通过有限蛋白酶消化和天然PAGE监测抗病毒模式识别受体RIG-I和PKR的激活

针对病毒感染的先天防御由模式识别受体（PRR）触发，这些受体存在于先天免疫系统的细胞中。在感染期间，细胞质中的PRR（如RIG-I和PKR）可结合病毒特征性RNA，发生构象改变并被配体化，从而激活抗病毒信号通路。为在体外监测RIG-I和PKR的构象变化及配体化过程，使用裂谷热病毒（Rift Valley fever virus）感染人A549细胞。

使用Clone 13刺激PRR活化。随后制备对照组和感染细胞的细胞裂解液，以分析rig eye和PKR的构象变化。进行有限的胰蛋白酶消化。

如果蛋白质结构发生了构象变化，该蛋白质对消化的抗性会增强，通过蛋白质印迹分析可检测到条带，以分析所有天然非变性PAGE中复合物的形成，随后进行蛋白质印迹分析。如果所有配体化过程均已发生，则会观察到更高水平的All-liga-rig-eye和PKR复合物。有限蛋白酶消化结合非变性PAGE的主要优势在于，这些技术有助于直接检测Riga和PKR的激活状态。

这些方法有助于回答先天免疫领域中的一些关键问题，例如与 RIG-I 和 PKR 激活相关的 RNA 分子的确切性质和来源是什么。这些方法可为研究 RIG-I 和 PKR 的激动剂提供见解。此外，该方法还可应用于其他胞质传感器蛋白，例如 MDA5。接下来演示实验操作的是来自我实验室的博士生 Mila Viva，在开始本实验流程之前。

请注意，下文所述的裂谷热病毒克隆株 13（以下简称 CL 13）是一种减毒病毒突变体，在德国必须在 BSL-2 条件下操作。将无血清 PBS 培养基和含 5% FCS 的细胞培养基预热，置于水浴中，并分装至 1.5 毫升微量离心管中。用无血清培养基配制浓度为每毫升 1.25 × 10⁷ PFU 的 CL 13 病毒液，用于感染 2.5 × 10⁶ 个细胞。

以感染复数（MOI）为五的剂量将CL13病毒接种至A549细胞中，病毒用量比所需量多准备约10%，以弥补移液误差。从培养箱中取出A549细胞，吸除培养基，加入10毫升磷酸盐缓冲液（PBS），轻轻摇晃或倾斜培养瓶以洗涤细胞，随后去除PBS。接着，向细胞中加入1毫升稀释后的CL13病毒液；对于未感染对照组（模拟感染组），则加入等量的不含病毒的对照液。

加入一毫升无血清培养基，每15分钟孵育一次，共孵育一小时。轻轻倾斜培养瓶，以确保培养基均匀分布。感染一小时后，移除接种物。

加入5毫升预热的含5%FCS的细胞培养基，孵育5小时。配制含0.5%Triton X-100的PBS，并置于4°C。不要加入叙利亚仓鼠蛋白酶抑制剂。

接下来，用预冷的PBS洗涤细胞，并加入10毫升新鲜PBS。然后使用细胞刮刀将细胞从培养皿上刮下。将细胞悬液转移至15毫升锥形离心管中，在室温下以800 × g离心5分钟。

离心后，弃去上清液，将细胞沉淀重悬于30 µL含0.5% Triton X-100的PBS中。将裂解液转移至新的1.5 mL离心管中，在冰上孵育至少10分钟。在4°C条件下，以10,000 ×g离心10分钟。

离心后，将澄清的细胞裂解液转移至新的离心管中。进行 Bradford 法测定，以确定澄清细胞裂解液中的蛋白浓度。可于 -20 °C 保存，或立即进行后续实验，如酶切消化或非变性 PAGE，以检测模式识别受体的构象变化。首先，在 PBS 中将 TPCK 处理的胰蛋白酶稀释至终工作浓度为每毫升 2 微克（每个实验条件准备两个新管）。将 CL13 感染组和未感染对照组的蛋白裂解液用 PBS 调整至终体积为 9 微升，蛋白总量为 25 微克。其中一组裂解液作为输入对照，另一组则加入 TPCK 胰蛋白酶进行处理；未处理对照管中加入 1 微升 PBS 至剩余两个管中。

加入1微升浓度为每微升2微克的TPCK胰蛋白酶，使终浓度达到每微升0.2微克。通过移液混匀反应体系。将裂解液在37摄氏度孵育25分钟。

加入五倍体积的变性上样缓冲液并置于95摄氏度下煮沸5分钟以终止反应。注意不要延长胰蛋白酶孵育时间。需注意，胰蛋白酶消化时间的精确控制对于在无背景干扰的情况下检测抗性片段至关重要；如果未检测到抗性蛋白或检测到过多抗性蛋白，应相应调整消化时间。

煮沸后，将样品在零下20摄氏度保存，或立即将样品加入两个十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶中，每个凝胶由5%的浓缩胶和12%的分离胶组成。以每块凝胶25毫安的电流进行电泳，直至溴酚蓝跑出凝胶。

运行凝胶后，将蛋白质从一块凝胶转移至聚偏氟乙烯膜，并使用针对 Rig-I 和 PKR 的抗体通过蛋白质印迹法进行分析；另一块凝胶则用考马斯亮蓝 G-250 染色。随后将染色后的凝胶储存于含 25% 乙醇、8% 乙酸和 4% 甘油的溶液中，置于 4°C 保存，或直接进行成像与分析。为分析模式识别受体的寡聚状态，取 50 微克细胞裂解液，用 PBS 调整终体积至 10 微升，再加入 5× 上样缓冲液，使终浓度为 1×。

立即将样品上样至含有5%浓缩胶和8%分离胶的非变性聚丙烯酰胺凝胶中。任何延迟都会导致天然复合物的损失。在4°C条件下，以每块凝胶20毫安的电流电泳运行凝胶。

在溴酚蓝条带离开凝胶后45分钟停止电泳，每次电泳总时间约为1.5至2小时，随后使用针对RIG-I和PKR的抗体进行Western blotting，具体方法见随附文件，用于检测由RIG-I或PKR识别病毒激动剂所引发的构象转换和寡聚化。限制性蛋白酶消化和天然PAGE实验操作如本视频所述。对模拟感染细胞裂解液进行胰蛋白酶消化后，RIG-I迅速降解；而Clone 13感染则产生了一个30千道尔顿的抗性RIG-I片段。PKR在感染样本中也表现出对胰蛋白酶消化的部分抗性，这与其磷酸化状态一致。为监测胰蛋白酶消化的效率和特异性，凝胶使用考马斯亮蓝G-250染色。未处理样本显示所加载的蛋白量相等，将模拟感染和C13细胞裂解液进行胰蛋白酶消化后，总体蛋白量出现可比的下降。

这表明，在未感染的细胞中，胰蛋白酶处理对模拟处理组和CL 13感染样本具有相同的效率。作为额外对照，仅检测到R EYE和PKR的单体。同时包括了转录因子IRF3，其以单体形式存在，但已知可通过R Eye激活后发生二聚化。

克隆13感染导致RIG-I寡聚复合物以弥散条带形式大量积累，以及PKR和IRF3以明确蛋白条带形式存在的二聚体或寡聚体。这些结果表明，有限的胰蛋白酶消化结合非变性PAGE是监测感染后RIG-I和PKR构象变化及寡聚化形成的有用工具。观看本视频后，您应能够充分掌握如何监测RIG-I和PKR在感染后的构象转换与寡聚化过程。

按照本方案，该技术可在两天内完成。此外，还可进行类似于原代细胞检测的方法，以回答其他问题，例如刺激性配体在发育后是否与受体形成稳定的相互作用。该技术为先天免疫领域的研究人员探索病毒刺激细胞中模式识别受体的活化状态奠定了基础。