Name: 在抗病毒模式识别受体RIG-I和PKR通过有限蛋白酶消化和Native PAGE监测激活 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-07-29T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 43 s
Description: 了解RIG-I和PKR在病毒感染中的构象变化与寡聚化过程。本研究利用有限胰蛋白酶消化和Native PAGE技术，在A549细胞中监测抗病毒模式识别受体的激活机制，为先天免疫研究提供重要方法。

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我们感谢来自CISA-INIA的Alejandro Brun提供了抗裂谷热病毒血清。我们实验室的工作由以下机构资助：吉森和马尔堡大学医学中心合作合同第2条第3款规定的科研资助（Forschungsförderung gem. §2 Abs. 3 Kooperationsvertrag Universitätsklinikum Giessen und Marburg）、莱布尼茨新兴病毒性疾病研究生院（Leibniz Graduate School for Emerging viral diseases, EIDIS）、德国研究基金会特别研究领域（DFG Sonderforschungsbereich, SFB）1021以及德国研究基金会重点计划（DFG Schwerpunktprogramm, SPP）1596。

1. 感染用 A549 细胞的接种
<ol>
	<li>在含有细胞培养基（DMEM，添加10% FCS、526.6 mg/l L-谷氨酰胺、50.000 U/l 青霉素和50 mg/l 链霉素）的T75培养瓶中，于37 °C和5% CO2条件下培养A549细胞。</li>
	<li>开始收获细胞前，将细胞培养基、PBS和0.05%胰蛋白酶-EDTA置于37 °C水浴中预热。</li>
	<li>吸除培养基，用10 ml PBS洗涤细胞，随后吸除PBS。</li>
	<li>加入3 ml胰蛋白酶-EDTA，均匀覆盖培养瓶底部，将培养瓶转移至37 °C、5% CO2的培养箱中。</li>
	<li>待所有细胞脱落后，加入7 ml细胞培养基重悬细胞，并将细胞悬液转移至15 ml Falcon离心管中。</li>
	<li>在室温下以800 × g离心5分钟，弃上清，用10 ml新鲜细胞培养基重悬细胞沉淀。</li>
	<li>使用细胞计数板对细胞进行计数。</li>
	<li>将2.5 × 106个细胞加入5 ml细胞培养基中，分别接种至两个T25培养瓶中，于37 °C和5% CO2条件下培养16小时。其中一个培养瓶作为模拟对照，另一个用于Cl 13病毒感染。</li>
</ol>
2. 使用裂谷热病毒克隆 13（Cl 13）进行感染
<ol>
	<li>注意：Cl 13 是一种减毒病毒突变体，在德国可在 BSL-2 条件下操作。请参考相关国家指南。其他典型的干扰素诱导剂包括仙台病毒（Cantell 株）或新城疫病毒。</li>
	<li>预热 PBS、无血清培养基以及含 5% FCS 的细胞培养基。</li>
	<li>用无血清培养基配制浓度为 1.25 × 107 PFU/ml 的 Cl 13 病毒液，用于以感染复数（MOI）5 的条件感染 2.5 × 106 个 A549 细胞。为避免移液误差，应准备略多（约 10%）于实际所需量的病毒液。</li>
	<li>按照步骤 1.3 所述方法用 PBS 洗涤细胞。</li>
	<li>向细胞中加入 1 ml Cl 13 稀释液或无血清培养基（未感染对照组，模拟感染），在 37 °C、5% CO2 条件下孵育 1 小时。每 15 分钟轻柔晃动培养瓶一次，以确保 Cl 13 稀释液或无血清培养基均匀分布。</li>
	<li>感染 1 小时后，移除接种物，加入 5 ml 预热的含 5% FCS 的细胞培养基，在 37 °C、5% CO2 条件下继续孵育 5 小时。</li>
</ol>
3. 细胞裂解物的制备
<ol>
	<li>在 4 °C 下配制 PBS / 0.5% Triton X-100。不要添加丝氨酸蛋白酶抑制剂。</li>
	<li>用预冷的 PBS 洗涤细胞，并加入 10 ml 新鲜 PBS。</li>
	<li>刮下细胞，将细胞悬液转移至离心管中，在室温下以 800 × g 离心 5 分钟。</li>
	<li>弃去上清液，将细胞沉淀重悬于 30 µl PBS / 0.5% Triton X-100 中。将裂解液转移至新的 1.5 ml 离心管，并在 4 °C 下孵育至少 10 分钟。</li>
	<li>在 4 °C 下以 10,000 × g 离心 10 分钟，将澄清的细胞裂解液（上清液）转移至新的离心管中。</li>
	<li>采用 Bradford 法测定蛋白浓度，具体步骤参见其他文献33。</li>
	<li>可在 -20 °C 保存，或直接进行胰蛋白酶消化（4.1）或非变性 PAGE（5.1）。</li>
</ol>
4. 模式识别受体构象变化的测定
<ol>
	<li>细胞裂解液的 TPCK-胰蛋白酶处理
	<ol>
		<li>用 PBS 将甲苯磺酰苯丙氨酰氯甲基酮处理的（TPCK 处理的）胰蛋白酶稀释至终工作浓度为 2 µg/µl。</li>
		<li>在两个新离心管中，用 PBS 将每种蛋白裂解液（mock 或 Cl 13）调整至终体积为 9 µl、终蛋白浓度为 25 µg。因此应共准备四管，每管含 25 µg 裂解蛋白，其中 mock 感染两次，Cl 13 感染两次。一组作为输入对照（未处理），另一组用于 TPCK-胰蛋白酶处理。</li>
		<li>向各细胞裂解液中加入 1 µl PBS（未处理）或 1 µl 浓度为 2 µg/µl 的 TPCK-胰蛋白酶（终浓度：0.2 µg/µl），并通过移液混匀反应体系。切勿反复冻融 TPCK-胰蛋白酶分装样品，以免影响消化效率。</li>
		<li>在 37 °C 孵育裂解液 25 分钟。加入 5 倍变性上样缓冲液（250 mM Tris-HCl pH 6.8，10% SDS，50% 甘油，25% β-巯基乙醇，0.5% 溴酚蓝）并 95 °C 煮沸 5 分钟以终止反应。注意：胰蛋白酶孵育时间不可延长。若未检测到蛋白酶抗性片段，则必须缩短胰蛋白酶消化时间。</li>
		<li>煮沸后，样品可在 -20 °C 保存。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）及蛋白质印迹
	<ol>
		<li>将样品上样至含 5% 浓缩胶和 12% 分离胶的十二烷基硫酸钠（SDS）聚丙烯酰胺凝胶中，每块凝胶以 25 mA 恒流电泳，直至溴酚蓝迁移出凝胶底部。</li>
		<li>用甲醇活化聚偏二氟乙烯（PVDF）膜 30 秒，随后将其放入转移缓冲液（48 mM Tris，39 mM 甘氨酸，1.3 mM SDS，20% 甲醇）中。</li>
		<li>使用半干式转膜系统进行转膜，于 10 V 条件下转移 1 小时。取出膜，用去离子水短暂漂洗，然后晾干。</li>
		<li>将膜短暂浸入甲醇中重新活化，随后用 TBS 洗涤 5 分钟。用含 10% 脱脂奶粉的 TBS 室温封闭 1 小时，或 4 °C 过夜。用 TBS 洗涤膜 3 次，每次 5 分钟。</li>
		<li>按照表 1 推荐条件配制一抗稀释液，室温孵育 1 小时，或 4 °C 过夜。</li>
		<li>用 TBS-T 洗涤膜 3 次，每次 10 分钟。加入以 1:20,000 比例稀释于含 1% 脱脂奶粉 TBS 中的相应辣根过氧化物酶标记的二抗，室温孵育 45 分钟。</li>
		<li>用 TBS-T 洗涤膜 3 次，每次 10 分钟，最后再用 TBS 洗涤一次。</li>
		<li>使用商用化学发光检测试剂盒和数字凝胶成像系统进行信号检测。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>考马斯亮蓝 G-250 染色
	<ol>
		<li>按 4.2.1 所述进行 SDS-PAGE。将样品上样至 SDS 聚丙烯酰胺凝胶，每块凝胶以 25 mA 恒流电泳，直至溴酚蓝迁移出凝胶底部。</li>
		<li>在室温下进行考马斯亮蓝 G-250 染色。所有孵育步骤均需持续振荡。</li>
		<li>将凝胶转移至含 40% 甲醇和 10% 乙酸的固定液中，固定 30 分钟。</li>
		<li>更换为脱色液（25% 乙醇和 8% 乙酸），孵育 5 分钟。</li>
		<li>用含 0.2% 考马斯亮蓝 G-250、40% 甲醇和 10% 乙酸的染色液染色 1 小时。</li>
		<li>用脱色液进行脱色处理，并在 10 分钟、30 分钟和 60 分钟后更换脱色液。</li>
		<li>将凝胶保存于含 25% 乙醇、8% 乙酸和 4% 甘油的溶液中，4 °C 保存。</li>
		<li>按 4.2.8 所述进行成像与分析。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. 模式识别受体寡聚状态的分析
<ol>
	<li>非变性PAGE
	<ol>
		<li>将50 µg细胞裂解液用PBS稀释至终体积10 µl，并加入5×非变性上样缓冲液（250 mM Tris-HCl pH 6.8、1% 脱氧胆酸钠、50% 甘油、0.5% 溴酚蓝），使终浓度为1×。</li>
		<li>立即将样品上样至非变性聚丙烯酰胺凝胶，其中浓缩胶为5%，分离胶为8%。任何延迟均会导致天然复合物损失34。</li>
		<li>在4 °C条件下，以50 mM Tris-NaOH pH 9.0、384 mM 甘氨酸作为阳极缓冲液，50 mM Tris pH 8.3、384 mM 甘氨酸、1% 脱氧胆酸钠作为阴极缓冲液，每块凝胶20 mA恒流电泳。电泳1.5–2小时后结束（溴酚蓝条带约在45分钟前已离开凝胶）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>蛋白质印迹（Western Blotting）
	<ol>
		<li>将聚偏二氟乙烯（PVDF）膜用甲醇活化30秒，随后放入托宾缓冲液（25 mM Tris、192 mM 甘氨酸、0.1% SDS、20% 甲醇）中。</li>
		<li>按照制造商说明组装湿转装置，并用托宾缓冲液充满转膜槽。</li>
		<li>在4 °C条件下，以250 mA恒流转膜1.5小时。</li>
		<li>转膜完成后，按4.2.3节及后续步骤进行操作。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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未声明任何利益冲突。

感知病毒的存在并激活抗病毒I型干扰素系统对于成功的先天免疫应答至关重要22。病毒的检测由模式识别受体（PRRs）如RIG-I和PKR介导，从而能够快速启动并激活抗病毒防御机制。本文中，我们描述了两种直接评估RIG-I和PKR激活状态的方法。
利用有限蛋白酶消化来监测RIG-I和PKR构象变化的方法，最初分别由M. Gale Jr. 和T. Fujita6,17以及J. L. Cole30的研究团队提出。该方法是一种灵敏的手段，用于评估因构象改变而导致的胰蛋白酶处理敏感性变化。通过胰蛋白酶消化实验，我们发现模拟感染样本中的RIG-I和PKR迅速降解，而病毒感染细胞裂解物经胰蛋白酶处理后则产生抗胰蛋白酶的RIG-I片段。类似地，在Cl 13病毒感染条件下也检测到抗胰蛋白酶的PKR片段。该现象伴随PKR在Thr 446位点的磷酸化，后者是广泛使用的PKR活化标志。通过考马斯亮蓝染色比较模拟感染与Cl 13病毒感染细胞裂解物的胰蛋白酶消化结果，显示总体蛋白质水平下降程度相似。这表明抗性片段的形成是RIG-I和PKR等蛋白质所...

在抗病毒宿主防御中，一个关键事件是所谓的模式识别受体（PRRs）对病原体的快速识别1,2。细胞内对RNA病毒感染的检测依赖于两种胞质RNA解旋酶：RIG-I（视黄酸诱导基因I）和MDA5（黑色素瘤分化相关蛋白5）3-5。RIG-I由两个N端的胱天蛋白酶募集结构域（CARDs）、一个中央的DECH-box型RNA解旋酶结构域以及一个C端结构域（CTD）组成4,6。其中CTD和解旋酶结构域负责识别非自身（病毒）RNA，而CARDs则介导下游信号传导，从而建立抗病毒的宿主状态。
如果RIG-I处于静息状态，即在缺乏特异性RNA配体的情况下，其第二个CARD结构域会与中央解旋酶结构域相互作用，使RIG-I保持自抑制构象7-11。RIG-I可结合带有5'-三磷酸基团（5'PPP）的短双链（ds）RNA、长双链RNA以及富含polyU/UC的RNA，这些是多种RNA病毒基因组中存在的典型特征结构12-16。RIG-I活化的两个主要特征是构象转变为闭合状态6,17以及发生同源寡聚化6,18,19。构象转变可增强RNA结合能力，暴露CARD结构域以启动下游信号传导，并重建具有活性的ATP酶位点8,9,11,20。寡聚化RIG-I复合物的形成有助于更有效地招募下游信号接头分子，从而构建抗病毒信号转导平台11。RIG-I调控的信号通路最终激活转录因子IRF-3，上调干扰素（IFN-α/β）基因的表达，进而诱导干扰素刺激基因（ISGs）的表达，实现完整的抗病毒反应21,22。其中研究最为清楚的ISG之一是RNA依赖性蛋白激酶（PKR）23。PKR属于真核翻译起始因子2α（eIF2α）激酶家族，由N端双链RNA结合结构域和C端激酶结构域组成。激酶结构域构成PKR活化所必需的二聚化界面，并执行该蛋白的催化功能。PKR与病毒双链RNA结合后发生构象改变，允许其在Thr 446等多个位点发生二聚化及自磷酸化。随后PKR介导eIF2α的磷酸化，从而阻断病毒mRNA的翻译23-27。
RIG-I 和 PKR 均会发生显著的结构重排，形成寡聚复合物，并通过磷酸化/去磷酸化以及泛素化进行翻译后修饰10,11,19,23,24,26-29。为了更清楚地了解哪些病毒RNA结构能够激活 RIG-I 和 PKR（以及病毒拮抗因子可能在哪个阶段进行干扰），精确确定其激活状态至关重要。先前已有研究报道，这两种模式识别受体（PRR）在激活后会产生抗胰蛋白酶消化的蛋白片段6,17,30，并形成高级寡聚体6,18,19。然而，尽管关于这些抗病毒宿主应答关键因子的文献极为丰富1,2,24，直接检测方法的应用却相对少见。为了促进这些方法的更广泛应用，本文提供了简便且灵敏的实验方案，可用于可靠地分析 RIG-I 和 PKR 的激活状态。采用具有干扰素产生能力的人源细胞系 A549，以已知的 RIG-I 和 PKR 激活剂——减毒裂谷热病毒突变株克隆 13（Cl 13）31,32进行感染。经过简单的细胞裂解处理后，利用有限胰蛋白酶消化结合蛋白质印迹（Western blot）分析检测感染细胞提取物中蛋白构象的转变，并通过蓝色天然聚丙烯酰胺凝胶电泳（blue native PAGE）结合 Western blot 分析检测寡聚体的形成。

<table><tbody><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;细胞培养&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Dulbecco&amp;rsquo;s 改良 Eagle&amp;rsquo;s 培养基 (&lt;font class=&quot;font6">DMEM)&lt;/font&gt;</td><td>Gibco</td><td>21969-035</td><td></td></tr><tr><td>OptiMEM</td><td>Gibco</td><td>31985-47</td><td></td></tr><tr><td>L-谷氨酰胺</td><td>PAA</td><td>25030-024</td><td></td></tr><tr><td>青霉素-链霉素</td><td>PAA</td><td>15070-063</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清 (FCS)</td><td>PAA</td><td>10270</td><td></td></tr><tr><td>0.05% 胰蛋白酶-EDTA</td><td>Gibco</td><td>25300-054</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;化学试剂&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>L-1-对甲苯磺酰胺-2-苯乙基氯甲基酮处理的 (TPCK) 胰蛋白酶</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T1426</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;抗体&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>小鼠单克隆抗 RIG-I 抗体 (ALME-1)</td><td>Enzo Life Sciences</td><td>ALX-804-849-C100</td><td>WB: 1:500，溶于含 1% 脱脂奶粉的 TBS</td></tr><tr><td>小鼠单克隆抗 PKR 抗体 (B10)</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-6282</td><td>WB: 1:500，溶于含 1% 脱脂奶粉的 TBS</td></tr><tr><td>兔单克隆抗磷酸化 PKR 抗体 (Thr446)</td><td>Epitomics</td><td>1120-1</td><td>WB: 1:1,000，溶于含 5% BSA 的 TBS</td></tr><tr><td>兔多克隆抗 IRF-3 抗体</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-9082</td><td>WB: 1:500，溶于含 1% 脱脂奶粉的 TBS</td></tr><tr><td>兔单克隆抗磷酸化 IRF-3 抗体 (Ser386)</td><td>IBL</td><td>og-413</td><td>WB: 1:100，溶于含 1% 脱脂奶粉的 TBS</td></tr><tr><td>兔抗裂谷热病毒高免血清 &quot;C2&quot; (MP-12)</td><td>由 Alejandro Brun CISA-INIA 惠赠</td><td></td><td>WB: 1:2,000，溶于含 1% 脱脂奶粉的 TBS</td></tr><tr><td>小鼠单克隆抗 β-肌动蛋白抗体 (8H10D10)</td><td>Cell Signalling</td><td>3700</td><td>WB: 1:1,000，溶于含 1% 脱脂奶粉的 TBS</td></tr><tr><td>辣根过氧化物酶标记的多克隆山羊抗兔 IgG</td><td>Thermo Fisher</td><td>0031460 1892914</td><td>WB: 1:20,000，溶于含 1% 脱脂奶粉的 TBS</td></tr><tr><td>辣根过氧化物酶标记的多克隆山羊抗小鼠 IgG</td><td>Thermo Fisher</td><td>0031430 1892913</td><td>WB: 1:20,000，溶于含 1% 脱脂奶粉的 TBS</td></tr></tbody></table>

通过有限蛋白酶消化和天然page监测抗病毒模式识别受体rig-i和pkr的激活

Monitoring Activation of the Antiviral Pattern Recognition Receptors RIG-I And PKR By Limited Protease Digestion and Native PAGE

宿主对病毒感染的防御依赖于先天免疫系统中的模式识别受体（PRRs）对病原体的快速识别。在细胞质中，PRRs中的RIG-I和PKR可结合特定的病毒RNA配体。这一过程首先介导受体构象改变和寡聚化，进而激活抗病毒干扰素反应。尽管检测宿主抗病毒基因表达的方法已较为成熟，但直接监测RIG-I和PKR激活状态的方法尚不完善，且应用较少。
本文中，我们描述了两种方法，用于监测感染已知的干扰素诱导剂——裂谷热病毒突变株克隆13（Cl 13）后RIG-I和PKR的激活情况。通过有限胰蛋白酶消化，可分析模式识别受体（PRRs）蛋白酶敏感性的变化，从而反映其构象改变。模拟感染细胞裂解物的胰蛋白酶消化结果显示RIG-I和PKR迅速降解，而Cl 13感染则导致出现一种抗蛋白酶的RIG-I片段。PKR同样表现出病毒诱导的部分抗胰蛋白酶消化特性，该特性与其在Thr 446位点的标志性磷酸化一致。RIG-I和PKR寡聚体的形成通过非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）得以验证。感染后，RIG-I和PKR的寡聚复合物显著积累，而在模拟感染样本中，这两种蛋白则以单体形式存在。
将有限蛋白酶消化和天然PAGE电泳分别与蛋白质印迹分析相结合，可灵敏且直接地检测RIG-I和PKR激活过程中的两个不同步骤。这些技术操作相对简便、快速，且无需昂贵的仪器设备。

RIG-I 或 PKR 对病毒激动剂的识别会触发构象转换6,17,30和寡聚化6,18,27。我们分别通过有限蛋白酶消化和非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）检测了这两种活化标志。
人A549细胞被裂谷热病毒克隆株13（Cl 13）感染，该病毒株的特点是干扰素拮抗蛋白NSs存在突变35,36。由于缺乏功能性NSs蛋白，克隆株13可强烈诱导RIG-I和PKR，从而在细胞内建立强烈的抗病毒状态12,31,32,37。
模拟感染细胞裂解物的胰蛋白酶消化导致RIG-I迅速降解，而Cl 13感染则产生一个30 kDa的抗胰蛋白酶消化的RIG-I片段图1A。此外，PKR在感染样品中也表现出对胰蛋白酶消化的部分抗性，这与其磷酸化状态一致图1A。为监测胰蛋白酶消化的效率和特异性，凝胶使用考马斯亮蓝G-250染色。未经处理的样品显示上样蛋白量相等图1B。将模...

针对病毒感染的先天防御反应由模式识别受体（PRRs）触发。两种胞质PRRs——RIG-I和PKR——可结合病毒特征性RNA，发生构象改变、寡聚化，并激活抗病毒信号通路。本文描述的方法可方便地监测这些胞质PRRs的构象转换和寡聚化过程。

通过有限蛋白酶消化和天然PAGE监测抗病毒模式识别受体RIG-I和PKR的激活

病毒侵染的宿主防御依赖于先天免疫系统中的模式识别受体（PRRs）对病原体的快速识别。在细胞质中，……

针对病毒感染的先天防御由模式识别受体（PRR）触发，这些受体存在于先天免疫系统的细胞中。在感染期间，细胞质中的PRR（如RIG-I和PKR）可结合病毒特征性RNA，发生构象改变并被配体化，从而激活抗病毒信号通路。为在体外监测RIG-I和PKR的构象变化及配体化过程，使用裂谷热病毒（Rift Valley fever virus）感染人A549细胞。使用Clone 13刺激PRR活化。随后制备对照组和感染细胞的细胞裂解液，以分析rig eye和PKR的构象变化。进行有限的胰蛋白酶消化。如果蛋白质结构发生了构象变化，该蛋白质对消化的抗性会增强，通过蛋白质印迹分析可检测到条带，以分析所有天然非变性PAGE中复合物的形成，随后进行蛋白质印迹分析。如果所有配体化过程均已发生，则会观察到更高水平的All-liga-rig-eye和PKR复合物。有限蛋白酶消化结合非变性PAGE的主要优势在于，这些技术有助于直接检测Riga和PKR的激活状态。这些方法有助于回答先天免疫领域中的一些关键问题，例如与 RIG-I 和 PKR 激活相关的 RNA 分子的确切性质和来源是什么。这些方法可为研究 RIG-I 和 PKR 的激动剂提供见解。此外，该方法还可应用于其他胞质传感器蛋白，例如 MDA5。接下来演示实验操作的是来自我实验室的博士生 Mila Viva，在开始本实验流程之前。请注意，下文所述的裂谷热病毒克隆株 13（以下简称 CL 13）是一种减毒病毒突变体，在德国必须在 BSL-2 条件下操作。将无血清 PBS 培养基和含 5% FCS 的细胞培养基预热，置于水浴中，并分装至 1.5 毫升微量离心管中。用无血清培养基配制浓度为每毫升 1.25 × 10⁷ PFU 的 CL 13 病毒液，用于感染 2.5 × 10⁶ 个细胞。以感染复数（MOI）为五的剂量将CL13病毒接种至A549细胞中，病毒用量比所需量多准备约10%，以弥补移液误差。从培养箱中取出A549细胞，吸除培养基，加入10毫升磷酸盐缓冲液（PBS），轻轻摇晃或倾斜培养瓶以洗涤细胞，随后去除PBS。接着，向细胞中加入1毫升稀释后的CL13病毒液；对于未感染对照组（模拟感染组），则加入等量的不含病毒的对照液。加入一毫升无血清培养基，每15分钟孵育一次，共孵育一小时。轻轻倾斜培养瓶，以确保培养基均匀分布。感染一小时后，移除接种物。加入5毫升预热的含5%FCS的细胞培养基，孵育5小时。配制含0.5%Triton X-100的PBS，并置于4°C。不要加入叙利亚仓鼠蛋白酶抑制剂。接下来，用预冷的PBS洗涤细胞，并加入10毫升新鲜PBS。然后使用细胞刮刀将细胞从培养皿上刮下。将细胞悬液转移至15毫升锥形离心管中，在室温下以800 × g离心5分钟。离心后，弃去上清液，将细胞沉淀重悬于30 µL含0.5% Triton X-100

monitoring-activation-antiviral-pattern-recognition-receptors-rig-i

Research

科研

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学与感染

在抗病毒模式识别受体RIG-I和PKR通过有限蛋白酶消化和Native PAGE监测激活

我们描述了一种用于鉴定宿主信号分子在模式疱疹病毒——γ疱疹病毒68（γHV68）裂解性复制中关键作用的实验方案。通过利用基因修饰小鼠品系和胚胎成纤维细胞进行γHV68的裂解性复制，该方案可同时实现对病毒-宿主相互作用的表型特征分析和分子水平研究。...

解析模型疱疹病毒裂解复制中的宿主-病毒相互作用

来源：Mateer, E., 等，负链RNA病毒感染中双链RNA与模式识别受体的共聚焦成像。J. Vis. Exp.

感染上皮细胞中病毒双链RNA与宿主模式识别受体的可视化

我们描述了一种用于检测感染了模型疱疹病毒——小鼠γ疱疹病毒68（murine gammaherpesvirus 68, MHV-68）的小鼠体内抗病毒细胞因子产生的实验方案。γHV68），该病毒与人类卡波西肉瘤相关疱疹病毒（KSHV）和EB病毒（EBV）密切相关。利用基因修饰的小鼠品系和小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs），我们评估了抗病毒细胞因子的产生情况 体内 和...

解析病毒逃逸细胞因子产生过程中的天然免疫信号传导

本文介绍了一种能够对IRF3转录因子的磷酸化依赖性激活进行详细分析的实验方法。该方法结合了高分辨率SDS-PAGE和天然PAGE，并利用多种磷酸化特异性抗体进行免疫印迹分析，从而实现对IRF3活化状态的精确检测。...

一种监测IRF3磷酸化依赖性激活的高分辨率方法

RNA病毒复制过程中产生的双链RNA可被模式识别受体识别，从而诱导先天免疫反应。对于负链RNA病毒而言，低水平的双链RNA与模式识别受体之间的相互作用仍不明确。我们开发了一种共聚焦显微镜方法，用于在单个细胞中可视化沙粒病毒的双链RNA和模式识别受体。...

负链RNA病毒感染中双链RNA与模式识别受体的共聚焦成像

我们介绍了利用HeLa细胞研究哺乳动物细胞周期中双链RNA结合蛋白激酶RNA激活型（PKR）的RNA相互作用分子的实验方法。该方法利用甲醛交联RNA-PKR复合物，并通过免疫沉淀富集与PKR结合的RNA。这些RNA可进一步通过高通量测序或定量逆转录PCR（qRT-PCR）进行分析。...

研究哺乳动物细胞周期中蛋白激酶RNA激活剂的RNA相互作用分子

本文介绍了一种用于分析CAL-1浆细胞样树突状细胞系中内源性干扰素调节因子5二聚化的天然蛋白质印迹法。该方案也可应用于其他细胞系。...

天然聚丙烯酰胺凝胶电泳免疫印迹分析内源性IRF5二聚化

我们提出了一种通用方案，用于识别嵌入病毒多聚蛋白中的宿主-病原体蛋白短序列同源区（SSHHPS）。多种第四组病毒可利用病毒蛋白酶识别SSHHPS，并靶向降解特定的宿主蛋白。...

利用体外与计算机模拟方法分析第四组病毒SSHHPS

本方案描述了一种全面的方法，用于检测在两种刺激条件下caspase激活（caspase-1、caspase-3、caspase-7、caspase-8、caspase-9 和 caspase-11）的反应 体外 和 体内...

评估半胱天冬酶激活以检测天然免疫细胞死亡

免疫荧光染色过程中使用酪胺信号放大技术，可灵敏地检测 HSV-1 感染后 ZBP1 介导的坏死性凋亡过程中磷酸化的 RIPK3 和...

酪胺信号放大法用于人细胞中HSV-1感染后ZBP1依赖性RIPK3和MLKL磷酸化的免疫荧光染色

了解RIG-I和PKR在病毒感染中的构象变化与寡聚化过程。本研究利用有限胰蛋白酶消化和Native PAGE技术，在A549细胞中监测抗病毒模式识别受体的激活机制，为先天免疫研究提供重要方法。

通过有限蛋白酶消化和天然PAGE监测抗病毒模式识别受体RIG-I和PKR的激活

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