一种用于细胞与组织力学生物学研究的新型拉伸平台

本实验的总体目标是展示一种各向异性拉伸平台的新颖性，该平台可用于研究单个细胞对复杂机械形变的响应，并量化生物组织的力学特性。首先，制备柔性膜并将该膜安装到一组夹具上；第二步是在膜上接种C2C12细胞，过夜培养后，于次日将夹具安装至拉伸平台上。

接下来，在另一组实验中，从小鼠模型中取出胸主动脉组织，并清除所有结缔组织。然后使用另一组夹具将主动脉组织固定在拉伸平台上。最终，利用拉伸平台在两个正交方向上诱导细胞产生形变，并可通过倒置显微镜对形变程度进行定量分析。

或者，也可将力传感器集成到拉伸装置中，以测量组织的刚度。与现有的单轴或双轴细胞拉伸技术相比，该技术的主要优势在于，它能够在细胞附着的透明膜上独立控制两个正交方向上的形变，从而实现活细胞成像。显微镜观察还需要对一系列不同的夹具进行精心设计。

通过在平台上集成四弦用户系统，使我们能够在生物组织上进行10个细胞的测试，以量化其力学特性。本视频介绍了双轴拉伸平台，这是一种定制装置，可用于研究基底形变在细胞水平上的影响，并对生物组织进行拉伸测试。相关论文详细描述了双轴拉伸平台的设计与功能，以探究机械形变对单个细胞的影响；首先需要制备一种细胞可黏附的柔性透明基底。

开始此操作时，将500微升荧光微球溶液移入1.5毫升微量离心管中，在16,200 ×g条件下离心10分钟，弃去上清液，加入500微升异丙醇，随后涡旋振荡5分钟。将离心管置于暗处静置过夜，以使较大的颗粒聚集体充分沉降。次日早晨，小心地将上清液转移至一支洁净的微量离心管中。该微球溶液可用于制备五个以上的基底，因为微球溶液在接下来的三天内会持续沉降。

务必避免Resus重悬沉淀。将PDMS试剂盒中提供的0.5克固化剂倒入1.5毫升微量离心管中。加入15微升荧光微球，涡旋混匀1分钟。

重复此操作五次，共加入 90 微升微珠，放置备用。称取 10 克 PDMS，加入 0.5 克固化剂，并补充荧光微珠，混合至少 12 分钟。接着，使用移液管将四毫克含微珠的 PDMS 转移至先前采用标准光刻技术制备的 SUH 2050 十字形模具中。

该模具高度为320微米，面积为13.4平方厘米，可容纳428微升或440毫克的PDMS，在80摄氏度下加热固化2小时。固化完成后，将基底从模具上剥离，基底可在室温下的培养皿中保存两周，其机械性能无明显变化。在培养皿中滴加PDMS液滴，最终直径约为4毫米，倒置后在80摄氏度下固化2小时，培养皿必须保持倒置状态，以防止液滴在固化过程中变平。

这些锚定结构可在培养皿中保存数周。对基底及八个锚定结构进行空气等离子体处理，将基底两端的锚定结构固定在距基底上用于安装膜的方形凹槽四毫米处。将基底两端分别缠绕在夹具的圆柱形凹槽部分，并从顶部用两个紧定螺钉将其固定。

将四个夹具拧紧在夹具架上。然后在基底与夹具的带槽部分之间的界面处注入PDMS。使用1.5毫米六角扳手将未固化的PDMS涂抹至带槽的圆柱部分周围。

将PDMS倒入沟槽中，利用毛细作用使其完全填充，然后在80摄氏度下固化两小时，之后在膜上接种细胞。空气等离子体处理：对整个装置进行处理，以灭菌并使基底功能化，从而便于胶原蛋白包被。

在室温下，用1毫升含有16微克/毫升大鼠尾胶原的0.02摩尔乙酸溶液处理将要接种细胞的基质区域，孵育1小时。目标终浓度的胶原密度为每平方厘米5微克。孵育1小时后，用磷酸盐缓冲液冲洗基质三次，并在室温下干燥至少10分钟。随后加入40微升培养基，培养基中添加10%胎牛血清和1%青霉素。

在基质中央区域加入含2000个细胞的链霉素，覆盖面积为1平方厘米。本示例中，细胞密度为每平方厘米20个细胞。然而，细胞密度可根据实验需求进行调整。

将整个装置放入标准的细胞培养箱中，确保基底朝上，并在其上放置含有细胞的培养基液滴。装置必须保持基底朝上至少三小时，以使细胞牢固附着于基底并防止蒸发。向基底上的液滴中加入30 µL温热的培养基。

在三小时后，每隔45分钟将整个组件翻转至一个装有新鲜培养基的培养皿中，浸没基质并孵育过夜，以使细胞在次日增殖。将装置安装在倒置的相差或荧光显微镜上。将夹具-基质组件安装在双轴拉伸平台上，并将电机置于培养皿加热器内的培养皿中，加入新配制的HEPES缓冲盐溶液。

这种生理溶液通过模拟正常组织的血液环境，用于在显微镜载物台上维持细胞状态。相同的双轴拉伸平台也可用于量化小块组织样本的刚度。本演示中将使用分离的小鼠主动脉。

处死小鼠后，移除膈肌、胸廓和肺叶，以尽量降低组织损伤的风险。保持心脏与主动脉相连，避免直接接触血管，但可通过心脏进行操作。

轻轻剪开血管与脊柱之间的组织，完整保留组织内部结构，取出心脏、主动脉根部及胸主动脉。切开过程中应注意避免对血管造成任何牵拉延长。立即将心脏和主动脉浸入克雷布斯（Krebs）溶液中，并在实验期间保持溶液温度为37摄氏度，该溶液需每日新鲜配制。

在手术解剖显微镜下，将主动脉剪下并用 Krebs 溶液仔细冲洗，以去除所有血凝块。使用显微剪刀和镊子去除结缔组织。需注意保留完整的血管长度，并以主动脉根部确定血管的方向。

需要测定无负荷状态下的血管尺寸，以确定血管的刚度。切取一段长约两毫米的主动脉环，并使用校准后的显微镜设置精确测量其长度。将该血管段置于Kreb's溶液中备用。

接下来，从移除2 mm血管段后剩余的主动脉组织中切取两个小型主动脉环。一个取自2 mm血管段之前的主动脉部分，另一个取自2 mm血管段之后的主动脉部分。将这两个主动脉环置于显微镜载玻片上，使管腔面朝上，并使用已校准的显微镜设置测量管壁厚度。

使用这两个环测量并计算主动脉壁厚度的平均值。将克雷布斯溶液倒入双向拉伸平台上的培养皿中，并将2毫米的主动脉环段放置在拉伸针上。在本实验方案中，双向拉伸平台用于研究单个鼠成肌细胞在基底变形为25%位移变形条件下细胞核的力学响应。

这些代表性结果展示了进行标准单轴拉伸和纯单轴拉伸所得到的关系。在视频的第一帧中手动选择荧光微珠，并在后续各帧中沿水平和垂直方向持续追踪，直至达到最大拉伸程度。一个 MATLAB 脚本自动计算每帧中绿色应变张量的分量，并生成应变相对于电机位移的校准曲线。

在这些图中，蓝色和红色线条分别对应绿色拉伸梁沿水平和垂直方向的分量。这些结果展示了双向拉伸平台在基底上沿两个正交方向诱导形变的能力。除了标准的单轴和双向应变场外，该双向拉伸平台还能在基底上诱导出复杂的应变场。

图G显示，沿x轴将同一基底拉伸4毫米，同时沿y轴轻微拉伸1.5毫米（以红色突出显示），可产生纯单轴应变场，且基底中无压缩形变。图H显示，当沿x轴拉伸基底3.5毫米，并在垂直轴方向固定基底两端时（以红色突出表示），可产生25%的拉伸形变和7%的压缩形变。为实现在拉伸过程中进行活细胞显微成像，细胞核被一种可结合DNA的活细胞荧光染料染色，随后沿每个正交拉伸轴方向依次拉伸25%，如图中各拉伸周期阶段所示。在每次拉伸前后，分别采集明场对比图像和落射荧光图像，以观察细胞核在未形变状态和形变状态下的形态。利用ImageJ插件测定细胞核在未形变状态下以及依次沿其长轴和短轴方向拉伸时的长轴与短轴长度，并据此计算长度的相对变化。

在此柱状图中，X轴或长轴以蓝色显示，y轴或短轴以红色显示。细胞核的变形能力表现出力学各向异性，即沿其短轴方向的变形能力显著高于长轴方向。为研究肌动蛋白和微管细胞骨架在调控核变形能力中的作用，分别使用细胞松弛素D（cyto D）和诺考达唑（neol）选择性地解聚肌动蛋白纤维或微管。结果发现，解聚肌动蛋白纤维或微管均会导致细胞核各向异性变形能力的丧失。

这些结果支持了以下发现：细胞骨架组分可将来自基质的力传递至细胞核，并且对于维持细胞核正常的力学行为也至关重要。在变形过程中，双轴拉伸平台还被用于评估热休克蛋白27（HSP27）的慢性过表达对血管硬度的影响。在易发生动脉粥样硬化的转基因小鼠模型中，载脂蛋白E（APOE）纯合性缺失通过增加内膜平滑肌细胞和胶原含量，改变了动脉粥样硬化病变的组织学构成。

为了确定这种组织学重塑对血管力学特性的影响，使用拉伸平台测量主动脉的刚度。该图显示了在拉伸主动脉血管时获得的典型应力-应变曲线，其中刚度是在应变为30%时计算的。刚度即为红色直线所示切线斜率。

研究发现，与对照小鼠模型相比，过表达HSP 27的小鼠主动脉节段刚度显著增加了41%。综合机械性能评估与血管及斑块组织学分析表明，HSP 27的过表达特征表现为血管刚度增加以及胶原蛋白和平滑肌细胞含量升高。这些结果提示，HSP 27可能通过增强动脉粥样硬化病变的稳定性，从而降低斑块破裂的风险。

该技术为生物工程领域的研究人员探索细胞对复杂且具有变力作用的机械形变的响应提供了新途径，不仅可用于机械生物学研究，还可用于监测疾病状态下生物组织的力学特性。