Name: 在细胞和组织力学生物学应用一种新型的拉伸平台 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-06-03T14:15:00.000+00:00
Duration: 16 min 46 s
Description: 了解一种新型各向异性拉伸平台在细胞和组织力学生物学中的应用，该平台可独立控制两个正交方向的变形，用于研究C2C12细胞和小鼠主动脉组织对复杂机械变形的响应，并量化生物组织的力学特性。

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DT 获得了魁北克自然科学与技术研究基金会（FQRNT）的博士后奖学金以及 MITACS Elevate 战略研究员项目的支持。CMC 获得了魁北克健康研究基金会（FRSQ）以及渥太华心脏研究所 Ernest 和 Margaret Ford 心脏病学专项研究奖学金的支持。EOB 获得了加拿大卫生研究院（CIHR）项目 MOP80204 和安大略心脏与中风基金会项目 T6335 的运营资助。CIHR 与美敦力公司（Medtronic）共同为 EOB 提供经同行评审的研究讲席（URC #57093）。AEP 获得了加拿大自然科学与工程研究理事会（NSERC）发现基金、NSERC 发现加速补充基金的支持，并承蒙加拿大研究讲席（CRC）计划以及安大略省政府早期研究者奖的资助。

1. 单细胞的机械变形
<ol>
	<li>制备嵌入荧光微珠的 PDMS 基底 
在制备基底之前，由于 PDMS 具有疏水性，需将水溶液中的荧光微球重悬于异丙醇中，以增强微珠在 PDMS 中的混合均匀性。
	<ol>
		<li>用移液器将 500 μl 荧光微球加入 1.5 ml 微离心管中，并在 16,200 × g 下离心 10 分钟。</li>
		<li>弃去上清液，加入 500 μl 异丙醇，涡旋振荡 5 分钟。将管子置于暗处静置过夜，以使较大的颗粒聚集体充分沉降。</li>
		<li>次日早晨，小心将上清液转移至洁净的微离心管中。该微珠溶液可用于制备超过 5 个基底。注意：该微珠溶液在接下来的 3 天内会持续沉降，请避免重新悬浮沉淀物。</li>
		<li>使用分析天平称取 PDMS 试剂盒中提供的固化剂 0.5 g 至 1.5 ml 微离心管中。分六次加入共 90 μl 微珠溶液（每次 15 μl），每次加入后涡旋 1 分钟。混合完成后静置备用。</li>
		<li>称取 10 g PDMS，并与含荧光微珠的 0.5 g 固化剂充分混合至少 12 分钟。</li>
		<li>按照制造商说明，采用标准光刻技术制备 SU-8 2050 十字形模具。所用模具高度为 320 μm，面积为 13.4 cm2（图 3）。该模具可容纳 428 μl 或 440 mg PDMS。</li>
		<li>用移液管将 400 mg 含微珠的 PDMS 加入十字形模具中，在 80 °C 下固化 2 小时。固化后，将基底从模具上剥离（图 5A）。该基底可在培养皿中室温保存 2 周，其机械性能无明显变化。</li>
		<li>在培养皿中滴加 PDMS（固化剂:PDMS 比例为 1:20），最终液滴直径约为 4 mm，并在 80 °C 下倒置固化 2 小时（图 5B）。这些锚定结构可在培养皿中保存数周。注意：应保持培养皿倒置，防止液滴在固化过程中变平。</li>
		<li>对基底及 8 个锚定结构进行空气等离子体处理（30 秒，30 W），并将锚定结构粘附于基底两端，距离基底上的方形凹槽 4 mm 处（图 5C）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将膜固定在夹具上
	<ol>
		<li>将基底两端缠绕在夹具的带槽圆柱部分，并从顶部用两颗紧定螺钉固定（图 2B 和 图 5D-E）。</li>
		<li>将 4 个夹具拧紧在夹具支架上，使用一次性移液管在基底与夹具带槽圆柱部分的界面处滴加 PDMS（比例 1:20）。使用 1.5 mm 六角扳手将未固化的 PDMS 涂布于带槽圆柱部分周围。</li>
		<li>通过毛细作用将 PDMS（1:20）填充至槽内直至完全充满，并在 80 °C 下固化 2 小时（图 5F）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在膜上接种细胞
	<ol>
		<li>对整个组件进行空气等离子体处理（30 秒，30 W），以实现灭菌并使基底功能化，便于后续胶原蛋白包被。</li>
		<li>在室温下，用 1 ml 含 16 μg/ml 大鼠尾胶原蛋白的 0.02 M 乙酸溶液对细胞接种区域进行功能化处理，孵育 1 小时。目标最终胶原蛋白密度为 5 μg/cm2。</li>
		<li>用磷酸盐缓冲液冲洗基底 3 次，并在室温下干燥至少 10 分钟。</li>
		<li>在基底中心区域加入 40 μl 含 2,000 个细胞的培养基（含 10% 胎牛血清和 1% 青霉素-链霉素），覆盖面积为 1 cm2（细胞密度：20 个细胞/mm2）。可根据实验需求调整细胞密度。</li>
		<li>将整个组件放入标准细胞培养箱中，使基底朝上，细胞悬液液滴位于其上。注意：组件必须保持基底朝上至少 3 小时，以确保细胞牢固贴附。为防止蒸发，每 45 分钟向基底上的液滴中添加 30 μl 预热的培养基，持续 3 小时。</li>
		<li>3 小时后，将整个组件翻转并放入盛有新鲜培养基的培养皿中，使基底完全浸没，过夜培养以促进细胞增殖。</li>
		<li>次日，配制 HEPES 缓冲盐溶液（HBSS；含 20 mM Hepes、120 mM NaCl、5.3 mM KCl、0.8 mM MgSO4、1.8 mM CaCl2 和 11.1 mM 葡萄糖），调节 pH 至 7.4。注意：HBSS 溶液需每日新鲜配制，并在实验过程中保持 37 °C。该生理溶液用于在显微镜观察期间模拟正常组织/血液环境，以维持细胞活性。</li>
		<li>将装置安装在倒置相差或荧光显微镜上。将夹具-基底组件安装至 BAXS 平台及电机上。在培养皿加热器内的培养皿中加入 HEPES 缓冲液（图 2D）。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 小口径血管的刚度测量
<ol>
	<li>准备
	<ol>
		<li>Krebs 生理溶液：配制含有 118.1 mM NaCl、11.1 mM D-葡萄糖、25 mM NaHCO3、4.7 mM KCl、1.2 mM MgSO4、1.2 mM KH2PO4 和 2.5 mM CaCl2 的溶液。用碳酰气体（95% O2/5% CO2）充氧 30 分钟，并将 pH 值调节至 7.4。注意：Krebs 溶液需每日新鲜配制，并在实验过程中保持在 37 °C。该生理溶液通过模拟正常组织/血液环境以维持组织活性。</li>
		<li>准备用于主动脉血管解剖和力学评估的仪器：手术剪、弯头镊子、显微剪、外科解剖显微镜、50 ml 聚丙烯离心管和 10 ml 移液管。手术和实验操作无需无菌条件。预先安装 BAXS 平台的夹具及负荷传感器。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>组织分离与解剖 
	所有涉及实验动物的操作均须经用户所在机构的动物护理与使用委员会批准，并符合用户所在国家《实验动物护理与使用指南》的相关规定。
	<ol>
		<li>通过在聚甲基丙烯酸甲酯（Plexiglas）腔室中吸入 99% CO2（7 psi）实施小鼠安乐死（图 6A）。</li>
		<li>打开小鼠腹腔并切断胸主动脉以放血。</li>
		<li>移除膈肌、胸廓和肺叶（图 6B）。注意：为尽量降低组织损伤风险，应保留心脏与主动脉相连，避免直接接触血管，而是通过心脏进行操作。</li>
		<li>轻柔地在血管与脊柱之间剪断，取下心脏、主动脉根部和胸主动脉（图 6C）。注意：切除过程中不得拉伸血管，以保持组织内部结构完整。</li>
		<li>立即浸入 Krebs 溶液中保存心脏和主动脉。</li>
		<li>在 Krebs 溶液中剪切并仔细清洗主动脉，以去除所有血凝块。使用显微剪、镊子和外科解剖显微镜去除结缔组织（图 6D-E）。注意：应保留完整的血管长度，并利用主动脉根部确定血管方向。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>血管尺寸测定与安装 
	为测定血管刚度，需获取未受载荷状态下的血管尺寸，可通过校准后的显微镜进行测量。
	<ol>
		<li>截取一段长约 2 mm 的主动脉环，并使用校准后的显微镜精确测量其长度（图 6F-G）。将此段暂时置于 Krebs 溶液中备用。</li>
		<li>在每两个 2 mm 节段之间尽可能剪下一段微小的主动脉环（图 6F）。将该小段组织置于载玻片上，管腔面朝上，使用校准后的显微镜测量管壁厚度（图 6H）。</li>
		<li>将 BAXS 平台上的培养皿中加入 Krebs 溶液，并将 2 mm 长的主动脉环段安装至拉伸针上（见 图 4C 插图）。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
<img alt="微流控芯片制备过程、PDMS浇铸、膜集成、力学测试装置。" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51454/51454fig5highres.jpg" width="500" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图5"> 
图5. PDMS基底的制备与安装。 A) 固化后，将基底从SU-8 2050模具上小心剥离，并置于培养皿中备用。 B) 由PDMS制成的锚定结构有助于将基底固定在夹具上。 C) 带有锚定结构的基底，已准备就绪用于安装。 D) 将基底安装在4个夹具上，随后将夹具安装到夹具支架上（见插图）。 E) 基底安装在4个夹具上的细节图。 F) 在基底下方的凹槽中浇注PDMS的操作过程。箭头显示PDMS通过毛细作用缓慢填充凹槽。
<img alt="小鼠解剖装置、器官提取、组织学标本制备；解剖学研究实验。" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51454/51454fig6highres.jpg" width="500" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图6"> 
图6. 胸主动脉的制备与分离。 A) 准备手术器械和已处死的小鼠。B) 通过腹部纵向切口，移除胸腔和肺叶。C) 利用心臟操纵组织，小心分离主动脉。D) 将心脏和主动脉置于Krebs生理溶液中，并清除主动脉上所有结缔组织。E) 显示心脏与主动脉的详细图像。F) 用于刚度评估的主动脉节段，以及用于厚度测量的小段样本。G-H) 使用倒置显微镜和分析软件评估各血管节段的精确长度（G）和厚度（H）。

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作者声明不存在任何竞争性财务利益。

本文介绍的BAXS平台可支持多种力学生物学研究实验，涵盖从单细胞到整个组织的研究。此外，该平台具有高度灵活性和可配置性，能够开展多种力学刺激实验以及多轴拉伸测试。该平台还能在生理条件下维持细胞和组织的活性，并支持在拉伸实验过程中同步进行显微成像。前文所述的两个实验展示了在使用适当夹具组件时，BAXS平台所具备的多功能性。模块化且可定制的样品固定系统、良好的光学通路，以及附加传感器（例如载荷传感器）的可能性，为开展更多类型的实验提供了广泛的空间。

上述方案包含多个关键步骤，必须妥善执行才能获得最佳结果。在细胞拉伸方案中，将PDMS基底安装到夹具上需要精细而精确的操作。PDMS基底必须相对于四个夹具良好居中，以避免在拉伸过程中基底发生不必要的横向移动。此类横向移动会使拉伸实验期间的细胞追踪变得困难。此外，当基底在培养箱中朝上放置时，在接种细胞过程中需密切监测培养液滴的蒸发情况。根据培养箱门在操作过程中开启的频率，蒸发速率可能会发生变化。在血管拉伸方案中，最关键的步骤是对待测样品的尺寸进行测量。这些尺寸必须尽可能准确，因为它们参与...

机械微环境在多种细胞功能（如增殖、迁移和分化）中发挥重要作用，这些功能对组织的发育与稳态以及疾病的发生发展具有深远影响1-6多年来，人们已使用多种实验工具对细胞或组织施加机械刺激，并测量生物组织的力学特性，旨在增进对基本力学生物学的理解，并研究疾病的发生与发展过程6-17然而，人们通常需要依赖多种不同的实验设备才能实现特定研究的目标。本文介绍了一种单一的、多功能的双向拉伸（BAXS）平台，可用于研究机械特性与机械力在从亚细胞到整个组织尺度的生物学过程中的作用。该BAXS平台不仅能够量化分离组织的机械特性，还可对活细胞施加简单、复杂和动态的应变场，从而有助于理解细胞对拉伸刺激的响应 体内BAXS 平台还具备在对细胞和组织进行力学测试及施加扰动的同时，开展活细胞显微成像的能力。
BAXS 平台是一种定制装置，可用于研究基底变形对细胞水平的影响，并对生物组织进行拉伸测试（图 1A）。该平台配备了一个铝制加热器，可容纳标准的 10 厘米培养皿，并通过温度控制器和聚酰亚胺加热片将任何生理溶液维持在 37 °C（图 1B）。此 BAXS 平台可集成到倒置相差显微镜和/或荧光显微镜上，实现同步成像（图 1C）。简而言之，BAXS 平台由四个线性音圈电机组成，其运动部件安装在沿两个垂直轴方向排列的微型直线运动球轴承滑轨上（图 1D）。每个电机均安装有一个线性定位平台，以实现夹持系统的垂直移动（图 1E）。每个电机的位置由分辨率为 500 nm 的光学编码器进行监测（图 1F）。所有四个电机均由运动控制器独立控制，该控制器利用光学编码器反馈来执行运动指令（图 1G）。通过 LabVIEW 界面可完全控制每个电机的位移幅度、速度和加速度，从而对细胞或组织样本施加完全可定制的静态和动态变形。
用于诱导细胞形变的技术是通过让细胞牢固地黏附在一种柔性透明基底上，然后利用BAXS平台的四个电机拉伸该基底来实现的。BAXS平台允许安装任意自定义设计的夹具组，以将基底固定在音圈电机上。为此，我们设计了一组夹具，可将由聚二甲基硅氧烷（PDMS）制成的柔性透明基底固定其上（图2A-C 和 图3）。由于这些夹具将接触生理溶液，所有部件均采用不锈钢加工而成，以便于灭菌。这些夹具经过精心设计，可使基底尽可能靠近显微镜物镜，从而提高成像质量，同时在拉伸过程中最小化基底所受的应力（图2D）。
相同的BAXS平台也可用于量化小型组织样本的刚度，只需配备一组合适的夹具，该夹具带有适配组织样本的支撑结构，并结合测力传感器来监测受力情况。可采用多种方法将组织固定到BAXS平台的电机上；例如，可将不锈钢昆虫微细针穿过血管组织的自然孔隙，以进行拉伸测试（图4A-B）。对于没有天然孔隙的较厚组织，可选择使用连接在音圈电机上的夹具固定组织边缘，或将组织边缘用生物胶粘附在小型玻璃载片上，再通过夹具将载片固定到电机上。为了实施拉伸测试，需配备微型测力传感器，该传感器可轻松安装在BAXS平台的电机上，用于测量拉伸循环过程中作用于组织上的力（图4C）。由于BAXS平台由四个电机组成，引入第二个测力传感器后，即可沿两个正交方向进行拉伸测试。这一功能使得在同一次实验中，能够量化单个组织在两个垂直方向上的机械刚度。
重要的是，在所有配置中，目标细胞或组织样本始终保存在用户可接触的温度控制浴中。这一特性使得在样本拉伸过程中可引入药理学试剂，以检测样本的时间响应。此外，由于倒置显微镜的光轴未受任何遮挡，用户仍可使用各种显微成像技术。最后，由于BAXS平台的四个电机相互独立，因此可对目标样本施加高度可调的应变场。体内的细胞和组织会受到复杂且各向异性的拉伸作用，而该平台相较于传统的单轴拉伸平台，能更适当地模拟此类条件7,13,15,18,19。此外，可在实验过程中实时改变应变场的物理特性。这些功能使用户能够研究细胞和组织水平对多种高度复杂、各向异性、时空动态变化的应变场的响应。本文介绍了BAXS平台的优势与局限性，以及其设计原理、工作原理和用于单细胞及整体组织实验的详细操作步骤。
<img alt="光学编码器装置、音圈电机；光谱实验；定位、数据分析。" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51454/51454fig1highres.jpg" width="500" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 1"> 
图 1. BAXS 平台概览。A) BAXS 平台的俯视图，显示四个音圈电机。B) 用于将细胞和组织维持在 37 °C 的培养皿加热装置的详细图示。C) 该平台可安装在倒置显微镜上，以便在拉伸实验期间进行活细胞成像。D) 音圈电机的详细图示；平台的运动部件。E) 线性定位平台的详细图示，可实现夹持系统的垂直位移。F) 光学编码器的详细图示，向运动控制器提供电机的实时位置信息。G) 运动控制器的详细图示，显示四个光学编码器输入端口以及向四个音圈电机输出的电源接口。
<img alt="细胞机械刺激实验装置示意图；图中显示定位平台、夹具和用于研究的光学编码器。" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51454/51454fig2highres.jpg" width="500" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 2"> 
图 2. 用于细胞拉伸实验的夹持系统。A-B) 图片展示了用于将PDMS基底固定到音圈电机以实现拉伸的夹具细节。C) 基底包裹在夹具的圆柱部分，其锚定结构嵌入顶部的凹槽中，随后通过紧定螺钉将基底及其锚定结构压紧固定在顶部凹槽内。D) BAXS平台示意图，显示夹具将基底固定到位。插图为附着细胞的基底的详细视图，位于盖玻片上方，正对显微镜物镜。
<img alt="机械部件设计图，详细尺寸与测量，工程分析。" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51454/51454fig3highres.jpg" width="500" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图3"> 
图3. 膜及其夹持系统的物料清单。图纸展示了集成到双轴平台上的主要部件的尺寸，用于进行细胞拉伸实验。
<img alt="静态平衡法；带载荷传感器和音圈电机的机械装置示意图。" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51454/51454fig4highres.jpg" width="500" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图4"> 
图4. 用于小口径血管刚度评估的夹具系统的示例。 A-B) 用于对直径为1 mm的小鼠主动脉施加变形的夹具系统的详细图像。不锈钢针被精细加工成开口三角形，以便血管可在两根针上滑动。C) BAXS平台示意图，其中夹具固定血管，载荷传感器连接在固定电机与左侧夹具之间。插图为血管安装在针上的顶部详图。

<table><tbody><tr><td>PDMS</td><td>Ellsworth Adhesives</td><td>184 SIL ELAST KIT 0.5KG</td><td>本方案中基础剂与交联剂的混合比例为20:1。在层流罩中混合，以防止灰尘污染您的&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>FluoSpheres 荧光微球</td><td>Invitrogen</td><td>F8810</td><td>避光保存。</td></tr><tr><td>线性音圈电机</td><td>Moticont</td><td>LVCM-051-051-01</td><td>电机由两部分组成（磁体和线圈）。必须安装在滚珠轴承系统上才能正常工作。</td></tr><tr><td>滚珠轴承滑轨</td><td>Edmund Optics</td><td>NT37-360</td><td>微型和小型直线运动滚珠轴承滑轨</td></tr><tr><td>线性定位平台</td><td>Edmund Optics</td><td>38-960</td><td>中心驱动1.25&quot; 方形线性位移平台</td></tr><tr><td>光学编码器</td><td>GSI microE systems</td><td>Mercury II 1600S - 0.5µm 分辨率</td><td>反射式增量编码器。</td></tr><tr><td>运动控制器</td><td>Galil</td><td>DMC-2143(DIN)-DC48 with AMP-20440</td><td>四轴控制器配四轴放大器</td></tr><tr><td>载荷传感器</td><td>Honeywell</td><td>31 low</td><td>微型载荷传感器，量程为0–150 g</td></tr><tr><td>昆虫细针（0.20 mm）</td><td>Pin Service Austerlitz Insect pins</td><td></td><td>不锈钢针，弯曲成张开的三角形</td></tr><tr><td>SU-8 2050</td><td>Micro Chem</td><td>SU-8 2050</td><td>永久性环氧负性光刻胶。避免受热和光照</td></tr><tr><td>空气等离子体处理系统</td><td>Glowresearch</td><td></td><td>Autoglow 氧等离子体系统</td></tr><tr><td>大鼠尾胶原蛋白</td><td>Invitrogen</td><td>A10483-01</td><td>Ⅰ型胶原蛋白，大鼠尾来源，5 mg/mL</td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Invitrogen</td><td>R37605</td><td>特异性结合DNA的荧光染料。需冷藏保存。</td></tr><tr><td>聚酰亚胺薄膜（Kapton）绝缘柔性加热器</td><td>omega.ca</td><td>KHLV-0504/(10)-P</td><td>28 V 柔性加热器；可由24 V供电</td></tr><tr><td>1/16 DIN 自整定温度与过程控制器</td><td>omega.ca</td><td>CN63200-R1-LV</td><td>温度控制器；供电电压24 V。</td></tr><tr><td>DMEM 培养基</td><td>Hyclone</td><td>SH3024301</td><td>Dulbecco&amp;rsquo;s 改良Eagle培养基。4 &amp;#176;C 保存</td></tr><tr><td>青霉素-链霉素</td><td>Hyclone</td><td>SV30010</td><td>原液冷冻保存。工作液于4 &amp;#176;C 保存。</td></tr><tr><td>胎牛血清（FBS）</td><td>Hyclone</td><td>SH3039603C</td><td>冷冻保存。</td></tr><tr><td>0.05% 胰蛋白酶</td><td>Hyclone</td><td>SH30236.02</td><td>冷冻保存。用于消化细胞贴壁蛋白以进行传代培养</td></tr><tr><td>Hepes</td><td>Wisent Inc</td><td>330-050-EL</td><td>HEPES缓冲盐溶液&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP358-1</td><td>HEPES缓冲盐溶液 / Krebs 生理溶液</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP366-500</td><td>HEPES缓冲盐溶液 / Krebs 生理溶液</td></tr><tr><td>MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Fisher Scientific</td><td>M65-500</td><td>HEPES缓冲盐溶液 / Krebs 生理溶液</td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Fisher Scientific</td><td>C614-500</td><td>HEPES缓冲盐溶液 / Krebs 生理溶液</td></tr><tr><td>葡萄糖</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP220-1</td><td>HEPES缓冲盐溶液 / Krebs 生理溶液</td></tr><tr><td>NaHCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP328-1</td><td>Krebs 生理溶液</td></tr><tr><td>KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP362-500</td><td>Krebs 生理溶液</td></tr><tr><td>碳酰气（95% O&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;/5% CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;）</td><td>Lindle</td><td>DIN:02154749</td><td>用于Krebs 生理溶液的氧合</td></tr><tr><td>诺考达唑</td><td>Sigma</td><td>M1404</td><td>微管去聚合剂</td></tr><tr><td>细胞松弛素D</td><td>Sigma</td><td>C8273</td><td>肌动蛋白丝去聚合剂</td></tr><tr><td>抗-&amp;alpha;-SMA-FITC</td><td>Sigma</td><td>F3777</td><td>用于染色并定量平滑肌细胞含量</td></tr><tr><td>苦味酸天狼星红染色液</td><td>Fluka</td><td>43665</td><td>用于染色并定量胶原蛋白含量</td></tr></tbody></table>

一种用于细胞与组织力学生物学研究的新型拉伸平台

A Novel Stretching Platform for Applications in Cell and Tissue Mechanobiology

能够对细胞和组织施加机械力，或可量化生物组织机械特性的工具，已极大地推动了基础力学生物学的发展。这些技术已被广泛用于证明多种疾病的起始与进展过程在很大程度上受到机械信号的影响。本文介绍一种多功能双轴拉伸（BAXS）平台，该平台既可用于对单个细胞进行机械刺激，也可用于量化组织的机械刚度。BAXS平台由四个可独立控制的音圈电机组成。单个细胞可培养于柔性基底上，该基底可连接至电机，从而允许将细胞暴露于复杂、动态且空间变化的应变场中。相反，通过集成力传感器，也可在组织经历形变循环时量化其机械特性。在这两种情况下，均需设计并安装合适的夹具至BAXS平台的电机上，以牢固固定柔性基底或目标组织。BAXS平台可安装于倒置显微镜上，以便在拉伸实验过程中同步进行透射光和/或荧光成像，以观察样品的结构或生化响应。本文提供了BAXS平台的设计与使用方法的实验细节，并展示了针对单细胞和完整组织的研究结果。BAXS平台被用于测量单个小鼠成肌细胞在基底应变作用下细胞核的形变，以及测量分离的小鼠主动脉的刚度。BAXS平台是一种多功能工具，可与多种光学显微技术联用，从而在亚细胞、细胞和整体组织水平上提供新颖的力学生物学见解。

细胞拉伸
利用BAXS平台研究了暴露于25%基底形变下的单个小鼠成肌细胞（C2C12）细胞核的力学响应。成肌细胞存在于肌肉组织中，在体内持续受到机械拉伸和压缩作用。in vivo研究表明，细胞核的形态和力学特性在基因表达和转录活性的调控中起着重要作用20,21，同时也与多种发育缺陷和疾病相关，如Hutchinson-Gilford早衰综合征（HGPS）、Emery-Dreifuss肌营养不良症（EDMD）、扩张型心肌病、早衰以及癌症22-25。因此，理解来自外部力学微环境的力如何影响细胞核的结构与功能具有重要意义。本研究采用BAXS平台，通过沿基底主轴或次轴方向拉伸基底，探究力学信号从微环境向细胞核的传递过程。图7A-F展示了该平台在两个正交方向上诱导基底形变的能力。此外，BAXS平台不仅能产生标准的单轴或等双轴应变场，还可诱导复杂的应变场。图7G-H展示了通过独立控制两个正交方向上的应变场所带来的灵活性，使我们能够产生...

本文介绍了一种新型拉伸平台，可用于研究单个细胞对复杂各向异性双轴机械变形的响应，并量化生物组织的力学特性。

允许对细胞和组织施加机械力，或可量化生物组织机械特性的工具已……

本实验的总体目标是展示一种各向异性拉伸平台的新颖性，该平台可用于研究单个细胞对复杂机械形变的响应，并量化生物组织的力学特性。首先，制备柔性膜并将该膜固定在一组夹具上；第二步是在膜上接种C2C12细胞，过夜培养后，于次日将夹具安装到拉伸平台上。接下来，在另一组实验中，从小鼠模型中取出胸主动脉组织，并清除所有结缔组织。然后使用另一组夹具将主动脉组织固定在拉伸平台上。最终，利用拉伸平台在两个正交方向上对细胞施加形变，并可通过倒置显微镜对形变程度进行定量分析。或者，也可将力传感器集成到拉伸装置中，以测量组织的刚度。与现有的单轴或双轴细胞拉伸技术相比，该技术的主要优势在于，它能够在细胞附着的透明膜上独立控制两个正交方向上的形变，从而实现活细胞成像。显微观察还需要对一系列不同的夹具进行精心设计。通过在平台上集成四串用户，可对生物组织进行10个细胞的测试，以量化其力学特性。本视频介绍了双轴拉伸平台，这是一种定制装置，可用于研究基底形变在细胞水平上的影响，并对生物组织进行拉伸测试。相关论文详细阐述了双轴拉伸平台的设计与功能，以探究机械形变对单个细胞的影响；首先需要制备一种细胞可黏附的柔性透明基底。开始此操作时，将500微升荧光微球溶液移入1.5毫升微量离心管中，在16,200 ×g条件下离心10分钟，弃去上清液，加入500微升异丙醇，随后涡旋振荡5分钟。将离心管置于暗处静置过夜，以使较大的颗粒聚集体充分沉降。次日早晨，小心地将上清液转移至一支洁净的微量离心管中。该微球溶液可用于制备五种以上的基底，因为微球溶液在接下来的三天内会持续沉降。务必避免Resus重悬沉淀。取0.5克PDMS试剂盒中提供的固化剂，加入1.5毫升微量离心管中。加入15微升荧光微球，涡旋混匀1分钟。重复此步骤五次，共加入90微升珠子，放置备用。称取10克PDMS，加入0.5克固化剂，并补充荧光珠子，混合至少12分钟。接下来，使用移液管将含珠子的四毫克PDMS转移至先前采用标准光刻技术制备的SUH 2050十字形模具中。该模具高度为320微米，面积为13.4平方厘米，可容纳428微升或440毫克的PDMS，在80摄氏度下固化PDMS两小时。固化完成后，将基底从模具上剥离，基底可在室温下的培养皿中保存两周，且未表现出显著变化及其机械性能。在培养皿中滴加PDMS液滴，最终直径约为4毫米，在80摄氏度下倒置固化两小时，培养皿必须保持倒置状态，以防止液滴在固化过程中变平。这些锚定结构可在培养皿中保存数周。对基底和八个锚定结构进行空气等离子体处理，将基底两端的锚定结构固定在距离基底上方形凹槽四毫米的位置，以便将膜固定在夹具上。将基底的每一端缠绕在夹具的圆柱形凹槽部分，并从顶部用两个紧定螺钉将其固定。将四个夹具拧紧在夹具架上。然后在基底与夹具的带槽部分之间的界面处注入PDMS。使用1.5毫米六角扳手将未固化的PDMS涂

a-novel-stretching-platform-for-applications-cell-tissue

Research

科研

JoVE Journal

Bioengineering

生物工程

在细胞和组织力学生物学应用一种新型的拉伸平台

在本方案中，我们演示了该技术所基于的垂直位移微柱阵列微致动器的制备方法，并介绍了如何对该基础技术进行改进，以在二维和三维培养模式下实现高通量的力学动态细胞培养。...

用于力学动态细胞培养的微加工平台

本研究开发了一种新型成像方案，采用定制的电机驱动机械执行器，可实现对活细胞在机械应变下的实时响应进行测量。该系统适用于力学生物学研究，能够施加高达20%的应变，同时支持使用共聚焦显微镜或原子力显微镜进行近实时成像。...

活细胞成像在机械拉伸过程中的应用

细胞分化受到多种微环境因素的调控，包括基质成分和基底材料特性。本文介绍一种技术，该技术结合细胞微阵列与牵引力显微镜，用于评估在不同微环境背景下细胞的分化状态以及细胞与基底之间的生物力学相互作用。...

一种用于细胞分化与牵引力相关性分析的高通量细胞微阵列平台

本文介绍了一种基于力学的实验方案，用于破坏缝隙连接蛋白 connexin...

通过连接蛋白43结构破坏干扰内皮细胞生物力学

本方法涉及在允许活细胞共聚焦显微镜观察的同时，对嵌入硅橡胶中的三维软水凝胶进行单轴拉伸。文中展示了对外部和内部水凝胶应变以及纤维取向的表征。所开发的装置与实验方案可用于评估细胞对不同应变条件的响应。...

活体显微成像下三维水凝胶的可控应变

本研究提出了一种新方案，通过将磁性微珠递送至细胞质，直接对细胞核施加机械力，同时进行活细胞荧光成像。...

结合三维磁力驱动装置与多功能荧光成像技术研究细胞核力学生物学

本文介绍一种利用基于电子学的微流控平台——机械节点孔传感（mechano-NPS）技术，对单个细胞进行机械表型分析的方法。该平台在测量细胞弹性与黏性等生物物理特性的同时，可保持每秒1至10个细胞的中等通量。...

机械-节点-孔传感：一种用于多参数单细胞黏弹性测量的快速无标记平台

本文介绍了一种多功能等双轴拉伸装置，该装置由气动驱动，且兼容高分辨率显微镜成像。...

用于高倍率活细胞共聚焦荧光显微镜观察的双轴拉伸装置

本文介绍了一种新型装置，该装置能够在支持细胞于刚度可调且蛋白基质可定制的基底上培养的同时，向细胞施加各向同性和单轴应变波形。这一结构简单且经济的实验平台使研究人员能够在基础研究和与疾病相关的环境中探究机械信号如何调控细胞功能。...

一种新型平台 体外 细胞拉伸与成像

在金表面由长链烷烃硫醇形成的自组装单分子层（SAMs）为蛋白质图案化和细胞限域提供了明确的基底。使用聚二甲基硅氧烷（PDMS）印章对十六烷硫醇进行微接触印刷，随后用端基为乙二醇的烷烃硫醇单体进行反向填充，可形成一种图案，其中蛋白质和细胞仅吸附于印章转移的十六烷硫醇区域。...

创建用于蛋白质和细胞限制的二维图案化基底

了解一种新型各向异性拉伸平台在细胞和组织力学生物学中的应用，该平台可独立控制两个正交方向的变形，用于研究C2C12细胞和小鼠主动脉组织对复杂机械变形的响应，并量化生物组织的力学特性。

一种用于细胞与组织力学生物学研究的新型拉伸平台

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