Name: 在抗病毒模式识别受体RIG-I和PKR通过有限蛋白酶消化和Native PAGE监测激活 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-07-29T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 43 s
Description: 了解RIG-I和PKR在病毒感染中的构象变化与寡聚化过程。本研究利用有限胰蛋白酶消化和Native PAGE技术，在A549细胞中监测抗病毒模式识别受体的激活机制，为先天免疫研究提供重要方法。

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我们感谢来自CISA-INIA的Alejandro Brun提供了抗裂谷热病毒血清。我们实验室的工作由以下机构资助：吉森和马尔堡大学医学中心合作合同第2条第3款规定的科研资助（Forschungsförderung gem. §2 Abs. 3 Kooperationsvertrag Universitätsklinikum Giessen und Marburg）、莱布尼茨新兴病毒性疾病研究生院（Leibniz Graduate School for Emerging viral diseases, EIDIS）、德国研究基金会特别研究领域（DFG Sonderforschungsbereich, SFB）1021以及德国研究基金会重点计划（DFG Schwerpunktprogramm, SPP）1596。

1. 感染用 A549 细胞的接种
<ol>
	<li>在含有细胞培养基（DMEM，添加10% FCS、526.6 mg/l L-谷氨酰胺、50.000 U/l 青霉素和50 mg/l 链霉素）的T75培养瓶中，于37 °C和5% CO2条件下培养A549细胞。</li>
	<li>开始收获细胞前，将细胞培养基、PBS和0.05%胰蛋白酶-EDTA置于37 °C水浴中预热。</li>
	<li>吸除培养基，用10 ml PBS洗涤细胞，随后吸除PBS。</li>
	<li>加入3 ml胰蛋白酶-EDTA，均匀覆盖培养瓶底部，将培养瓶转移至37 °C、5% CO2的培养箱中。</li>
	<li>待所有细胞脱落后，加入7 ml细胞培养基重悬细胞，并将细胞悬液转移至15 ml Falcon离心管中。</li>
	<li>在室温下以800 × g离心5分钟，弃上清，用10 ml新鲜细胞培养基重悬细胞沉淀。</li>
	<li>使用细胞计数板对细胞进行计数。</li>
	<li>将2.5 × 106个细胞加入5 ml细胞培养基中，分别接种至两个T25培养瓶中，于37 °C和5% CO2条件下培养16小时。其中一个培养瓶作为模拟对照，另一个用于Cl 13病毒感染。</li>
</ol>
2. 使用裂谷热病毒克隆 13（Cl 13）进行感染
<ol>
	<li>注意：Cl 13 是一种减毒病毒突变体，在德国可在 BSL-2 条件下操作。请参考相关国家指南。其他典型的干扰素诱导剂包括仙台病毒（Cantell 株）或新城疫病毒。</li>
	<li>预热 PBS、无血清培养基以及含 5% FCS 的细胞培养基。</li>
	<li>用无血清培养基配制浓度为 1.25 × 107 PFU/ml 的 Cl 13 病毒液，用于以感染复数（MOI）5 的条件感染 2.5 × 106 个 A549 细胞。为避免移液误差，应准备略多（约 10%）于实际所需量的病毒液。</li>
	<li>按照步骤 1.3 所述方法用 PBS 洗涤细胞。</li>
	<li>向细胞中加入 1 ml Cl 13 稀释液或无血清培养基（未感染对照组，模拟感染），在 37 °C、5% CO2 条件下孵育 1 小时。每 15 分钟轻柔晃动培养瓶一次，以确保 Cl 13 稀释液或无血清培养基均匀分布。</li>
	<li>感染 1 小时后，移除接种物，加入 5 ml 预热的含 5% FCS 的细胞培养基，在 37 °C、5% CO2 条件下继续孵育 5 小时。</li>
</ol>
3. 细胞裂解物的制备
<ol>
	<li>在 4 °C 下配制 PBS / 0.5% Triton X-100。不要添加丝氨酸蛋白酶抑制剂。</li>
	<li>用预冷的 PBS 洗涤细胞，并加入 10 ml 新鲜 PBS。</li>
	<li>刮下细胞，将细胞悬液转移至离心管中，在室温下以 800 × g 离心 5 分钟。</li>
	<li>弃去上清液，将细胞沉淀重悬于 30 µl PBS / 0.5% Triton X-100 中。将裂解液转移至新的 1.5 ml 离心管，并在 4 °C 下孵育至少 10 分钟。</li>
	<li>在 4 °C 下以 10,000 × g 离心 10 分钟，将澄清的细胞裂解液（上清液）转移至新的离心管中。</li>
	<li>采用 Bradford 法测定蛋白浓度，具体步骤参见其他文献33。</li>
	<li>可在 -20 °C 保存，或直接进行胰蛋白酶消化（4.1）或非变性 PAGE（5.1）。</li>
</ol>
4. 模式识别受体构象变化的测定
<ol>
	<li>细胞裂解液的 TPCK-胰蛋白酶处理
	<ol>
		<li>用 PBS 将甲苯磺酰苯丙氨酰氯甲基酮处理的（TPCK 处理的）胰蛋白酶稀释至终工作浓度为 2 µg/µl。</li>
		<li>在两个新离心管中，用 PBS 将每种蛋白裂解液（mock 或 Cl 13）调整至终体积为 9 µl、终蛋白浓度为 25 µg。因此应共准备四管，每管含 25 µg 裂解蛋白，其中 mock 感染两次，Cl 13 感染两次。一组作为输入对照（未处理），另一组用于 TPCK-胰蛋白酶处理。</li>
		<li>向各细胞裂解液中加入 1 µl PBS（未处理）或 1 µl 浓度为 2 µg/µl 的 TPCK-胰蛋白酶（终浓度：0.2 µg/µl），并通过移液混匀反应体系。切勿反复冻融 TPCK-胰蛋白酶分装样品，以免影响消化效率。</li>
		<li>在 37 °C 孵育裂解液 25 分钟。加入 5 倍变性上样缓冲液（250 mM Tris-HCl pH 6.8，10% SDS，50% 甘油，25% β-巯基乙醇，0.5% 溴酚蓝）并 95 °C 煮沸 5 分钟以终止反应。注意：胰蛋白酶孵育时间不可延长。若未检测到蛋白酶抗性片段，则必须缩短胰蛋白酶消化时间。</li>
		<li>煮沸后，样品可在 -20 °C 保存。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）及蛋白质印迹
	<ol>
		<li>将样品上样至含 5% 浓缩胶和 12% 分离胶的十二烷基硫酸钠（SDS）聚丙烯酰胺凝胶中，每块凝胶以 25 mA 恒流电泳，直至溴酚蓝迁移出凝胶底部。</li>
		<li>用甲醇活化聚偏二氟乙烯（PVDF）膜 30 秒，随后将其放入转移缓冲液（48 mM Tris，39 mM 甘氨酸，1.3 mM SDS，20% 甲醇）中。</li>
		<li>使用半干式转膜系统进行转膜，于 10 V 条件下转移 1 小时。取出膜，用去离子水短暂漂洗，然后晾干。</li>
		<li>将膜短暂浸入甲醇中重新活化，随后用 TBS 洗涤 5 分钟。用含 10% 脱脂奶粉的 TBS 室温封闭 1 小时，或 4 °C 过夜。用 TBS 洗涤膜 3 次，每次 5 分钟。</li>
		<li>按照表 1 推荐条件配制一抗稀释液，室温孵育 1 小时，或 4 °C 过夜。</li>
		<li>用 TBS-T 洗涤膜 3 次，每次 10 分钟。加入以 1:20,000 比例稀释于含 1% 脱脂奶粉 TBS 中的相应辣根过氧化物酶标记的二抗，室温孵育 45 分钟。</li>
		<li>用 TBS-T 洗涤膜 3 次，每次 10 分钟，最后再用 TBS 洗涤一次。</li>
		<li>使用商用化学发光检测试剂盒和数字凝胶成像系统进行信号检测。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>考马斯亮蓝 G-250 染色
	<ol>
		<li>按 4.2.1 所述进行 SDS-PAGE。将样品上样至 SDS 聚丙烯酰胺凝胶，每块凝胶以 25 mA 恒流电泳，直至溴酚蓝迁移出凝胶底部。</li>
		<li>在室温下进行考马斯亮蓝 G-250 染色。所有孵育步骤均需持续振荡。</li>
		<li>将凝胶转移至含 40% 甲醇和 10% 乙酸的固定液中，固定 30 分钟。</li>
		<li>更换为脱色液（25% 乙醇和 8% 乙酸），孵育 5 分钟。</li>
		<li>用含 0.2% 考马斯亮蓝 G-250、40% 甲醇和 10% 乙酸的染色液染色 1 小时。</li>
		<li>用脱色液进行脱色处理，并在 10 分钟、30 分钟和 60 分钟后更换脱色液。</li>
		<li>将凝胶保存于含 25% 乙醇、8% 乙酸和 4% 甘油的溶液中，4 °C 保存。</li>
		<li>按 4.2.8 所述进行成像与分析。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. 模式识别受体寡聚状态的分析
<ol>
	<li>非变性PAGE
	<ol>
		<li>将50 µg细胞裂解液用PBS稀释至终体积10 µl，并加入5×非变性上样缓冲液（250 mM Tris-HCl pH 6.8、1% 脱氧胆酸钠、50% 甘油、0.5% 溴酚蓝），使终浓度为1×。</li>
		<li>立即将样品上样至非变性聚丙烯酰胺凝胶，其中浓缩胶为5%，分离胶为8%。任何延迟均会导致天然复合物损失34。</li>
		<li>在4 °C条件下，以50 mM Tris-NaOH pH 9.0、384 mM 甘氨酸作为阳极缓冲液，50 mM Tris pH 8.3、384 mM 甘氨酸、1% 脱氧胆酸钠作为阴极缓冲液，每块凝胶20 mA恒流电泳。电泳1.5–2小时后结束（溴酚蓝条带约在45分钟前已离开凝胶）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>蛋白质印迹（Western Blotting）
	<ol>
		<li>将聚偏二氟乙烯（PVDF）膜用甲醇活化30秒，随后放入托宾缓冲液（25 mM Tris、192 mM 甘氨酸、0.1% SDS、20% 甲醇）中。</li>
		<li>按照制造商说明组装湿转装置，并用托宾缓冲液充满转膜槽。</li>
		<li>在4 °C条件下，以250 mA恒流转膜1.5小时。</li>
		<li>转膜完成后，按4.2.3节及后续步骤进行操作。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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</ol>

未声明任何利益冲突。

感知病毒的存在并激活抗病毒I型干扰素系统对于成功的先天免疫应答至关重要22。病毒的检测由模式识别受体（PRRs）如RIG-I和PKR介导，从而能够快速启动并激活抗病毒防御机制。本文中，我们描述了两种直接评估RIG-I和PKR激活状态的方法。
利用有限蛋白酶消化来监测RIG-I和PKR构象变化的方法，最初分别由M. Gale Jr. 和T. Fujita6,17以及J. L. Cole30的研究团队提出。该方法是一种灵敏的手段，用于评估因构象改变而导致的胰蛋白酶处理敏感性变化。通过胰蛋白酶消化实验，我们发现模拟感染样本中的RIG-I和PKR迅速降解，而病毒感染细胞裂解物经胰蛋白酶处理后则产生抗胰蛋白酶的RIG-I片段。类似地，在Cl 13病毒感染条件下也检测到抗胰蛋白酶的PKR片段。该现象伴随PKR在Thr 446位点的磷酸化，后者是广泛使用的PKR活化标志。通过考马斯亮蓝染色比较模拟感染与Cl 13病毒感染细胞裂解物的胰蛋白酶消化结果，显示总体蛋白质水平下降程度相似。这表明抗性片段的形成是RIG-I和PKR等蛋白质所...

在抗病毒宿主防御中，一个关键事件是所谓的模式识别受体（PRRs）对病原体的快速识别1,2。细胞内对RNA病毒感染的检测依赖于两种胞质RNA解旋酶：RIG-I（视黄酸诱导基因I）和MDA5（黑色素瘤分化相关蛋白5）3-5。RIG-I由两个N端的胱天蛋白酶募集结构域（CARDs）、一个中央的DECH-box型RNA解旋酶结构域以及一个C端结构域（CTD）组成4,6。其中CTD和解旋酶结构域负责识别非自身（病毒）RNA，而CARDs则介导下游信号传导，从而建立抗病毒的宿主状态。
如果RIG-I处于静息状态，即在缺乏特异性RNA配体的情况下，其第二个CARD结构域会与中央解旋酶结构域相互作用，使RIG-I保持自抑制构象7-11。RIG-I可结合带有5'-三磷酸基团（5'PPP）的短双链（ds）RNA、长双链RNA以及富含polyU/UC的RNA，这些是多种RNA病毒基因组中存在的典型特征结构12-16。RIG-I活化的两个主要特征是构象转变为闭合状态6,17以及发生同源寡聚化6,18,19。构象转变可增强RNA结合能力，暴露CARD结构域以启动下游信号传导，并重建具有活性的ATP酶位点8,9,11,20。寡聚化RIG-I复合物的形成有助于更有效地招募下游信号接头分子，从而构建抗病毒信号转导平台11。RIG-I调控的信号通路最终激活转录因子IRF-3，上调干扰素（IFN-α/β）基因的表达，进而诱导干扰素刺激基因（ISGs）的表达，实现完整的抗病毒反应21,22。其中研究最为清楚的ISG之一是RNA依赖性蛋白激酶（PKR）23。PKR属于真核翻译起始因子2α（eIF2α）激酶家族，由N端双链RNA结合结构域和C端激酶结构域组成。激酶结构域构成PKR活化所必需的二聚化界面，并执行该蛋白的催化功能。PKR与病毒双链RNA结合后发生构象改变，允许其在Thr 446等多个位点发生二聚化及自磷酸化。随后PKR介导eIF2α的磷酸化，从而阻断病毒mRNA的翻译23-27。
RIG-I 和 PKR 均会发生显著的结构重排，形成寡聚复合物，并通过磷酸化/去磷酸化以及泛素化进行翻译后修饰10,11,19,23,24,26-29。为了更清楚地了解哪些病毒RNA结构能够激活 RIG-I 和 PKR（以及病毒拮抗因子可能在哪个阶段进行干扰），精确确定其激活状态至关重要。先前已有研究报道，这两种模式识别受体（PRR）在激活后会产生抗胰蛋白酶消化的蛋白片段6,17,30，并形成高级寡聚体6,18,19。然而，尽管关于这些抗病毒宿主应答关键因子的文献极为丰富1,2,24，直接检测方法的应用却相对少见。为了促进这些方法的更广泛应用，本文提供了简便且灵敏的实验方案，可用于可靠地分析 RIG-I 和 PKR 的激活状态。采用具有干扰素产生能力的人源细胞系 A549，以已知的 RIG-I 和 PKR 激活剂——减毒裂谷热病毒突变株克隆 13（Cl 13）31,32进行感染。经过简单的细胞裂解处理后，利用有限胰蛋白酶消化结合蛋白质印迹（Western blot）分析检测感染细胞提取物中蛋白构象的转变，并通过蓝色天然聚丙烯酰胺凝胶电泳（blue native PAGE）结合 Western blot 分析检测寡聚体的形成。

<table><tbody><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;细胞培养&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Dulbecco&amp;rsquo;s 改良 Eagle&amp;rsquo;s 培养基 (&lt;font class=&quot;font6">DMEM)&lt;/font&gt;</td><td>Gibco</td><td>21969-035</td><td></td></tr><tr><td>OptiMEM</td><td>Gibco</td><td>31985-47</td><td></td></tr><tr><td>L-谷氨酰胺</td><td>PAA</td><td>25030-024</td><td></td></tr><tr><td>青霉素-链霉素</td><td>PAA</td><td>15070-063</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清 (FCS)</td><td>PAA</td><td>10270</td><td></td></tr><tr><td>0.05% 胰蛋白酶-EDTA</td><td>Gibco</td><td>25300-054</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;化学试剂&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>L-1-对甲苯磺酰胺-2-苯乙基氯甲基酮处理的 (TPCK) 胰蛋白酶</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T1426</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;抗体&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>小鼠单克隆抗 RIG-I 抗体 (ALME-1)</td><td>Enzo Life Sciences</td><td>ALX-804-849-C100</td><td>WB: 1:500，溶于含 1% 脱脂奶粉的 TBS</td></tr><tr><td>小鼠单克隆抗 PKR 抗体 (B10)</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-6282</td><td>WB: 1:500，溶于含 1% 脱脂奶粉的 TBS</td></tr><tr><td>兔单克隆抗磷酸化 PKR 抗体 (Thr446)</td><td>Epitomics</td><td>1120-1</td><td>WB: 1:1,000，溶于含 5% BSA 的 TBS</td></tr><tr><td>兔多克隆抗 IRF-3 抗体</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-9082</td><td>WB: 1:500，溶于含 1% 脱脂奶粉的 TBS</td></tr><tr><td>兔单克隆抗磷酸化 IRF-3 抗体 (Ser386)</td><td>IBL</td><td>og-413</td><td>WB: 1:100，溶于含 1% 脱脂奶粉的 TBS</td></tr><tr><td>兔抗裂谷热病毒高免血清 &quot;C2&quot; (MP-12)</td><td>由 Alejandro Brun CISA-INIA 惠赠</td><td></td><td>WB: 1:2,000，溶于含 1% 脱脂奶粉的 TBS</td></tr><tr><td>小鼠单克隆抗 β-肌动蛋白抗体 (8H10D10)</td><td>Cell Signalling</td><td>3700</td><td>WB: 1:1,000，溶于含 1% 脱脂奶粉的 TBS</td></tr><tr><td>辣根过氧化物酶标记的多克隆山羊抗兔 IgG</td><td>Thermo Fisher</td><td>0031460 1892914</td><td>WB: 1:20,000，溶于含 1% 脱脂奶粉的 TBS</td></tr><tr><td>辣根过氧化物酶标记的多克隆山羊抗小鼠 IgG</td><td>Thermo Fisher</td><td>0031430 1892913</td><td>WB: 1:20,000，溶于含 1% 脱脂奶粉的 TBS</td></tr></tbody></table>

通过有限蛋白酶消化和天然page监测抗病毒模式识别受体rig-i和pkr的激活

Monitoring Activation of the Antiviral Pattern Recognition Receptors RIG-I And PKR By Limited Protease Digestion and Native PAGE

宿主对病毒感染的防御依赖于先天免疫系统中的模式识别受体（PRRs）对病原体的快速识别。在细胞质中，PRRs中的RIG-I和PKR可结合特定的病毒RNA配体。这一过程首先介导受体构象改变和寡聚化，进而激活抗病毒干扰素反应。尽管检测宿主抗病毒基因表达的方法已较为成熟，但直接监测RIG-I和PKR激活状态的方法尚不完善，且应用较少。
本文中，我们描述了两种方法，用于监测感染已知的干扰素诱导剂——裂谷热病毒突变株克隆13（Cl 13）后RIG-I和PKR的激活情况。通过有限胰蛋白酶消化，可分析模式识别受体（PRRs）蛋白酶敏感性的变化，从而反映其构象改变。模拟感染细胞裂解物的胰蛋白酶消化结果显示RIG-I和PKR迅速降解，而Cl 13感染则导致出现一种抗蛋白酶的RIG-I片段。PKR同样表现出病毒诱导的部分抗胰蛋白酶消化特性，该特性与其在Thr 446位点的标志性磷酸化一致。RIG-I和PKR寡聚体的形成通过非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）得以验证。感染后，RIG-I和PKR的寡聚复合物显著积累，而在模拟感染样本中，这两种蛋白则以单体形式存在。
将有限蛋白酶消化和天然PAGE电泳分别与蛋白质印迹分析相结合，可灵敏且直接地检测RIG-I和PKR激活过程中的两个不同步骤。这些技术操作相对简便、快速，且无需昂贵的仪器设备。

RIG-I 或 PKR 对病毒激动剂的识别会触发构象转换6,17,30和寡聚化6,18,27。我们分别通过有限蛋白酶消化和非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）检测了这两种活化标志。
人A549细胞被裂谷热病毒克隆株13（Cl 13）感染，该病毒株的特点是干扰素拮抗蛋白NSs存在突变35,36。由于缺乏功能性NSs蛋白，克隆株13可强烈诱导RIG-I和PKR，从而在细胞内建立强烈的抗病毒状态12,31,32,37。
模拟感染细胞裂解物的胰蛋白酶消化导致RIG-I迅速降解，而Cl 13感染则产生一个30 kDa的抗胰蛋白酶消化的RIG-I片段图1A。此外，PKR在感染样品中也表现出对胰蛋白酶消化的部分抗性，这与其磷酸化状态一致图1A。为监测胰蛋白酶消化的效率和特异性，凝胶使用考马斯亮蓝G-250染色。未经处理的样品显示上样蛋白量相等图1B。将模...

针对病毒感染的先天防御反应由模式识别受体（PRRs）触发。两种胞质PRRs——RIG-I和PKR——可结合病毒特征性RNA，发生构象改变、寡聚化，并激活抗病毒信号通路。本文描述的方法可方便地监测这些胞质PRRs的构象转换和寡聚化过程。

通过有限蛋白酶消化和天然PAGE监测抗病毒模式识别受体RIG-I和PKR的激活

病毒侵染的宿主防御依赖于先天免疫系统中的模式识别受体（PRRs）对病原体的快速识别。在细胞质中，……

针对病毒感染的先天防御由模式识别受体（PRR）触发，这些受体存在于先天免疫系统的细胞中。在感染期间，细胞质中的PRR（如RIG-I和PKR）可结合病毒特征性RNA，发生构象改变并被配体化，从而激活抗病毒信号通路。为在体外监测RIG-I和PKR的构象变化及配体化过程，使用裂谷热病毒（Rift Valley fever virus）感染人A549细胞。使用Clone 13刺激PRR活化。随后制备对照组和感染细胞的细胞裂解液，以分析rig eye和PKR的构象变化。进行有限的胰蛋白酶消化。如果蛋白质结构发生了构象变化，该蛋白质对消化的抗性会增强，通过蛋白质印迹分析可检测到条带，以分析所有天然非变性PAGE中复合物的形成，随后进行蛋白质印迹分析。如果所有配体化过程均已发生，则会观察到更高水平的All-liga-rig-eye和PKR复合物。有限蛋白酶消化结合非变性PAGE的主要优势在于，这些技术有助于直接检测Riga和PKR的激活状态。这些方法有助于回答先天免疫领域中的一些关键问题，例如与 RIG-I 和 PKR 激活相关的 RNA 分子的确切性质和来源是什么。这些方法可为研究 RIG-I 和 PKR 的激动剂提供见解。此外，该方法还可应用于其他胞质传感器蛋白，例如 MDA5。接下来演示实验操作的是来自我实验室的博士生 Mila Viva，在开始本实验流程之前。请注意，下文所述的裂谷热病毒克隆株 13（以下简称 CL 13）是一种减毒病毒突变体，在德国必须在 BSL-2 条件下操作。将无血清 PBS 培养基和含 5% FCS 的细胞培养基预热，置于水浴中，并分装至 1.5 毫升微量离心管中。用无血清培养基配制浓度为每毫升 1.25 × 10⁷ PFU 的 CL 13 病毒液，用于感染 2.5 × 10⁶ 个细胞。以感染复数（MOI）为五的剂量将CL13病毒接种至A549细胞中，病毒用量比所需量多准备约10%，以弥补移液误差。从培养箱中取出A549细胞，吸除培养基，加入10毫升磷酸盐缓冲液（PBS），轻轻摇晃或倾斜培养瓶以洗涤细胞，随后去除PBS。接着，向细胞中加入1毫升稀释后的CL13病毒液；对于未感染对照组（模拟感染组），则加入等量的不含病毒的对照液。加入一毫升无血清培养基，每15分钟孵育一次，共孵育一小时。轻轻倾斜培养瓶，以确保培养基均匀分布。感染一小时后，移除接种物。加入5毫升预热的含5%FCS的细胞培养基，孵育5小时。配制含0.5%Triton X-100的PBS，并置于4°C。不要加入叙利亚仓鼠蛋白酶抑制剂。接下来，用预冷的PBS洗涤细胞，并加入10毫升新鲜PBS。然后使用细胞刮刀将细胞从培养皿上刮下。将细胞悬液转移至15毫升锥形离心管中，在室温下以800 × g离心5分钟。离心后，弃去上清液，将细胞沉淀重悬于30 µL含0.5% Triton X-100的PBS中。将裂解液转移至新的1.5 mL离心管中，在冰上孵育至少10分钟。在4°C条件下，以10,000 ×g离心10分钟。离心后，将澄清的细胞裂解液转移至新的离心管中。进行 Bradford 法测定，以确定澄清细胞裂解液中的蛋白浓度。可于 -20 °C 保存，或立即进行后续实验，如酶切消化或非变性 PAGE，以检测模式识别受体的构象变化。首先，在 PBS 中将 TPCK 处理的胰蛋白酶稀释至终工作浓度为每毫升 2 微克（每个实验条件准备两个新管）。将 CL13 感染组和未感染对照组的蛋白裂解液用 PBS 调整至终体积为 9 微升，蛋白总量为 25 微克。其中一组裂解液作为输入对照，另一组则加入 TPCK 胰蛋白酶进行处理；未处理对照管中加入 1 微升 PBS 至剩余两个管中。加入1微升浓度为每微升2微克的TPCK胰蛋白酶，使终浓度达到每微升0.2微克。通过移液混匀反应体系。将裂解液在37摄氏度孵育25分钟。加入五倍体积的变性上样缓冲液并置于95摄氏度下煮沸5分钟以终止反应。注意不要延长胰蛋白酶孵育时间。需注意，胰蛋白酶消化时间的精确控制对于在无背景干扰的情况下检测抗性片段至关重要；如果未检测到抗性蛋白或检测到过多抗性蛋白，应相应调整消化时间。煮沸后，将样品在零下20摄氏度保存，或立即将样品加入两个十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶中，每个凝胶由5%的浓缩胶和12%的分离胶组成。以每块凝胶25毫安的电流进行电泳，直至溴酚蓝跑出凝胶。运行凝胶后，将蛋白质从一块凝胶转移至聚偏氟乙烯膜，并使用针对 Rig-I 和 PKR 的抗体通过蛋白质印迹法进行分析；另一块凝胶则用考马斯亮蓝 G-250 染色。随后将染色后的凝胶储存于含 25% 乙醇、8% 乙酸和 4% 甘油的溶液中，置于 4°C 保存，或直接进行成像与分析。为分析模式识别受体的寡聚状态，取 50 微克细胞裂解液，用 PBS 调整终体积至 10 微升，再加入 5× 上样缓冲液，使终浓度为 1×。立即将样品上样至含有5%浓缩胶和8%分离胶的非变性聚丙烯酰胺凝胶中。任何延迟都会导致天然复合物的损失。在4°C条件下，以每块凝胶20毫安的电流电泳运行凝胶。在溴酚蓝条带离开凝胶后45分钟停止电泳，每次电泳总时间约为1.5至2小时，随后使用针对RIG-I和PKR的抗体进行Western blotting，具体方法见随附文件，用于检测由RIG-I或PKR识别病毒激动剂所引发的构象转换和寡聚化。限制性蛋白酶消化和天然PAGE实验操作如本视频所述。对模拟感染细胞裂解液进行胰蛋白酶消化后，RIG-I迅速降解；而Clone 13感染则产生了一个30千道尔顿的抗性RIG-I片段。PKR在感染样本中也表现出对胰蛋白酶消化的部分抗性，这与其磷酸化状态一致。为监测胰蛋白酶消化的效率和特异性，凝胶使用考马斯亮蓝G-250染色。未处理样本显示所加载的蛋白量相等，将模拟感染和C13细胞裂解液进行胰蛋白酶消化后，总体蛋白量出现可比的下降。这表明，在未感染的细胞中，胰蛋白酶处理对模拟处理组和CL 13感染样本具有相同的效率。作为额外对照，仅检测到R EYE和PKR的单体。同时包括了转录因子IRF3，其以单体形式存在，但已知可通过R Eye激活后发生二聚化。克隆13感染导致RIG-I寡聚复合物以弥散条带形式大量积累，以及PKR和IRF3以明确蛋白条带形式存在的二聚体或寡聚体。这些结果表明，有限的胰蛋白酶消化结合非变性PAGE是监测感染后RIG-I和PKR构象变化及寡聚化形成的有用工具。观看本视频后，您应能够充分掌握如何监测RIG-I和PKR在感染后的构象转换与寡聚化过程。按照本方案，该技术可在两天内完成。此外，还可进行类似于原代细胞检测的方法，以回答其他问题，例如刺激性配体在发育后是否与受体形成稳定的相互作用。该技术为先天免疫领域的研究人员探索病毒刺激细胞中模式识别受体的活化状态奠定了基础。

monitoring-activation-antiviral-pattern-recognition-receptors-rig-i

Research

科研

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学与感染

在抗病毒模式识别受体RIG-I和PKR通过有限蛋白酶消化和Native PAGE监测激活

我们描述了一种用于鉴定宿主信号分子在模式疱疹病毒——γ疱疹病毒68（γHV68）裂解性复制中关键作用的实验方案。通过利用基因修饰小鼠品系和胚胎成纤维细胞进行γHV68的裂解性复制，该方案可同时实现对病毒-宿主相互作用的表型特征分析和分子水平研究。...

解析模型疱疹病毒裂解复制中的宿主-病毒相互作用

来源：Mateer, E., 等，负链RNA病毒感染中双链RNA与模式识别受体的共聚焦成像。J. Vis. Exp.

感染上皮细胞中病毒双链RNA与宿主模式识别受体的可视化

我们描述了一种用于检测感染了模型疱疹病毒——小鼠γ疱疹病毒68（murine gammaherpesvirus 68, MHV-68）的小鼠体内抗病毒细胞因子产生的实验方案。γHV68），该病毒与人类卡波西肉瘤相关疱疹病毒（KSHV）和EB病毒（EBV）密切相关。利用基因修饰的小鼠品系和小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs），我们评估了抗病毒细胞因子的产生情况 体内 和...

解析病毒逃逸细胞因子产生过程中的天然免疫信号传导

本文介绍了一种能够对IRF3转录因子的磷酸化依赖性激活进行详细分析的实验方法。该方法结合了高分辨率SDS-PAGE和天然PAGE，并利用多种磷酸化特异性抗体进行免疫印迹分析，从而实现对IRF3活化状态的精确检测。...

一种监测IRF3磷酸化依赖性激活的高分辨率方法

RNA病毒复制过程中产生的双链RNA可被模式识别受体识别，从而诱导先天免疫反应。对于负链RNA病毒而言，低水平的双链RNA与模式识别受体之间的相互作用仍不明确。我们开发了一种共聚焦显微镜方法，用于在单个细胞中可视化沙粒病毒的双链RNA和模式识别受体。...

负链RNA病毒感染中双链RNA与模式识别受体的共聚焦成像

我们介绍了利用HeLa细胞研究哺乳动物细胞周期中双链RNA结合蛋白激酶RNA激活型（PKR）的RNA相互作用分子的实验方法。该方法利用甲醛交联RNA-PKR复合物，并通过免疫沉淀富集与PKR结合的RNA。这些RNA可进一步通过高通量测序或定量逆转录PCR（qRT-PCR）进行分析。...

研究哺乳动物细胞周期中蛋白激酶RNA激活剂的RNA相互作用分子

本文提供了一种利用转染了双向报告质粒（表达tdTomato和eGFP）的HEK293T细胞，通过流式细胞术（FACS）检测BK多瘤病毒转录活性的实验方案。该方法还可用于定量评估新化合物对病毒转录的影响。...

通过流式细胞术测量BK多瘤病毒非编码调控区驱动的转录活性

本文介绍了一种用于分析CAL-1浆细胞样树突状细胞系中内源性干扰素调节因子5二聚化的天然蛋白质印迹法。该方案也可应用于其他细胞系。...

天然聚丙烯酰胺凝胶电泳免疫印迹分析内源性IRF5二聚化

我们提出了一种通用方案，用于识别嵌入病毒多聚蛋白中的宿主-病原体蛋白短序列同源区（SSHHPS）。多种第四组病毒可利用病毒蛋白酶识别SSHHPS，并靶向降解特定的宿主蛋白。...

利用体外与计算机模拟方法分析第四组病毒SSHHPS

本方案描述了一种全面的方法，用于检测在两种刺激条件下caspase激活（caspase-1、caspase-3、caspase-7、caspase-8、caspase-9 和 caspase-11）的反应 体外 和 体内...

评估半胱天冬酶激活以检测天然免疫细胞死亡

免疫荧光染色过程中使用酪胺信号放大技术，可灵敏地检测 HSV-1 感染后 ZBP1 介导的坏死性凋亡过程中磷酸化的 RIPK3 和...

酪胺信号放大法用于人细胞中HSV-1感染后ZBP1依赖性RIPK3和MLKL磷酸化的免疫荧光染色

了解RIG-I和PKR在病毒感染中的构象变化与寡聚化过程。本研究利用有限胰蛋白酶消化和Native PAGE技术，在A549细胞中监测抗病毒模式识别受体的激活机制，为先天免疫研究提供重要方法。

通过有限蛋白酶消化和天然PAGE监测抗病毒模式识别受体RIG-I和PKR的激活

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