在抗病毒模式识别受体RIG-I和PKR通过有限蛋白酶消化和Native PAGE监测激活

对病毒感染的先天防御是由模式识别受体或 prr 触发的。在感染期间存在于先天免疫系统的细胞中。细胞质 PRRS、rig 眼和 PKR 与病毒特征 RNA 结合，改变确认所有 liga 眼并激活抗病毒信号以监测 rig 眼和 PKR 确认变化和所有韧带化 体外人 A 5 49 细胞感染裂谷热病毒。

克隆 13 以刺激 PRR 激活。然后制备对照细胞和感染细胞的细胞裂解物，以分析 rig 眼和 PKR 确认变化。进行有限的试穿酶消化。

如果蛋白质结构发生了确认性变化，则蛋白质更耐消化，并且使用 Western blotting 分析将看到条带，以分析 allgas 天然页面的形成，然后进行 Western blotting 分析。如果所有韧带化都发生在较高位置，则可以看到所有韧带支架眼和 PKR 复合物。有限蛋白酶消化和天然页面的主要优点是这些技术有助于直接测量 rega 和 PKR 激活。

这些方法可以帮助回答先天免疫领域的关键问题，例如与 rig eye 和 PKR 激活相关的 RNA 种类的确切性质和来源是什么。这些方法可以深入了解 rig eye 和 PKR 激动剂。它们也可以应用于其他细胞质传感器蛋白，例如 MDA 5，演示该程序将是我实验室的博士生 Mila Viva在开始此程序之前。

请注意，裂谷热病毒克隆 13，以下简称 CL 13，是一种减毒病毒突变体，在德国必须在 BSL 两种条件下处理，以预热 PBS 无血清培养基和含有 5% FCS 的细胞培养基。将它们放入 1.5 毫升微量离心管中的水浴中。在无血清培养基中制备每毫升 CL 13 的 1.25 倍 10 至第 7 个 PFU，以感染 2.5 倍 10 至第 6 个 PFU。

A 5 49 个感染多重性或 MOI 为 5 的细胞制备的细胞比解释移液错误所需的细胞多大约 10%。从培养箱中取出 A 5 49 细胞，吸出培养基并加入 10 毫升 PBS 涡旋或倾斜培养瓶以洗涤细胞，然后取出 PBS。接下来，加入一毫升稀释的 CL 13 或用于未感染的对照或模拟感染。

加入 1 mL 无血清培养基，每 15 分钟孵育 1 小时。小心地倾斜培养瓶，以确保培养基均匀分布。感染 1 小时后，取下 Inphthaltor。

加入 5 mL 含 5% FCS 的预热细胞培养基，孵育 5 小时。准备含有 0.5% tritton X 100 的 PBS，并将其置于 4 摄氏度。请勿添加叙利亚蛋白酶抑制剂。

接下来，用冷 PBS 洗涤细胞并加入 10 毫升新鲜 PBS。然后使用细胞刮刀将细胞从培养皿中分离出来。将细胞悬液转移至 15 mL 锥形管中，并在室温下以 800 倍 G 离心 5 分钟。

离心后，去除上清液，将细胞沉淀重悬于 30 微升含 0.5% Triton X 100 的 PBS 中。将裂解液转移到新鲜的 1.5 mL 试管中，并在冰上孵育至少 10 分钟。将裂解物在 4 摄氏度下以 10， 000 倍 G 离心 10 分钟。

离心后，将澄清的细胞裂解物转移到新试管中。进行 Bradford 测定以确定澄清的细胞裂解物中的蛋白质浓度储存在零下 20 摄氏度或立即进行尝试消化或天然页面测定模式识别受体的确认变化首先在 PBS 中稀释 L 一托斯托氯、甲基酮处理或 TPCK 胰蛋白酶至最终工作浓度为每毫升 2 微克，在每种情况下的两个新试管中， 用 PBS 将 CL 13 和未感染的对照蛋白裂解物的最终蛋白质浓度调节至 25 微克，最终体积为 9 微升，一组裂解物将用作输入对照，另一组将用 TPCK 胰蛋白酶处理到未处理的对照管中。向其余两管中加入 1 微升 PBS。

添加 1 微升每微升 2 微克 TPCK 胰蛋白酶，使最终浓度达到 0.2 微克/微升。通过移液混合反应。将裂解物在 37 摄氏度下孵育 25 分钟。

加入 5 x 变性样品缓冲液，然后在 95 °C 下煮沸 5 分钟，终止反应。重要的是不要延长胰蛋白酶孵育时间。请注意，胰蛋白酶消化的精确时间对于检测没有任何背景的抗性片段至关重要，如果未检测到抗性蛋白质或检测到太多，请调整消化持续时间。因此。

煮沸后，将样品储存在零下 20 摄氏度或将样品加载到两个多卡硫酸钠上。聚丙烯酰胺凝胶由 5% 浓缩胶与 12% 分离胶组成。以每块凝胶 25 毫安的浓度分离蛋白质，直到溴酚蓝用完。

凝胶运行后，将蛋白质从一种凝胶转移到多藤氟化物膜上，并通过针对钻机眼的抗体进行蛋白质印迹分析，然后用 kumasi 亮蓝 G two 50 对另一块凝胶进行 PKR 染色。然后将凝胶储存在 4 摄氏度的 25% 乙醇、8% 乙酸和 4% 甘油中，或继续进行成像和分析。为了分析模式识别受体的寡聚状态，用 PBS 制备 50 μg 终体积为 10 μL 的细胞裂解物，并加入 5 x 样品缓冲液至终浓度为 1 x。

立即将样品上样到具有 5% 浓缩和 8% 分离凝胶的天然聚丙烯酰胺凝胶上。任何延迟都会导致天然复合物的损失。在 4 摄氏度下以每块凝胶 20 毫安的浓度运行凝胶。

在溴酚蓝条带离开凝胶后 45 分钟停止电泳，每次使用针对 rig 眼的抗体进行蛋白质印迹，如随附文件所述，进行针对 rig 眼和 PKR 的抗体进行确认转换和寡核苷酸检测，通过钻机眼识别病毒激动剂或 PKR 限制蛋白酶消化和天然页面诱导的寡核苷酸，如本视频所述， 模拟感染的细胞裂解物的胰蛋白酶消化导致 Rig Eye 的快速降解，而克隆 13 感染导致产生 30 kdalton 抗性 Rig Eye 片段。PKR 还显示对感染样品中 tripsin 消化的部分抗性，这与其磷酸化相吻合，以监测 tripsin 消化凝胶的效率和特异性，用 kumasi 亮蓝 G two 50 染色。未处理的样品显示等量的负载蛋白，将模拟细胞和 C 13 细胞裂解物置于 tripsin 消化中，导致整体蛋白量的相当减少。

这表明 tripsin 处理对未感染细胞中的 mock 和 CL 13 感染样品具有相同的效率。仅检测到 R EYE 和 PKR 的单体作为附加对照。包括转录因子 IRF 3，它以单体形式存在，但已知在通过 R Eye 激活时会发生二聚化。

克隆 13 感染导致钻眼寡聚物复合物以弥散条带的形式强烈积累，以及 PKR 和 IRF 三个二聚体或寡聚体作为确定的蛋白质条带。这些结果表明，消化和天然页面的有限行程是监测感染后 rig eye 和 PKR 的确认变化和寡核苷酸形成的有用工具。观看此视频后，您应该对掌握后如何监控 WIC 眼和 PKR 确认切换和化有一个很好的了解。

该技术可以在此手术后的两天内完成。作为一种方法，可以进行 pro 分析以回答其他问题，例如在发育后是否与刺激配体存在稳定的相互作用。这项技术为先天免疫领域的研究人员探索病毒刺激细胞中模式识别受体的激活状态铺平了道路。