Name: 警报，头抑制大鼠子皮层的大脑结构中Juxtacellular监测和本地化单神经元 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-04-27T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 41 s
Description: 了解清醒大鼠亚皮层脑结构中单个神经元的细胞旁记录与定位方法。本方案通过手术植入头部固定装置，实现稳定电生理记录，并利用芝加哥天蓝染料标记记录位点，为神经科学研究提供可靠技术框架。

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我们感谢加拿大卫生研究院（资助号 MT-5877）、美国国立卫生研究院（资助号 NS058668 和 NS066664）以及美以双边基金会（资助号 2003222）对本研究的资助。

实验方案按照联邦规定的动物护理和使用指南在雌性Long Evans大鼠（250 - 350 g）上进行，并已获得加州大学圣地亚哥分校机构动物护理和使用委员会的批准。
1. 使大鼠适应身体束缚
注意：将大鼠置于限制性饮食方案中。每次日常抓取操作后立即每天喂食一次，以使大鼠适应后续的束缚操作（如下所述）。提供足量饲料以维持动物体重为其初始体重的80%。对于一只250克的雌性Long Evans大鼠，每日饲料量约为6克。
<ol>
	<li>让大鼠适应人类接触。用手轻轻固定大鼠，每次约5秒，每隔30秒重复一次。连续两天，每天进行15分钟。在训练期间每日观察大鼠是否出现应激迹象，包括对固定产生挣扎、发声和磨牙。</li>
	<li>第3天rd 天，将大鼠放入一个限制身体的布袜中（图1每天一次，连续两天，每次15分钟。</li>
	<li>第5天th 天，将大鼠放入袜子内，再将袜子置于实验装置的刚性管内（图4将大鼠置于管中，每天15分钟，连续2天。</li>
	<li>每次训练结束后立即喂食大鼠。在最后一次训练结束时（第6次）th 天）自由获取食物。仅选择在最后一次训练日未表现出过度应激迹象的大鼠进行植入。 
	注意：尽管大鼠的植入选择具有主观性，但在我们的操作中，超过90%的大鼠对适应性训练有反应，并能够接受植入手术。</li>
</ol>
2. 植入记录室和头部固定装置
<ol>
	<li>通过将裸露的不锈钢丝焊接到针形连接器上制作参考电极。剪裁导线，使针形连接器未覆盖部分长度为3–5 mm。将参考电极与所有外科手术器械一同进行高压灭菌。</li>
	<li>注射氯胺酮/赛拉嗪麻醉剂。腹腔注射95 mg/kg氯胺酮与5 mg/kg赛拉嗪的混合液。初始剂量可维持1小时&#189; 2小时。此后根据需要每30至45分钟追加一次麻醉。&#160;用眼膏润滑动物的眼睛。</li>
	<li>通过检查足趾回缩反射来确定麻醉平面，并根据需要维持麻醉。</li>
	<li>将大鼠置于带有耳杆的立体定位仪固定框架中 (图3A）。剃除头部毛发，并用聚维酮碘（10% 溶液）对伤口部位进行消毒。插入耳杆时应小心操作，避免损伤鼓膜。建议使用钝头耳杆。</li>
	<li>用手术刀沿颅骨中线从眼睛的前后水平位置向耳后做切口。用剪刀剪除切口两侧各2-3 mm宽的皮肤条带。</li>
	<li>刮除骨膜以暴露颅骨表面直至外侧脊。用一层薄薄的超级胶水覆盖暴露的颅骨。</li>
	<li>使用直径略小于0-80螺丝的钻头钻一个小孔 &#189; 毫米直径钻头（参见 材料 在冠状缝与外侧嵴交汇处后方立即钻孔，角度为30-45&#176; 以一定角度进入颅骨，使螺钉的顶部比底部更偏外侧。</li>
	<li>将一颗0-80平底机械螺钉旋入孔中（约3圈），角度为30-45&#176; 角度。注意不要拧入过深，以免损伤下方的脑组织。</li>
	<li>按照图示配置，对另外6个螺钉重复此操作 (图3B）。将超级胶水涂抹在所有螺丝的底部。</li>
	<li>将注射器针头置于立体定位仪操纵器中。从前囟缝测量，并在所需开颅位置附近但位于其外侧的颅骨上用针头压出一个小凹痕，作为参考标记。 
	注意：在本实验中，标记的位置立体定位坐标为前囟缝后方3 mm，外侧1 mm。</li>
	<li>用永久性记号笔标记压痕。记录该标记的立体定位坐标，因其将作为立体定位的参考点。 (图3B).</li>
	<li>在目标坐标处（本示例中为前囟后方3 mm、外侧3 mm）进行颅骨开窗，保留硬脑膜完整。用改良人工脑脊液（125 mM NaCl、10 mM葡萄糖、10 mM HEPES、3.1 mM&#160;CaCl2，1.3 mM MgCl2，pH 7.413 (图3C).</li>
	<li>将0.2 ml离心管截成4–5 mm长，并切去管盖。将该管置于颅骨上，使其位于颅骨开孔的中央。</li>
	<li>在管子底部周围涂抹牙科水泥，将管子底部密封固定于颅骨上。注意避免将水泥渗入暴露的颅骨开窗区域。图3D).</li>
	<li>再钻一个约小孔（约 &#189; mm 直径）于对侧颅板，并小心插入参考电极。通过将可与记录放大器连接的插针焊接到导线末端来制备参考电极（参见 仪器设备 部分）。参考电极置入脑内后请勿移动，以免造成损伤。</li>
	<li>将胶水涂抹在插入导线的孔中，以暂时固定针和导线。</li>
	<li>混合硅胶试剂盒的两部分（参见 材料 部分）分成大致相等的几份。静置两分钟以充分混匀，然后将离心管填充至约 &#8531; 加满凝胶。</li>
	<li>安装直角支柱夹（参见 材料 部分）连接至头部固定杆。安装头部固定板（图2A）连接至持握杆（图2B) 以45&#176; 俯仰角应调整至使板的底部朝向动物的鼻部。使用倾角仪将俯仰角设置为与实验夹具的倾角一致会更为方便。图4).</li>
	<li>将持握杆连接至立体定位仪操作臂上，使持握杆与耳杆平行。降低持握杆和固定板，使固定板位于人字缝后方，且处于最尾端螺钉的前方。</li>
	<li>抓住前部头螺栓（一个 8-32 螺柱或螺钉，参见 材料 约45度角处&#176; 使用辅助臂和夹具调整角度，使螺钉头部朝下并朝向动物尾部。 lowering 螺钉，使其接触前部 0-80 螺钉 (图3F，G).</li>
	<li>用牙科丙烯酸树脂固定螺栓和金属板。将牙科丙烯酸树脂涂抹于骨螺钉头部、参考针以及离心管侧壁周围。静置约10分钟，待牙科丙烯酸树脂干燥。 (图 3H).</li>
	<li>在牙科丙烯酸树脂边缘涂抹一层牙科水泥，将皮肤与植入物粘合。等待水泥干燥。</li>
	<li>在离心管盖上戳几个孔，并将盖子盖在管子上。</li>
	<li>取下辅助固定夹，然后小心地从立体定位仪上取下头部固定杆，再将头板从固定杆上取下图3I).</li>
	<li>将动物从立体定位仪中取出，并根据所有适用的规则、法规和法律进行术后护理和监测（例如，&#160;布托啡诺 0.02 mg/kg，每8-12小时一次，持续至少24小时。&#160;如果植入物边缘出现炎症，应每日在患处涂抹一层薄薄的抗生素软膏，直至症状消退。</li>
</ol>
3. 神经元单位的轴突外监测
<ol>
	<li>使用二氧化碳激光毛细管拉制仪拉制石英毛细管（参见 设备 尖端直径小于1的切片 &#956;m图5A). 
	注意：加热参数将根据具体仪器的不同而有所变化，所需尖端直径也取决于目标脑区结构。在大鼠丘脑记录时，微电极尖端长度范围为5-7 mm。</li>
	<li>将移液管固定在配备长工作距离物镜的微分干涉差显微镜下。使用油灰将移液管固定在显微镜载物台上。</li>
	<li>缓慢地用移液管尖将一块玻璃片（厚度为 0.5 - 1 cm；用于制作超薄切片刀的玻璃片较为方便）移入视野中。使用载物台微操作器，轻轻使移液管尖接触玻璃片，使其断裂。根据需要重复此操作，直至移液管尖的外径达到 1 - 3 &#956;m (图5B,C）。确保这些微电极的阻抗在约5-15 MΩ之间&#937;.</li>
	<li>配制细胞外盐溶液（135 mM NaCl，5.4 mM KCl，1.8 mM CaCl₂）2，1 mM MgCl2，5 mM HEPES，用NaOH调节pH至7.28 加入2%（w/v）芝加哥蓝。使用带有30 G或更小规格针头的注射器，将移液管后端充满该溶液。或者，对于单细胞近胞标记，可用2%（w/v）神经生物素或生物素化葡聚糖胺（BDA-3000或BDA-10000）替代芝加哥蓝，加入生理盐水中。</li>
	<li>将大鼠放入置于刚性管内的布制袜中，并固定在合适的实验装置上 (图4手术后至少等待72小时，再将动物置于头部固定装置中。收紧束带时应围绕胸骨上部，而非颈部，以避免阻塞气道。若发现呼吸费力或受阻，应放松束带或将束带向后移动。此操作应在大鼠清醒状态下进行。</li>
	<li>将大鼠头部固定板连接到定位装置的对应部件上。操作时，先用销钉将头部固定板定位，再使用4-40螺钉将其固定。务必等待动物完全安静后再操作，以避免对头部施加过大的扭矩。接着，将一个8-32螺母安装到植入大鼠颅骨的头部固定螺栓上，然后将一根带螺纹的不锈钢杆旋入该头部螺栓。将不锈钢杆固定到实验用定位装置上，确保其可被牢固锁紧（图4). 
	注意：使用头部固定螺栓和头部固定板固定动物可最大限度地减少装置弯曲，提高记录稳定性。大多数情况下，可在动物首次进行头部固定的当天开始记录。然而，若动物出现过度扭动或发声，应在开始任何记录前进行一天的头部固定适应性训练。在此情况下，将动物置于固定装置上15分钟，然后放回笼中。次日重复此步骤，随后继续实验方案。</li>
	<li>打开记录室并移除硅胶。如果颅骨开窗处有组织再生，使用精细镊子清理颅骨开窗。</li>
	<li>将移液管连接至电动显微操作器，并插入头级前置放大器。 
	注意：在本演示中，使用头级上的一个小型继电器电路，在放大器导线和具有高顺从电压的外部电流源之间进行切换图6A-C）。请注意，某些放大器配有适当的内置高合规性电源（参见 讨论 和 材料 切片）</li>
	<li>使用电动显微操作器将移液管尖端移至记录室中立体定位确定的标记位置。记录该位置的坐标。注意避免移液管尖端与颅骨接触而损坏。</li>
	<li>将移液管移动至前-后轴和内-外侧轴上的目标记录位置。随后将移液管向腹侧推进，穿过硬脑膜，直至其深入约500 &#956;m 背侧至预定记录位置。</li>
	<li>缓慢推进移液管，同时通过音频监视器监听移液管尖端与参考电极之间放大电压的放电事件。一旦识别到放电事件，继续移动移液管0-100 &#956;m，直到出现幅度大于约500的正向电压偏转 &#956;V 被观察到。 
	注意：发生此情况时，电极电阻将增加约1.5至10倍。</li>
	<li>在按照步骤3.11完成单元分离后，开始记录，并同步采集所有其他感兴趣的动物行为和生理指标。在本演示中，通过高速视频记录技术监测自发的触须运动（见 材料 部分）</li>
	<li>为了标记记录位点，切换电极导线以连接至电流源。实现此操作有多种方法，可使用继电器电路（图6A-C），放大器内置的电流源，或手动（图6D，参见步骤 3.8 和 讨论）。传代 -4 &#956;以50%占空比、2秒脉冲持续4分钟，通过离子电渗法将芝加哥蓝注入移液管。</li>
	<li>按照标准操作流程，在完成多次标记步骤后处死并灌注动物。切取脑组织，并根据需要进行复染，以确定记录位点的解剖学位置。按照以下方法对组织进行细胞色素氧化酶活性复染：14或者，使用荧光显微镜鉴定芝加哥天蓝染料沉积物。 
	注意：为了准确区分不同标记的位点，所有标记必须在同一天使用同一支移液器完成，且在标记过程中不得松开移液器。在此情况下，可通过事后组织学分析中各记录位点的相对位置，结合每个位点记录的操纵器坐标（参见步骤 3.9），来区分不同的记录位点。为实现明确识别，应将标记位点间隔至少 200 &#956;彼此相距约1米，每个脑区不超过3-5个标签。</li>
</ol>

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</ol>

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

实验夹具的构建
用于构建实验夹具的机械部件（图4）的描述未包含在本方案中，因为该夹具可通过多种方式构建。在本演示中，使用标准的光学机械部件和支撑夹具来安装头部固定杆和身体固定管（见材料部分）。类似的光学机械部件可用于将电极 holder 安装到电动显微操作器上。夹具上的头部固定杆必须以与手术中植入头部固定板时所用杆件相同的俯仰角度安装。如果需要沿标准立体定位轴移动电极，则电极的 x 轴应与头部固定杆平行移动，z 轴则应垂直于包含人字缝（lambda）和前囟（bregma）的平面，并与地面平行（图4）。
合适的放大器和电流源类型
有多种商用放大器和电流源可用于本实验。大多数具有电流钳模式且总增益达到1,000倍的细胞外和细胞内电生理放大器均适用。对于使用1–3 μm移液管进行芝加哥蓝（...

在清醒动物积极执行行为任务时监测其神经元活动，对于理解神经系统的功能与组织至关重要。对单个神经元单位的细胞外电活动进行记录，长期以来一直是系统神经科学的核心工具，至今仍被广泛使用。根据特定实验的科学与技术需求，可选用多种类型的电极及其配置方式。慢性植入式微型驱动器或电极阵列通常用于自由活动的动物，包括鸟类、啮齿类和非人灵长类动物1-4。另一种方法是通过外部显微操作器，使用金属或玻璃微电极进行急性穿刺记录，常用于麻醉或头部固定的动物。玻璃微移液电极的优势在于，可采用贴近细胞（juxtacellular）或“细胞附着”（cell attached）构型，明确分离单个神经元的活动，而无需进行事后尖峰分类（spike sorting）5。此外，这类电极还允许对解剖位置明确的细胞或区域进行记录，因其可用于注入少量染料或神经解剖示踪剂，甚至可完整填充所记录的单个细胞。该技术已在大鼠、小鼠和鸟类中成功应用6-10。本文所述技术重点在于对清醒、头部固定的大鼠进行贴近细胞记录及细胞外染料沉积。需注意的是，与单细胞贴近细胞填充不同，此类染料沉积无法提供关于细胞形态或轴突投射的信息11，但其可实现精确至约50 μm的解剖定位，并且关键在于，在清醒动物中具有显著更高的成功率。尽管如此，本文仍提供单细胞贴近细胞填充的相关信息，作为解剖标记的替代策略。
简而言之，该实验方案包括三个主要阶段。第一阶段，将大鼠适应于在布制袜套中进行身体束缚（图1) 在为期6天的时间内。在第二阶段，使用头部固定装置（图2）和记录室通过手术植入，使得大鼠在多次后续记录过程中可保持在立体定位平面上（图3）；该操作可使实验者根据标准参考坐标，针对大脑特定的皮层下区域进行电生理学研究。12第三阶段包括将大鼠置于合适的固定装置中，以进行行为学和电生理学实验（图4), 使用石英毛细管制作电极（图5），进行明确分离单个神经元的紧密细胞外记录6-9，并使用芝加哥蓝染料标记记录位点的解剖位置（图6 和 7）。记录过程中同时进行行为监测；然而，行为学部分的技术细节取决于每项实验的科学目标，因此超出了单一实验方案的范畴。实验程序完成后（可在多天内重复进行），对动物实施安乐死。随后取出脑组织，并根据标准的神经解剖学技术进行处理，采用明场或荧光显微镜观察。

<table><tbody><tr><td>氯胺酮盐酸盐（Ketaset）</td><td>Fort Dodge</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>阿奈赛（赛拉嗪溶液）</td><td>Lloyd Laboratories</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>聚维酮碘（Povidone-Iodine）</td><td>CVS 药房</td><td>269281</td><td></td></tr><tr><td>Loctite 495</td><td>格莱茵工业供应公司</td><td>4KL86</td><td>20 - 40 cp 氰基丙烯酸酯</td></tr><tr><td>Vetbond</td><td>3M</td><td>1469SB</td><td></td></tr><tr><td>握力水泥粉</td><td>登士柏国际</td><td>675571</td><td>记录室的底部</td></tr><tr><td>握柄水泥液</td><td>登士柏国际</td><td>675572</td><td>记录室的底部</td></tr><tr><td>硅凝胶</td><td>道康宁</td><td>3-4680</td><td></td></tr><tr><td>喷射型义齿修补丙烯酸粉末</td><td>Lang Dental Manufacturing Co.</td><td>N/A</td><td>用于将头部固定装置固定到颅骨上</td></tr><tr><td>Ortho-Jet 快速固化正畸用丙烯酸树脂液</td><td>Lang Dental Manufacturing Co.</td><td>N/A</td><td>用于将头部固定装置固定到颅骨上</td></tr><tr><td>芝加哥蓝</td><td>Sigma</td><td>C8679</td><td></td></tr><tr><td>多聚甲醛</td><td>Sigma</td><td>158127</td><td>用于灌注和组织固定</td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液</td><td>Sigma</td><td>P3813</td><td>用于灌注和组织固定</td></tr><tr><td>细胞色素C</td><td>Sigma</td><td>C2506</td><td>细胞色素氧化酶染色 &lt;强&gt;图7&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>二氨基联苯胺</td><td>Sigma</td><td>D5905</td><td>细胞色素氧化酶染色 &lt;强&gt;图7&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>大鼠袜套</td><td>Sew Elegant（加利福尼亚州圣地亚哥）</td><td>N/A</td><td>定制 &lt;强&gt;图1、图4&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>PVC 管 2 &amp;frac12;&amp;rdquo;</td><td>美国塑料公司</td><td>34108</td><td>&lt;强&gt;图4&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>亚微型D型针脚 &amp;和插座</td><td>TE Connectivity</td><td>205089-1</td><td>&lt;强&gt;图3&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>不锈钢音乐丝 0.010&amp;rdquo; 直径</td><td>Precision Brand Products, Inc.</td><td>21010</td><td>&lt;强&gt;图3&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>立体定位固定架</td><td>Kopf Instruments</td><td>Model 900</td><td>&lt;强&gt;图3&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>立体定位耳杆</td><td>Kopf Instruments</td><td>Model 957</td><td>&lt;强&gt;图3&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>立体定位仪</td><td>Kopf Instruments</td><td>Model 960</td><td>&lt;强&gt;图3&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&amp;frac12; mm 钻头</td><td>Henry Schein</td><td>100-3995</td><td></td></tr><tr><td>静音空气牙科钻机</td><td>中西部牙科</td><td>393-1600</td><td></td></tr><tr><td>不锈钢 0-80 &amp;frac18;&amp;rdquo; 螺钉</td><td>紧固件超级商店</td><td>247438</td><td>&lt;强&gt;图3&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>0.2 ml 离心管</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-407-8A</td><td>&lt;强&gt;图3&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>定制头部固定杆</td><td>加州大学圣地亚哥分校斯克里普斯海洋研究所机械车间</td><td>N/A</td><td>定制 &lt;强&gt;图2 - 4&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>定制头部固定板</td><td>加州大学圣地亚哥分校斯克里普斯海洋研究所机械车间</td><td>N/A</td><td>定制 &lt;强&gt;图2 - 4&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>直角术后夹</td><td>纽波特</td><td>MCA-1</td><td>&lt;强&gt;图3、图4&lt;/strong&gt;；用于实验夹具的标准光机械部件（&lt;强&gt;图 4&lt;/strong&gt;）也来自 Newport 公司。</td></tr><tr><td>8-32 &amp;frac34;&amp;rdquo; 螺钉</td><td>紧固件超市</td><td>240181</td><td>用于头部固定， &lt;强&gt;图3&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>4-40 &amp;frac14;&amp;rdquo; 螺钉</td><td>紧固件超级商店</td><td>239958</td><td>用于头部固定， &lt;强&gt;图3、图4&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>石英毛细管</td><td>Sutter Instruments</td><td>QF-100-60-10</td><td>&lt;强&gt;图5&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>二氧化碳激光拉制仪</td><td>Sutter 仪器公司</td><td>P-2000</td><td></td></tr><tr><td>电动显微操作器</td><td>Sutter Instruments</td><td>MP-285</td><td></td></tr><tr><td>微电极放大器</td><td>Molecular Devices</td><td>Multiclamp 700B</td><td>替代部件：Molecular Devices Axoclamp 900A</td></tr><tr><td>微电极放大器前置放大器</td><td>Molecular Devices</td><td>CV-7B</td><td>替代部件：HS-9Ax10，配合 Molecular Devices Axoclamp 900A 使用</td></tr><tr><td>独立脉冲刺激器</td><td>A-M Systems</td><td>Model 2100</td><td>替换部件：HS-9Ax10，配合使用 Molecular Devices Axoclamp 900A</td></tr><tr><td>音频监视器</td><td>Radio Shack</td><td>32-2040</td><td></td></tr><tr><td>移液器架</td><td>Warner Instruments</td><td>#MEW-F10T</td><td>替代部件：参见 &lt;强&gt;讨论&lt;/strong&gt;, &lt;强&gt;图6A&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>电极导线</td><td>导丝</td><td>NEF34-1646</td><td>（可选） &lt;强&gt;图6D&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>放大器前置放大器级联接</td><td>COTO Technology</td><td>#2342-05-000</td><td>（可选）与定制印刷电路板（UCSD Physics Electronics Shop）配合使用， &lt;强&gt;图6A-C&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>数码摄像机</td><td>巴斯勒</td><td>A602fm</td><td>（可选）用于行为监测， &lt;强&gt;图7&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Puralube 宠物用眼膏</td><td>亚马逊公司</td><td>NC0138063</td><td></td></tr></tbody></table>

清醒且头部固定的雄性大鼠皮层下脑区单个神经元的紧密细胞外记录与定位

关键词：紧密细胞外记录，单神经元记录，皮层下脑结构，清醒动物，头部固定，大鼠

Juxtacellular Monitoring and Localization of Single Neurons within Sub-cortical Brain Structures of Alert, Head-restrained Rats

有多种技术可用于监测单个神经元单位的细胞外活动。然而，在行为动物中记录深部脑结构的此类活动仍面临技术挑战，尤其是当需要通过立体定位方法精确靶向这些结构时。本方案介绍了一套简便的外科手术与电生理技术，可在保持动物头部处于立体定位平面的同时，明确分离出单个神经元的放电活动。该方案结合了清醒啮齿类动物的头部固定、使用微玻璃电极进行细胞外邻近记录，以及离子电泳染料注射技术，以便在后续组织学分析中确定神经元的位置。尽管这些技术各自均已较为成熟，但本方案重点在于阐述它们在单一实验中联合使用的具体操作细节。这些神经生理学与神经解剖学技术同时与行为监测相结合。在本示例中，联合技术被用于研究自主产生的胡须运动如何编码于躯体感觉丘脑神经元的活动之中。更广泛而言，该方案可轻松调整，用于在大鼠、小鼠及其他动物执行多种行为任务时同步监测神经元活动。至关重要的是，这些方法的结合使研究者能够将经解剖学确认的神经生理信号直接与行为关联起来。

腹侧后内侧（VPM）丘脑中的神经元单位在动物自发扫 whisking 时编码触须运动的相位15,16。图7A显示了一只大鼠主动扫 whisking 时，一个VPM丘脑神经元单位的典型放电活动。图7B显示了神经元放电时间相对于触须运动瞬时相位对齐的直方图17。在触须回撤相位期间，放电次数更多。记录完成后，通过离子导入芝加哥蓝染料标记该神经元单位的位置，如图7C所示。组织切片经细胞色素氧化酶活性复染，以显示VPM丘脑的神经解剖学边界。近期已有类似版本的本方案被用于监测与扫 whisking 相关的多单位神经元活动（10–20 μm直径的移液管尖端）在特定脑干核团中的表现18。
<img alt="束口袋及图案示意图、缝纫说明、运动衫面料、魔术贴位置。" src="/files/ftp_upload/51453/51453fig1.jpg" dat...

本方案描述了一种用于在清醒大鼠中监测皮层下脑区神经元活动的头部固定装置的设计与外科植入方法。该方案详细说明了通过邻细胞记录配置分离单个神经元并有效确定其解剖位置的操作步骤。

有多种技术可用于监测单个神经元单位的细胞外活动。然而，从深部脑结构监测这种活动……

本实验的总体目标是监测并定位清醒且头部固定的自由活动大鼠脑内皮层下结构中单个神经元的活动。首先，让大鼠适应用布制袜套固定身体的束缚状态；第二步是通过手术植入头部固定装置和记录舱，以便在多次后续记录会话中将大鼠保持在立体定位平面上。接下来，将大鼠置于合适的固定装置中，以进行行为学和电生理实验，并实施细胞旁记录，从而实现单个神经元信号的明确分离。最后一步是使用芝加哥蓝染料标记记录位点的解剖位置，以便在后续的组织学分析中进行观察。与常用的金属微电极细胞外记录等方法相比，该技术的主要优势在于能够明确分离出单个神经元的放电信号，并且可在事后通过组织学方法确定记录位点。开始此操作前，先通过注射氯胺酮和赛拉嗪对动物进行麻醉。通过检查趾回缩反射来判断麻醉深度，并根据需要追加麻醉剂以维持麻醉状态。必要时，剃除头部毛发，并使用聚维酮碘对手术区域进行消毒。随后，将大鼠置于立体定位仪固定框中，并用耳杆固定其头部。从两眼之间中点至耳后，沿颅骨中线用手术刀做一切口。然后在切口两侧各去除2至3毫米宽的皮肤条。刮除骨膜以暴露颅骨，直至外侧脊。随后在暴露的颅骨上覆盖一层薄薄的超级胶水。接下来，在颅骨上 bagma 缝与外侧嵴交汇处后方，以 30 至 45 度角钻一个微小孔洞。然后以 30 至 45 度角将一颗 0-80 平底机械螺丝旋入该孔中，注意不要旋入过深，以免损伤下方的脑组织。按照此配置对另外六个螺钉重复此操作。之后，在所有螺钉的底部涂抹超级胶水。现在将注射器针头置于立体定位仪操纵器中。用针头在颅骨上压出一个凹痕，以标记合适的位置参考点。随后用永久性记号笔标记该凹痕。接着，在目标坐标处进行颅骨开窗手术，并保持硬脑膜完整。用改良的人工脑脊液覆盖颅骨开窗部位。接着，将一个0.2毫升离心管切成四到五毫米长，并剪去管盖。将该管置于颅骨上，使其居中对准颅骨开窗部位。然后在管子底部周围涂抹牙科水泥，将管子底部密封固定于颅骨。注意不要将任何水泥渗漏到暴露的颅骨开窗区域。现在在对侧颅骨板上再钻一个小孔。小心插入已焊接至针形连接器的参考电极导线。随后，在导线插入的孔中涂抹少量超级胶水，以固定针脚与导线。然后，将硅胶试剂盒中的两种组分按等量比例混合。等待两分钟，然后用凝胶填充离心管。当填充至大约三分之一满时，将头板连接到头部固定杆上。此处，该杆已通过一个直角夹固定在支架上，倾斜角度为45度。随后，使用支架夹具将固定杆连接到立体定位仪操纵臂上，使固定杆与耳杆平行，降低固定杆和板的位置，使板位于人字缝后方且枕骨螺钉前方。然后，用夹具以大约45度角夹住前部头颅螺栓，使螺钉头部朝下并朝向动物尾部方向。接着，降低螺钉直至其接触颅骨。接下来，使用牙科丙烯酸树脂将螺栓和固定板固定到位。在牙科丙烯酸树脂边缘涂抹一层牙科粘固剂，将皮肤与植入物粘合。待粘固剂干燥后，在离心管盖上刺几个小孔，并将管盖盖在离心管上。现在移除夹钳。小心地从立体定位仪上取下头部固定杆，然后从杆上取下头骨固定板。最后，将动物从立体定位仪中取出，并进行术后护理和监测。在此操作中，使用二氧化碳激光显微拉制仪将石英毛细管拉制成膜片钳电极。然后将电极固定，并置于配备长工作距离物镜的微分干涉差显微镜下。 用移液枪尖将玻璃块缓慢移入视野中。使用载物台显微操作器，通过轻轻触碰玻璃来折断移液枪尖。重复此操作，直至移液枪尖断裂。外径介于一至三微米之间。接下来，配制细胞外盐溶液，并加入2%芝加哥蓝。使用带有30号针头的注射器，将移液管后端填充溶液。然后将大鼠放入布制套管中，并将该布制套管转移至实验支架上合适的硬质管内。将大鼠头部固定板连接到支架上对应的固定部件。接着，将一个 8 32 螺母安装到大鼠植入的头部固定螺栓上。随后，将一根带螺纹的不锈钢杆拧入头部螺栓。然后，打开记录室并移除硅胶。使用精细镊子清洁颅骨开孔。如果颅骨开窗处已有组织再生，必要时在此过程中使用异氟烷麻醉。接着，将移液管连接至电动显微操作器。将移液管移动至前-后、内-外及背-腹轴向的预期记录位置。然后将移液管穿过硬脑膜向腹侧推进，直至其位于目标记录位置背侧约 500 微米处。在缓慢推进移液管的同时，通过放大电压信号的音频监视器监听放电事件。一旦识别到放电事件，继续移动移液管约 0 至 100 微米，直到正向电压偏转超过约 500 微伏。为了标记记录位点，将电流源设置为负四微安，以50%占空比施加两秒脉冲，并持续通电四分钟以进行离子电渗，通过移液管注入芝加哥蓝染料。实验结束后，按照标准操作流程灌注动物。随后切片脑组织，并根据需要进行复染，以确定所示记录位点的解剖学位置。这是一只大鼠主动扫动胡须时，VPM 丘脑神经元的示例性放电活动。下图是神经元放电时间相对于振动运动瞬时相位对齐的直方图。在胡须回撤阶段，放电次数更多。记录结束后，通过注射芝加哥蓝染料标记该单位的位置。如图所示，组织经细胞色素氧化酶活性复染，以显示VPM丘脑的神经解剖边界。观看本视频后，您应能充分理解如何实施手术和电生理技术，以将动物头部固定于立体定位平面，并明确分离单个神经元的放电活动。

juxtacellular-monitoring-localization-single-neurons-within-sub

Research

科研

JoVE Journal

Neuroscience

神经科学

警报，头抑制大鼠子皮层的大脑结构中Juxtacellular监测和本地化单神经元

在自由活动动物的不同脑区中监测细胞外神经递质水平，有助于揭示神经递质释放与行为之间的关联。结合电化学检测的活体微透析技术可提供优异的解剖学和化学分辨率，并可用于研究药理学或生理学干预如何改变基础神经递质传递。...

可存活的啮齿类动物立体定位手术

将介绍在麻醉大鼠中使用硅探针进行神经元活动的细胞外记录技术。该技术能够同时从超过100个神经元中获取多个脑区的信息，以单细胞分辨率提供关于多个局部神经回路中神经元集群动态的信息。...

使用硅探针在麻醉大鼠中记录大规模神经元集群活动

本视频展示了在多个位点进行脑电活动电生理记录前，制备麻醉大鼠的详细步骤。通过解剖头皮暴露颅骨，并在精确位置钻孔以安装和固定电极。随后将钨丝微电极插入目标位置，以记录数据。...

在大鼠多个脑区进行体内电生理记录脑活动

来源： Maruoka, H., et. al. 清醒小鼠中同时成像小胶质细胞动态与神经元活动。J. Vis. Exp. (2022)...

在清醒小鼠中同步成像小胶质细胞动态与神经元活动

来源：Moore, J. D., 等. 在清醒、头部固定的大鼠皮层下脑结构中对单个神经元进行细胞外邻近记录与定位. J. Vis. Exp.

清醒大鼠中用于精确定位神经活动的紧密细胞记录与染色技术

来源：Lai, J., et al. 在啮齿类动物大脑中同时进行电生理记录与抑制剂微注射。J. Vis. Exp.

抑制大鼠神经元活动及其通过电生理学检测的方法

为了理解神经元网络的结构，必须对单个神经元进行功能和形态学表征。本文展示了贴附式生物胞素标记技术，该方法可在细胞外构型下进行电生理记录，同时仍能对神经元进行细胞内标记以 术后 临时的...

近胞体生物胞素标记法用于研究单个皮层神经元的结构-功能关系

该方法为小鼠在显微成像或单细胞电生理记录期间提供了一个可感知且熟悉的环境，使其能够在动物头部被牢固固定的情况下进行导航与探索。...

平底式气浮平台：一种将清醒自由活动啮齿类动物行为学与显微成像或电生理记录相结合的新方法

本研究介绍了在乌拉坦麻醉条件下对超直接通路进行多部位体内电生理记录的方法学。...

急性麻醉大鼠超直接通路局部场电位与多单元活动的体内电生理记录

当与头部固定板及兼容单光子和双光子显微镜的光学设计结合使用时，微棱镜透镜在多种条件下测量垂直神经元柱中的神经反应方面具有显著优势，包括在头部固定状态下的精确控制实验，或在自由活动动物中进行的自然行为任务。...

使用微棱镜对自由活动和头部固定动物中已鉴定的神经元群体进行长期成像

发育过程中，新皮层的初级感觉区表现出独特的自发性活动。本文介绍了如何在新生小鼠中可视化单个神经元活动及初级感觉区，以分析特定脑区的同步活动 体内.

活体单神经元分辨率下新生小鼠感觉皮层自发活动的可视化

了解清醒大鼠亚皮层脑结构中单个神经元的细胞旁记录与定位方法。本方案通过手术植入头部固定装置，实现稳定电生理记录，并利用芝加哥天蓝染料标记记录位点，为神经科学研究提供可靠技术框架。

清醒且头部固定的雄性大鼠皮层下脑区单个神经元的紧密细胞外记录与定位关键词：紧密细胞外记录，单神经元记录，皮层下脑结构，清醒动物，头部固定，大鼠

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