌（Escherichia coli）、沙门氏菌（Salmonella spp.）和单核细胞增生李斯特菌（Listeria monocytogenes）的方法。采用微生物浓缩系统（MMS）对细菌进行浓缩，并作为选择性或非选择性细菌增菌的容器。细菌的检测通过基于纸张的分析装置（µPADs）以生化方式实现6。µPADs 可通过多种方法制造成微流控网络或斑点测试，包括光刻、喷墨打印、压印和蜡印7–11。流体设计的示例包括树突状通道图案，其中样品置于中心，随后流向远端储液池；或单通道图案，通过毛细作用将样品或底物从通道外侧储液池拉向中心12。在本实验方案中，我们选用嵌入显色底物的直径为 7 mm 的蜡印纸斑点阵列，这些底物可被本研究中目标微生物所产生特征性酶催化反应：用于检测大肠杆菌（E. coli）产生的 β-半乳糖苷酶和 β-葡萄糖醛酸酶的氯酚红-β-D-吡喃半乳糖苷（CPRG）和 5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-葡萄糖醛酸苷（X-Gluc）；用于检测沙门氏菌（Salmonella spp.）产生的 C8-酯酶的 5-溴-6-氯-3-吲哚基辛酸酯（magenta caprylate）；以及用于检测单核细胞增生李斯特菌（L. monocytogenes）产生的磷脂酰肌醇特异性磷脂酶 C（PI-PLC）的 5-溴-4-氯-3-吲哚基-myo-肌醇磷酸酯（X-InP）6。因此，无需复杂设备或数据分析，即可通过肉眼观察判断特定细菌的存在。此前已有研究探讨了基于酶法比色 µPAD 检测这些特定目标细菌的特异性和灵敏度6。此外，通过向大体积水样中加入已知浓度的微生物，对集成的浓缩-检测方法针对这些目标细菌的灵敏度进行了评估（未发表数据及 Bisha&#160;et al.13）。

<table><tbody><tr><td>农业用水</td><td></td><td></td><td>灌溉用水、农产品清洗水、井水等</td></tr><tr><td>乙烯基管</td><td>Wilmar</td><td>BN-CVT1005</td><td>&amp;nbsp;1/4&quot; 内径，&amp;nbsp;3/8&quot; 外径，可从以下网址获取：&amp;nbsp;http://www.wilmar.com</td></tr><tr><td>改良摩尔拭子滤筒&amp;nbsp;</td><td>Lumiere Diagnostics</td><td></td><td>长 11 &amp;frac12; cm，宽 4 &amp;frac12; cm，可从以下网址获取：&amp;nbsp;http://www.lumierediagnostics.com&amp;nbsp;。或者，也可使用非一次性滤筒（参见正文）</td></tr><tr><td>纱布</td><td>Chesapeake Wiper &amp; Supply, Inc.</td><td>CC90</td><td>90 号级，44 × 36 编织，可从以下网址获取：&amp;nbsp;www.raglady.com</td></tr><tr><td>家用漂白剂</td><td>多种品牌</td><td></td><td>次氯酸钠浓度约为 6%</td></tr><tr><td>五水合硫代硫酸钠</td><td>Mallinckrodt Baker Inc</td><td>8100-04</td><td></td></tr><tr><td>多通道装置</td><td>自制</td><td></td><td>可选，该设备可由 PVC 管和合适的接头组装而成</td></tr><tr><td>蠕动泵</td><td>Micron Meters</td><td>RPP1300</td><td>可从以下网址获取：&amp;nbsp;http://www.micronmeters.com</td></tr><tr><td>血清移液管</td><td>多种品牌</td><td></td><td>一次性，10 ml</td></tr><tr><td>通用预增菌肉汤</td><td>Difco</td><td>223510</td><td></td></tr><tr><td>缓冲蛋白胨水</td><td>Difco</td><td>218105</td><td></td></tr><tr><td>沙门氏菌补充剂</td><td>Biom&amp;eacute;rieux Industry</td><td>42650</td><td>http://www.biomerieux-usa.com</td></tr><tr><td>VIDAS UP 李斯特菌（LPT）肉汤</td><td>Biom&amp;eacute;rieux Industry</td><td>410848</td><td>http://www.biomerieux-usa.com</td></tr><tr><td>万古霉素</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>861987</td><td>http://www.sigmaaldrich.com</td></tr><tr><td>移液器辅助器</td><td>多种品牌</td><td></td><td>本实验使用 Drummond DP-110</td></tr><tr><td>振荡培养箱</td><td>多种品牌</td><td></td><td>本实验使用 Excella E25，New Brunswick Scientific</td></tr><tr><td>微量移液器&amp;nbsp;</td><td>多种品牌</td><td></td><td>10 &amp;mu;l，1 ml</td></tr><tr><td>微量移液器吸头</td><td>多种品牌</td><td></td><td>带屏障，10 &amp;mu;l，1 ml</td></tr><tr><td>1.5 ml 微量离心管</td><td>多种品牌</td><td></td><td>无 RNase 和 DNase</td></tr><tr><td>探头式超声破碎仪</td><td>Q Sonica LLC</td><td>XL-2000 系列</td><td></td></tr><tr><td>&amp;micro;PADs</td><td>Avant&amp;nbsp;</td><td></td><td>蜡印直径 7 mm 的圆，线宽 4 pt。更多信息请联系 Charles Henry 博士</td></tr><tr><td>HEPES [&lt;em&gt;N&lt;/em&gt;-(2-羟乙基)哌嗪-&lt;em&gt;N&amp;prime;&lt;/em&gt;-2-乙磺酸]</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>牛血清白蛋白</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A8022</td><td></td></tr><tr><td>氯酚红-半乳吡喃糖苷（CPRG）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>59767</td><td></td></tr><tr><td>5-溴-4-氯-3-吲哚基-&amp;beta;-D-葡萄糖醛酸（X-Gluc）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B8174</td><td></td></tr><tr><td>5-溴-6-氯-3-吲哚基辛酸酯（品红辛酸酯）&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>53451</td><td></td></tr><tr><td>5-溴-4-氯-肌醇磷酸（X-InP）&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>38896</td><td></td></tr><tr><td>培养皿，聚苯乙烯，100 mm × 15 mm</td><td>多种品牌</td><td></td><td>无菌</td></tr><tr><td>平板扫描仪</td><td>多种品牌</td><td></td><td>Xerox USB 扫描仪</td></tr><tr><td>ImageJ 软件</td><td>美国国立卫生研究院</td><td></td><td>http://rsb.info.nih.gov/ij/</td></tr></tbody></table>

基于比色法的纸质检测 大肠杆菌, 沙门氏菌 和 spp. 单核细胞增生李斯特菌 从大量农业用水中

Colorimetric Paper-based Detection of Escherichia coli, Salmonella spp., and Listeria monocytogenes from Large Volumes of Agricultural Water

本方案描述了从大体积（10 L）农业用水中快速进行比色法检测大肠杆菌（Escherichia coli）、沙门氏菌（Salmonella spp.）和单核细胞增生李斯特菌（Listeria monocytogenes）的方法。在此方法中，水样通过无菌改良摩尔棉签（MMS）进行过滤，MMS由封装在塑料卡匣中的简单纱布滤膜组成&#160;，以实现细菌的浓缩。过滤后，在MMS中对目标细菌进行非选择性或选择性增菌。为实现目标细菌的比色检测，随后使用嵌入了细菌指示性底物的纸质分析装置（µPADs）对增菌液进行检测。每种底物与目标细菌特有的酶发生反应，生成可在µPAD上肉眼观察到的有色产物（定性检测）。或者，可使用常见的扫描或摄影设备获取反应后µPAD的数字图像，并利用ImageJ软件进行分析，从而实现对结果更客观、标准化的解读。尽管生化筛查程序旨在鉴定上述细菌病原体，但在某些情况下，背景微生物群产生的酶或比色底物的降解可能导致假阳性结果。因此，需采用更具区分能力的诊断方法进行确认。尽管如此，该细菌浓缩与检测平台成本低廉、灵敏度高（检测限为0.1 CFU/mL）、操作简便且快速（浓缩、增菌和检测过程在约24&#160;小时内完成），适合作为农业用水微生物质量的初步筛查方法。

如本方案所述，使用MMS（图1）浓缩细菌可在约15-20分钟内完成。MMS由丙烯腈-丁二烯-苯乙烯（ABS）材料制成，包含两个独立部件：一个盖子和一个滤筒，两者均集成了带旋塞的装置，用于插入圆柱形纱布拭子（图1A）。将两个部件拧合在一起即组成完整的MMS（图1B）。基于MMS的处理过程由电池驱动的蠕动泵推动，使得样品可在野外条件下进行浓缩。通过结合MMS浓缩、选择性增菌（18-24小时）以及µPAD检测技术，可对农业用水中的重要食源性致病菌和指示微生物（包括E. coli、Salmonella spp. 和 L. monocytogenes）进行快速（约24小时）、简便且低成本的筛查。采用本方案，这些目标细菌的检测限可低至0.1 CFU/mL。µPAD检测基于对细菌特异性酶的检测，这些酶可与比色底物发生反应并产生颜色变化（图2）。检测普通E. coli（非E. coli O157:H7）的检测体系会产生蓝绿色产物（...

本文介绍了一种用于在大体积农业用水中对食源性病原体进行一体化浓缩、富集及终点比色检测的方案。该方法通过改良莫尔棉签（Modified Moore Swabs, MMS）对水样进行过滤，利用选择性或非选择性培养基进行富集，并采用嵌有细菌显色比色底物的纸质分析装置（µPAD）进行检测。

本方案描述了从大体积（10 L）水样中快速进行比色法检测大肠杆菌、沙门氏菌属和单核细胞增生李斯特菌的方法。

本实验的总体目标是在大量农业用水中检测食源性病原体。为此，通过将一块折叠的纱布或粗棉布放入MMS盒中，组装一种改良的抹布装置，以下简称MMS。接下来，在采样现场，使用蠕动泵使大量水样通过MMS，从而富集目标细菌。随后将MMS的两端 tightly capped（紧密封口），并运回实验室。向MMS中加入选择性或非选择性增菌肉汤，于37°C孵育18至24小时。收集增菌后的培养物，并制备用于大肠杆菌检测的裂解液。将样品加入含有底物的微垫微点中，用于比色法酶学检测，并孵育长达三小时。随后对微垫进行检查和扫描。最终，通过对微点进行视觉和定量分析，可检测出浓度低至每毫升0.1个菌落形成单位（CFU）的大肠杆菌、沙门氏菌属和单核细胞增生李斯特氏菌。与膜过滤法和固体培养基培养法相比，该技术的主要优势在于能够处理更大体积的水样。这提高了检测的灵敏度，同时缩短了富集时间。与膜过滤法所需的24至48小时相比，该方法的检测时间可在24小时内完成，从而进一步缩短了检测周期。此外，该微型检测垫可同时检测三种不同的食源性病原体，而传统的固体细菌培养基无法实现这一功能。该技术的应用可拓展至农业用水的分析，以及野火或极端降雨等极端事件发生后的水质检测，因为这些事件均可能导致用于农作物灌溉的地表水中微生物污染增加。我们最初产生这一方法的构想，是在2012年和2013年夏季科罗拉多州发生野火后，需要对大量水样进行病原体快速筛查。由于采样地点偏远，难以将大量水样收集并运回实验室进行分析，因此该方法必须具备适用于野外现场检测的灵活性。开始本方案时，先准备一个改良的涂抹棒（MMS）：裁剪一块40厘米长、12厘米宽的四层纱布。沿两条较短边（AE）将纱布对折，得到一个20厘米长、6厘米宽的矩形。接着，沿其较长轴紧密卷起纱布，形成一个长约6厘米、直径约3厘米的圆柱形涂抹棒。将拭子插入锡箔袋中，并在15 PSI条件下使用干循环程序高压灭菌15分钟。灭菌完成后，该装置即可带往现场。到达地点后，将乙烯基管路连接至MMS两侧的旋塞阀上，确保管路完全贴合旋塞阀。然后将管路固定到蠕动泵上。确保蠕动泵上游的管路长度足够，以便采样时浓缩细菌。将蠕动泵的进样口置于待采样的农业用水中。以每分钟 300 毫升的流速运行蠕动泵，至少采集 10 升水样。采样完成后，将蠕动泵的进水口从水样中取出，并继续运行泵直至无出水为止。在完成浓缩后退出 MMS。对于所有改良的多拭子采样装置（MMS），需小心地将乙烯基管从MMS的出口处取下，并将MMS两端的出口盖紧。将盖紧的MMS在冷藏温度下保存最多12小时，然后再进行增菌。本实验中将演示大肠杆菌（E. coli）、沙门氏菌属（Salmonella species）和单核细胞增生李斯特菌（L. monocytogenes）的增菌过程。每个选择性增菌过程使用一个MMS。拧开MMS瓶盖，为富集大肠杆菌，加入20毫升无菌缓冲肽水（BPW），其中添加8毫克/升盐酸万古霉素。然后将MMS瓶盖重新拧紧。为富集沙门氏菌，加入20毫升无菌BPW培养基，并按每升添加4毫升的量加入沙门氏菌增菌补充剂；为富集单核细胞增生李斯特菌（L. monocytogenes），加入20毫升无菌UP List Area肉汤。将MMS置于摇床培养箱中，于150 RPM条件下培养18至24小时，待培养完成后进行后续操作。从培养箱中取出MMS，拧开盖子。轻轻将培养基倒入Falcon管中，然后用移液器小心转移0.5毫升至1.5毫升微量离心管中。为进行大肠杆菌选择性增菌的比色分析，或对非选择性增菌液进行分析，取0.5毫升增菌液，以5瓦、22千赫兹超声处理20秒。使用探头式匀浆器，在pH值调节后的HEPES缓冲液中配制底物C-P-R-G-X葡萄糖苷、Magenta-β-半乳糖苷以及XINP的储备液。将储备液避光保存于5°C环境中。CHLORO 三重等位基因、capite 或品红色 capite 对光敏感，可能因自降解而产生假阳性结果。针对每个检测的样品和目标，将一个微垫放入无菌培养皿中。检测大肠杆菌时，准备 CPRG 和 XGL 微垫。检测沙门氏菌时，准备品红盖微孔垫；检测单核细胞增生李斯特菌时，准备XINP微孔垫。使用移液器，将每种底物储备液各24 µL加入微孔垫的微孔中。在进行检测前，向每个相应的微孔垫中加入6 µL富集后的样品。将盖子放回培养皿上，并用封口膜密封。将样品与微垫一起在37摄氏度下孵育最多3小时，以使颜色显色并干燥微小斑点。孵育结束后，通过简单目视检查微垫的颜色变化进行检测。请注意，通常在增菌 18 至 24 小时后，会出现产生明确颜色变化的强反应。此类反应被视为阳性，无需进一步确认。如果存在大肠杆菌（e coli），嵌入 CPRG 的微小斑点将由黄色变为红色。紫色和微小斑点。嵌入xlu的微斑点会从无色变为蓝绿色，如此处所示。如果存在单核细胞增生性李斯特菌（L. monocytogenes），嵌入XINP的微斑点将从无色变为靛蓝色。如果存在沙门氏菌属细菌，嵌入品红精的微小斑点将从无色变为紫色。对于弱阳性反应，可使用软件对结果进行半定量分析。具体操作为：待微孔垫完全干燥后，使用平板扫描仪扫描微孔垫。使用 ImageJ 软件处理图像。接着在 ImageJ 中打开待分析的扫描图像。然后，为反转图像，点击主菜单中的“Edit”选项卡并选择“Invert”。使用主菜单中的“分析”选项卡，选择“设置测量值”，以选定要分析的报告测量参数。确保勾选“平均灰度强度”、“限定阈值”和“显示标签框”选项，然后点击“确定”。此设置将决定软件如何分析所选的每个区域以及如何报告结果。接下来，在“分析”选项卡下使用椭圆工具圈定待分析区域，然后选择“测量”。软件将测量所定义区域内平均灰度强度，并在弹出窗口中显示结果，该结果可复制并粘贴至 Excel 进行进一步分析。微孔板检测基于对指示性细菌酶的检测，这些酶可与显色底物发生反应。检测大肠杆菌的实验会产生蓝绿色产物和紫红色产物。检测沙门氏菌属和单核细胞增生李斯特菌的实验则分别产生紫色MOV和靛蓝色产物。此外，可使用Image J软件对数字化图像进行处理，以实现更客观、标准化的数据解读。此处展示了每种检测的数字化彩色图像和计量图像，均包含阴性对照和阳性对照测试。阴性对照测试使用不编码目标酶的细菌种类进行，而阳性对照测试则使用目标细菌进行。第一行显示原始扫描图像，第二行显示经过处理的图像。已使用 ImageJ 软件将扫描图像转换为灰度图像。第三行进行了颜色反转，以便后续对灰度强度进行解释。第四行显示了使用 ImageJ 测量的微阵列垫上每个微斑点的平均灰度强度。黄色箭头和圆圈标示了一个示例微斑点。该图表展示了由 ImageJ 测定的四个重复样本的平均灰度强度。针对每种颜色，进行了 I 型微阵列垫的阳性与阴性测试。这些数据表明，通过本方法可实现对从大体积农业水中浓缩的三种目标微生物进行模糊检测。观看本视频后，您应能够充分掌握如何组装改良的穆尔拭子，如何从大体积农业水中浓缩目标微生物，以及如何在基于纸张的分析装置上进行比色酶学检测与分析。在进行该实验步骤时，务必记住包含超声处理步骤以检测大肠杆菌。同时，应尽可能避免品红底物接触光照。在孵育前正确安装和组装MMS对于实验的完整性和后续显色反应至关重要。该技术作为一种简单、经济且快速的现场检测方法，在微生物病原体和指示微生物的诊断方面具有广阔的应用前景，其应用范围 beyond 食品安全领域，还可在环境微生物学和临床微生物学中发挥潜在作用。请务必注意，操作病原性微生物可能具有极高危险性，因此必须避免细菌增菌液的溢出以及生物气溶胶的产生。进行此操作时，应始终遵守处理病原微生物的标准预防措施。

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学习使用改良摩尔拭子（MMS）和比色纸基分析装置检测农业用水中的食源性病原体。该方法可快速浓缩大体积水样中的大肠杆菌、沙门氏菌和李斯特菌，实现24小时内现场筛查，提升食品安全监测效率。

基于比色法的纸质检测大肠杆菌, 沙门氏菌和 spp. 单核细胞增生李斯特菌从大量农业用水中

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