Name: 多聚核糖体分离和哺乳动物Translatomes分析在基因组范围内 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-05-17T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 56 s
Description: 学习多聚核糖体分离技术，利用蔗糖密度梯度离心法分析哺乳动物细胞中的mRNA翻译活性。该方法可用于研究胰岛素等处理对乳腺癌细胞翻译效率的影响，实现基因组水平的翻译组学分析。

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本研究得到了加拿大卫生研究院基金（CIHR MOP-115195）和FRQ-S对I.T.的资助，I.T.同时也是加拿大卫生研究院青年研究者奖获得者；以及瑞典研究理事会和瑞典癌症协会对O.L.的资助。

1. 蔗糖梯度制备
<ol>
	<li>在 ddH2O 中配制 100 ml 60% (w/v) 蔗糖溶液。应通过 0.22 µm 滤膜过滤该溶液，以防止在分级步骤（步骤 3.5）中堵塞管路。</li>
	<li>配制 5 ml 10x 蔗糖梯度缓冲液：200 mM HEPES (pH 7.6)、1 M KCl、50 mM MgCl2、100 µg/ml 环己酰亚胺、1x 蛋白酶抑制剂混合物（无 EDTA）、100 单位/ml RNase 抑制剂。</li>
	<li>使用步骤 1.1 中制备的 60% 溶液，在 1x 蔗糖梯度缓冲液中配制 40 ml 5% 和 50% 的蔗糖溶液。</li>
	<li>使用梯度制备仪附带的标记块，在每个聚碳酸酯超速离心管上标记半满位置，用于分层（共 6 根超速离心管）。使用梯度制备仪附带的分层装置，加入 5% 蔗糖溶液至半满标记处。然后从底部缓慢加入 50% 蔗糖溶液，直至两溶液界面达到半满标记处。此步骤需特别小心，确保各梯度尽可能一致，这对获得高重复性至关重要（见下文）。</li>
	<li>用梯度制备仪附带的速率区带离心专用盖密封离心管，并将密封后的离心管转移至梯度制备仪的管架中。</li>
	<li>运行梯度制备仪，生成线性 5% 至 50% 的蔗糖梯度。通过高倾斜角度旋转，几分钟内即可形成 6 条线性梯度。 
	注意：蔗糖梯度可立即使用，也可在 -80 °C 保存 6 个月。</li>
</ol>
2. 多聚核糖体的分离与沉降
<ol>
	<li>根据细胞类型，将细胞接种于1-5个15 cm培养皿中（约15 × 10⁶ 个细胞）6 至少在裂解前的一天接种细胞。实验当天，细胞汇合度应约为80%。 <!-- 注意：最佳汇合度至关重要，因为翻译和增殖速率与其成正比8，因此应在活跃增殖的细胞中分析多聚核糖体 即 在细胞过度融合时，翻译速率将显著下降，而细胞密度过低则可能无法提供足够的材料用于后续分析。如果研究者有意研究接触抑制对翻译的影响，则可对此规则作例外处理。然而，细胞不应长期处于过度融合的状态，因为这可能对转译组产生意外的影响。 
	如果需要进行转染，大多数市售转染试剂盒不会影响多聚核糖体水平。由于转染当天细胞融合度需达到80-90%，建议在转染后24小时继续培养细胞，并在转染后48小时分离多聚核糖体&#160;转染后从约80%汇合度的细胞中收集。</li>
	<li>在37 °C、5% CO₂条件下，于培养基中加入环己酰亚胺，使终浓度为100 µg/ml，孵育细胞5分钟2；用含有 100 µg/ml 环己酰亚胺的 10 ml 冰冷 1x PBS 洗涤细胞两次。环己酰亚胺是一种翻译延伸抑制剂，可使核糖体“停滞”在 mRNA 上，从而防止核糖体脱落 20.</li>
	<li>轻柔刮取细胞，用含有 100 µg/ml 环己酰亚胺的 5 ml 冰冷 1× PBS 收集细胞，并转移至 50 ml 离心管中。此步骤需尽快完成，因细胞在冰上放置时间过长会显著降低多聚核糖体样品的质量。</li>
	<li>在 4 °C 条件下，以 200 × g 离心 5 分钟收集细胞。</li>
	<li>弃去上清液，将细胞重悬于 425 μl 低渗缓冲液中 [(5 mM Tris-HCl (pH 7.5), 2.5 mM MgCl₂, 1.5 mM KCl)]2，加入5 μl 10 mg/ml环己酰亚胺（CHX）、1 μl 1 M DTT、100单位RNase抑制剂，涡旋5秒，随后加入25 μl 10% Triton X-100（终浓度0.5%）和25 μl 10%脱氧胆酸钠（终浓度0.5%），再涡旋5秒。由于细胞膨胀，低渗缓冲液将破坏质膜，而温和的去垢剂条件可用于溶解细胞质及内质网相关核糖体，同时不破坏核膜。</li>
	<li>在 4 °C 条件下，以 16,000 x g 离心裂解物 7 分钟，将上清液（约 500 µl）转移至新的预冷 1.5 ml 离心管中。使用分光光度计测定各样品在 260 nm 处的吸光度（OD），并保留 10% 裂解物作为输入样品，用于后续检测细胞质中 mRNA 的稳态水平。将输入样品用无 RNase 的 H2O，加入750 µl Trizol，并在液氮中速冻。</li>
	<li>将含有蔗糖梯度的超速离心管转移至预冷的转子套管中。从蔗糖梯度顶部移除500 µl。调整裂解液，使其在500 µl裂解缓冲液（见步骤2.5）中的OD值相同（260 nm处为10–20 OD），然后将裂解液加样至各蔗糖梯度上。 
	注意：裂解物应立即上样至梯度液中，这将显著提高多聚核糖体制备的质量。</li>
	<li>在超速离心前，称重并平衡每个梯度。</li>
	<li>在4 °C条件下，使用SW41Ti转子以222,228 × g（36,000 rpm）离心2小时。 
	注意：为避免破坏蔗糖梯度，应选择“低”档刹车。</li>
</ol>
3. 多聚核糖体分级分离与RNA提取
<ol>
	<li>使用含有RNase ZAP的温热无RNA酶水（喷洒数次）清洁馏分收集器。随后仅用温热的无RNA酶水重复此步骤。打开紫外灯，并等待绿灯亮起。</li>
	<li>小心地从转子中取出离心管并置于冰上。开启计算机、泵、紫外检测器和馏分收集器。将泵流速设为3 ml/min，并用洗脱液[含0.02% (w/v) 溴酚蓝的60% (w/v) 蔗糖溶液]冲洗管路，直至液体到达针头处。确保至少有一滴液体从针头滴出，并确认泵的注射器或管路中未引入气泡。</li>
	<li>在馏分收集器中放置2 ml收集管。启动分析程序，将灵敏度设为±10 mEV，将“timebase”设为100秒。</li>
	<li>将每个超速离心管小心放入紫外检测器中，确保其处于正交位置。通过旋转样品架下方的旋钮，用针头刺穿离心管。</li>
	<li>将泵流速设为1.5 ml/min，并在馏分收集器上设置每管收集时间为30秒（每管约收集750 μl）。将泵切换至“远程控制模式”，同时启动泵和馏分收集器，并同步使用DAQ tracer开始记录。此时蔗糖梯度将向上移动，同时在254 nm波长下实时检测紫外吸光度。一旦洗脱液的第一滴落入2 ml收集管中，立即停止收集。</li>
	<li>将记录数据保存为.csv格式，并在完成步骤3.7后，在电子表格软件中执行以下操作以确定各馏分在紫外吸光度图谱中的位置：
	<ol>
		<li>选择包含254 nm吸光度值（通道0）的数据列。</li>
		<li>创建吸光度值的平滑连线散点图。</li>
		<li>将X轴主单位设为300（该数值由5%-50%蔗糖梯度总体积（约12 ml）除以每管收集时间（30秒）得出）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>向每管馏分中加入750 µl Trizol试剂，并用液氮速冻保存。</li>
	<li>根据制造商说明书，使用Trizol法分离多聚核糖体结合型RNA和胞质RNA（来自步骤2.6）。为提高RNA得率，建议在-80 °C沉淀30分钟，或在-20 °C过夜沉淀。 
	注意：由于多聚核糖体组分中沉淀出的RNA量可能不明显，建议添加载体RNA。在Trizol法的RNA沉淀步骤前，向每管中加入1 μl载体RNA。</li>
	<li>确定哪些馏分对应于与&#62;3个核糖体结合的mRNA（使用步骤3.6所述方法），并将这些馏分合并。使用RNA纯化试剂盒对合并后的多聚核糖体结合RNA和胞质RNA（来自步骤2.6）进行纯化。将样品送至测序平台，利用微阵列或深度测序技术检测全基因组mRNA水平。 
	若需通过RT-qPCR监测特定mRNA的翻译情况，建议使用500 ng RNA（来自合并的含&#62;3个核糖体的馏分或总RNA）进行cDNA合成。 
	注意：将与&#62;3个核糖体结合的mRNA任意定义为高效翻译的mRNA，其包含超过80%新合成的多肽链28,29。同时包括轻度（1–2）、中度（2–3）和重度多聚核糖体&#160;（&#62;3）组分可能更有优势，但这会使样本数量增加一倍（每条件4个 vs 2个），从而提高实验成本。尽管预计未来深度测序和微阵列分析的成本将下降，从而更有利于采用全面分析策略，但在验证阶段，仍建议监测各个mRNA在每一馏分中的分布情况。</li>
</ol>
4. mRNA翻译的全基因组分析
<ol>
	<li>安装 R、Bioconductor 和 anota 软件包：
	<ol>
		<li>安装 R（从 r-project.org 下载）并启动 R 会话。 
		注意：R 可用于所有操作系统，anota 可在所有系统上运行。</li>
		<li>安装 Bioconductor（bioconductor.org）。R 代码通过 R 终端进行解释执行。例如 Windows 中通过双击 R 快捷方式启动的 R 控制台）。在 R 终端中输入以下命令以安装 Bioconductor： 
		 
		来源&#34;http://bioconductor.org/biocLite.R&#34;) 
		 
		biocLite() 
		&#160;</li>
		<li>在 R 终端中输入以下命令以安装 anota bioconductor 软件包（以及 anota 所需的 qvalue 软件包）： 
		 
		来源&#34;http://bioconductor.org/biocLite.R&#34;) 
		 
		biocLite(c("anota", "qvalue"))</li>
		<li>测试软件包是否成功安装，并通过在R终端中输入以下命令打开anota手册： 
		 
		library("anota") 
		 
		小节（“anota”） 
		&#160;</li>
		<li>注意：anota 软件包中所有函数的更多帮助信息可通过 anota 网页（http://www.bioconductor.org/packages/release/bioc/html/anota.html）或在 R 中使用帮助函数获取。例如，若要获取 anotaPerformQc 函数的帮助，请进入 R 终端并输入以下命令（注意：仅在已加载 anota 软件包时此操作才有效）： 
		 
		library("anota") # 加载 anota 软件包 
		 
		?anotaPerformQc #此函数的帮助文档 
		&#160;</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将数据导入 R：
	<ol>
		<li>为分析准备表达数据。数据应进行预处理（例如 标准化并经过质量控制）的数据，需根据测量mRNA水平所用的技术进行处理。输入值必须进行对数转换，最常用的是log2转换。为所有多聚核糖体相关RNA样本创建一个数据表，为所有胞质RNA样本创建另一个数据表。第一列应包含基因标识符，随后每一列对应一个样本的数据；第一行应包含样本名称。关键要求是两个表格中的样本顺序和基因顺序必须完全一致。将文件保存为制表符分隔的文本文件，分别命名为“myPolysomeData.txt”和“myCytosolicData.txt”。</li>
		<li>在此示例中，使用了两个样本类别（对照或疾病），每类包含3个重复，从而在 myCytosolicData.txt 和 myPolysomeData.txt 文件中均生成6个样本，顺序为：C1、C2、C3、D1、D2、D3。当存在两个样本类别时，Anota 要求每个条件至少有3个重复，且应为独立的生物学重复。</li>
		<li>创建一个包含数据输入文件（myPolysomeData.txt 和 myCytosolicData.txt）的目录。从此目录中启动 R。在 Windows/Mac 系统中，可通过将 R 快捷方式复制到此目录，并使用该快捷方式启动 R（也可通过下拉菜单更改工作目录）。</li>
		<li>在新创建的目录中新建一个名为 myCode.R 的文件，并使用文本编辑软件打开该文件。在此文件中编写代码。</li>
		<li>将数据加载到 R 中，需将以下代码写入 myCode.R 文件（每次添加代码后请记得重新保存该文件）。下文将逐步解释该代码，但也可先一次性写入全部代码，随后仅使用一次 source 函数（用于运行代码，见下文）： 
		 
		## 加载 anota 库 
		 
		library(anota) 
		 
		##将输入数据加载到 R 中 
		 
		dataCyto &#60;- as.matrix(read.table(“myCytosolicData.txt”, header=TRUE, row.names=1, sep=”\t”)) 
		 
		dataPoly &#60;- as.matrix(read.table(“myPolysomeData.txt”, header=TRUE, row.names=1, sep=”\t”)) 
		&#160;</li>
		<li>在R终端中直接输入代码来运行： 
		 
		source("myCode.R") 
		&#160;</li>
		<li>通过在R终端中输入以下命令，检查数据是否成功加载： 
		head(dataCyto) #将显示 dataCyto 表格的前几行 
		head(dataPoly) 
		&#160;</li>
	</ol>
	</li>
	<li>差异翻译基因的鉴定：
	<ol>
		<li>生成一个描述样本类别的向量（向量是 R 中的一种对象类型）。该向量应反映 myPolysomeData.txt 和 myCytosolicData.txt 中的样本顺序，以确保这三个对象的样本顺序完全一致。该向量将在指示 anota 比较哪些样本时使用。将以下内容添加到 myCode.R 文件中： 
		 
		##注意，重复样本具有相同的样本类别 
		 
		##描述 (即 “C”或“D”）在此载体中。 
		 
		myPhenotypes &#60;- c（“C”，“C”，“C”，“D”，“D”，“D”） 
		&#160;</li>
		<li>对数据集进行质量控制。在使用 anota 进行分析之前，需要评估多项质量指标。这些指标在 anota 手册中有详细讨论。将以下代码添加到 myCode.R 文件中并保存： 
		 
		anotaQcOut &#60;- anotaPerformQc(dataT=dataCyto, dataP=dataPoly, phenoVec=myPhenotypes) 
		 
		anotaResidOut &#60;- anotaResidOutlierTest(anotaQcObj=anotaQcOut) 
		&#160;</li>
		<li>在 R 终端中输入以下代码来运行： 
		 
		source("myCode.R") 
		 
		这将生成多个输出文件，可按照 anota 手册中的说明进行检查。 
		&#160;</li>
		<li>鉴定差异翻译的基因。样本将根据提供给“phenoVec”参数的名称的字母顺序进行比较即 “myPhenotypes”向量），除非用户通过“contrasts”参数另行指定。将以下代码添加到myCode.R文件中，并按照上述方法在R终端中使用“source”命令执行： 
		 
		anotaSigOut &#60;- anotaGetSigGenes(dataT=dataCyto, dataP=dataPoly, phenoVec=myPhenotypes, anotaQcObj=anotaQcOut)</li>
		<li>使用 anotaGetSigGenes 的帮助文档来了解输出的格式，并通过在 R 终端中输入以下命令查看如何选择要比较的样本类别： 
		 
		?anotaGetSigGenes 
		&#160;</li>
		<li>过滤并绘制差异翻译的基因。在 anotaPlotSigGenes 函数中可应用多种阈值，使用 help 功能可简化这些阈值的自定义组合。为筛选出分析可靠的基因，应采用 minSlope（-0.5）、maxSlope（1.5）和 slopeP（0.01）的设置。 
		注意：此外，适用于RVM的设置23,26,30 错误发现率（FDR）（0.15）和倍数变化（log2[1.5]）可能 例如 可用于鉴定差异翻译的基因。“selDeltaPT”等其他筛选条件可用于更严格的过滤例如 将 selDeltaPT 设置为 log2[1.5]。还必须指定要筛选的比较（使用 selCont 参数）。通过在 myCode.R 文件中添加以下代码行来应用上述设置： 
		 
		anotaSigFiltered &#60;- anotaPlotSigGenes(anotaSigObj=anotaSigOut, selContr=1, minSlope=(-0.5), maxSlope=1.5, slopeP=0.01, maxRvmPAdj=0.15, minEff=log2(1.5), selDeltaPT=log2(1.5)) 
		&#160;</li>
		<li>使用上述从R端开始的源函数进行分析。该过程将同时生成图形化输出。检查此输出结果是评估分析性能并确定是否需要调整参数设置的良好起点。</li>
		<li>生成输出表格。将以下代码添加到 myCode.R 文件中： 
		 
		write.table(anotaSigFiltered$selectedRvmData, file="MySignificantGenes.txt", sep="\t") 
		&#160;</li>
		<li>在R终端中使用source函数运行代码。结果表格中的各列含义详见anotaPlotSigGenes函数的帮助文档。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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</ol>

作者声明不存在竞争性财务利益。

本文介绍了一种成熟的多聚核糖体分级分离方案，随后采用本实验室开发的分析方法，在哺乳动物细胞中全基因组范围内捕获翻译活性的定性与定量变化。为成功完成本方案，需特别注意以下几点：1）细胞汇合度（细胞增殖速率和营养物质的可及性与mRNA翻译活性相关，并可能影响翻译组的组成，因此在不同重复实验和实验条件下应保持细胞汇合度一致）；2）快速裂解细胞（尽管裂解缓冲液中含有环己酰亚胺和RNase抑制剂，仍应迅速完成细胞裂解，并在裂解后立即将细胞提取物上样至蔗糖梯度中，以防止RNA降解和多聚核糖体解离）；&#160;3）梯度制备（为确保数据的高度可重复性，应使用梯度混合器制备蔗糖梯度，并在操作过程中格外小心）。
除了研究翻译活性的变化外，本方案还可用于分离核糖体相关蛋白复合物并确定其生理功能。为此，可通过三氯乙酸（TCA）沉淀后进行蛋白质印迹（Western blotting），检测多种核糖体相关蛋白的表达水平及其磷酸化状态；而核糖体相关蛋白复合物则可从梯度组分中通过免疫沉淀获得，并进一步通过蛋白质印迹或质谱分析进行鉴定。该技术的一个局限性在于，缓慢的梯度分离方法可能导致即使紧密结合的蛋白发生解离，特别是那些结合动力学处于快速结合/解离状态的蛋白，新合成的多肽链相关因子即为典型例子。利用化学交联剂（如3,3´-二硫代双[磺基琥珀酰亚胺基丙酸]（DTSSP）31），可将从核糖体上 emerging 的新合成多肽链固定在与核糖体相关的蛋白复合物上。该方法揭示了活化蛋白激酶C受体1（RACK1）/c-Jun氨基末端激酶（JNK）/真核翻译延伸因子1A2（eEF1A2）复合物可调控应激条件下新合成多肽链的降解过程27。此外，类似方法已被用于研究蛋白激酶C bII（PKCbII）通过RACK1被招募至核糖体32，以及mTOR复合物2（mTORC2）在核糖体上被激活，进而磷酸化新合成的AKT多肽链并调控其稳定性的过程33,34。
多核糖体分级分离方法结合anota分析的主要局限性包括：1）需要相对大量的细胞（约15 × 106个细胞），2）无法提供核糖体在特定mRNA分子上所处位置的信息，以及3）正常组织与肿瘤组织在细胞和分子水平上的异质性所带来的问题。关于所需细胞数量的问题，可通过将细胞数量有限的样本中对应于单体核糖体（80S）的吸光度光谱峰，与高丰度细胞（例如 HeLa细胞）获得的光谱峰进行比对来解决35。核糖体谱分析技术（见下文）可用于确定核糖体在特定mRNA分子上的精确位置；而关于组织异质性对来自人类组织等复杂系统中基因表达变化解读所造成的混杂效应问题，Leek和Storey的出版物中已进行了详细讨论36。
最近开发出一种新的核糖体图谱技术，该技术通过RNAse I处理产生核糖体保护片段（RPFs），并利用深度测序进行分析22。该技术能够以单核苷酸分辨率确定核糖体的位置，从而前所未有地深入揭示核糖体生物学的细节。例如，核糖体图谱可用于测定特定mRNA分子上的核糖体密度，或鉴定影响翻译起始速率的元件，如替代性起始位点、非AUG密码子的起始以及上游开放阅读框（uORFs）等调控元件。然而，该技术存在若干方法学上的局限性，限制了其准确估算mRNA翻译效率的能力。这些局限性包括由随机片段化和RNAse I消化引入的独立偏差、翻译抑制剂（例如，延长抑制剂如emetine和环己酰亚胺）可能诱导核糖体在翻译起始位点积累而引入的偏差、与翻译效率（TE）评分相关的大量假阳性与假阴性结果，以及其在预测来源于蛋白质编码mRNA的测序读段时的不准确性37。或许最重要的是，尽管核糖体图谱能够直接确定核糖体在特定mRNA分子上的位置，但与特定mRNA结合的核糖体数量则是通过将RPFs（核糖体结合的mRNA）中读段频率归一化至随机片段化mRNA（总mRNA）中观察到的频率间接估算的。例如，在一个简单的情境中，四个“B”型mRNA分子（Ba、Bb、Bc和Bd）分别在位置1、2、3和4上各结合一个核糖体，核糖体图谱技术的固有缺陷将无法区分以下两种情况：一种是所有4个核糖体仅结合于Ba mRNA的1、2、3和4位点；另一种是Ba、Bb、Bc和Bd mRNA各自在1、2、3和4位点分别结合一个核糖体。相比之下，在多核糖体分级分离过程中，多核糖体的完整性得以保持，从而可分离出与特定数量核糖体结合的mRNA组分（图1）。这一多核糖体分级分离与核糖体图谱之间的关键区别表明，前者可用于直接比较mRNP、轻量级和重量级多核糖体组分中的mRNA，而后者则可能无法捕捉由mRNA从轻量级向重量级多核糖体转移所引起的转译组变化，同时会高估那些从mRNP组分转移至重量级多核糖体的mRNA的贡献。上述两种方法之间差异的生物学意义已得到大量数据的支持，这些数据显示，某些mRNA亚群（如对eIF4E敏感的mRNA）在翻译激活时会从轻量级多核糖体向重量级多核糖体转移，而另一些mRNA（如含有5’TOP元件的mRNA）则直接从无核糖体结合的mRNA池中被招募至重量级多核糖体6。有趣的是，mTOR通路已被证明可同时调控“eIF4E敏感”mRNA和5’TOP mRNA的翻译11。因此，上述讨论的方法学差异可能解释了使用核糖体图谱38,39与多核糖体分级分离24评估mTOR抑制对转译组影响的研究之间结论明显不一致的原因。
综上所述，多聚核糖体分级分离和核糖体谱分析是两种互补的方法，分别主要提供与mRNA结合的核糖体数量以及核糖体在mRNA上所处位置的信息。重要的是，尽管这两种方法各有优缺点，仍必须对两种实验所获得的全基因组数据进行充分的分析，并在功能和生物化学层面加以验证。

在过去的二十年中，控制基因表达的调控网络得到了广泛研究。这些研究绝大多数集中在转录调控上，即通过全基因组范围内稳态mRNA水平的变化来确定所谓的“基因表达”谱型。近期研究表明，稳态mRNA水平与蛋白质组的组成仅有较弱的关联1,2，这表明转录后调控机制（包括mRNA翻译）在基因表达调控中起着重要作用3,4。事实上，据估计在永生化的小鼠成纤维细胞中，约50%的蛋白质水平是由mRNA翻译水平决定的5。
mRNA 翻译是一个高度调控的过程，在此过程中，mRNA 通过核糖体、转运 RNA（tRNA）以及通常被称为翻译因子（TFs）的辅助因子协同作用被翻译成蛋白质6。蛋白质合成是哺乳动物细胞中耗能最多的生物学过程7，因此，全局 mRNA 翻译速率会根据营养物质的可利用性和细胞增殖速率进行相应调整8。除了全局 mRNA 翻译速率的变化外，多种胞外刺激（例如激素和生长因子）、胞内信号（例如氨基酸水平）以及不同类型的压力（例如内质网应激）也会诱导正在翻译的 mRNA 群体（即翻译组，translatome）发生选择性改变6。&#160;根据刺激类型的不同，部分而非全部 mRNA 的翻译活性会受到显著影响，从而导致蛋白质组发生改变，以实现快速的细胞应答6。这些翻译组在质和量上的变化被认为是由反式作用因子（例如翻译机器的组分、辅助因子或 miRNA）与特定 mRNA 子集中存在的顺式作用元件（RNA 元件或特征）之间相互作用所介导的6,9。例如，限速性翻译起始因子 eIF4E 和 eIF2 的水平和/或活性变化，会基于特定的 5’非翻译区（5’UTR）特征选择性地调节转录本的翻译6。eIF4E 和 eIF2 分别负责将 mRNA 和起始 tRNA 招募至核糖体6。eIF4E 活性的升高会选择性增强含有长且高度结构化 5’UTR 的 mRNA 的翻译，这些 mRNA 编码促进增殖和存活的蛋白质，如周期蛋白（cyclins）、c-myc 和 Bcl-xL10。相反，eIF2 的失活会导致全局蛋白质合成关闭，同时选择性地上调那些在其 5’UTR 中含有短的抑制性上游开放阅读框（uORFs）的 mRNA 的翻译，例如编码未折叠蛋白反应主要转录调控因子的 mRNA（例如 ATF4）。在营养物质、生长因子和激素等多种刺激下，雷帕霉素的机械/哺乳动物靶点（mTOR）通路通过使翻译抑制蛋白 4E-BP 家族失活来促进 eIF4E 活性，而 MAPK 通路则直接磷酸化 eIF4E6,11。相反，eIF2α 激酶（即 PERK、PKR、HRI 和 GCN2）在营养缺乏、内质网应激和病毒感染时通过磷酸化 eIF2 的调节亚基 eIF2α 来抑制 eIF2 活性6,12。在多种病理状态下，包括癌症、代谢综合征、神经和精神障碍以及肾脏和心血管疾病中，均已观察到翻译因子（TFs）、翻译机器其他组分以及包括 miRNA 在内的调控因子的活性和/或表达发生改变13-19。综上所述，这些数据表明翻译机制在维持细胞稳态中发挥关键作用，其功能异常在多种人类疾病的发病机制中起着核心作用。
本文描述了一种通过蔗糖密度梯度离心法对哺乳动物细胞中多聚核糖体进行分级分离的实验方案，该方法可用于分离多聚核糖体、单体核糖体、核糖体亚基以及信使核糖核蛋白颗粒（mRNPs）。该技术能够区分高效翻译的mRNA（与重多聚核糖体结合）和低效翻译的mRNA（与轻多聚核糖体结合）。在本实验中，使用环己酰亚胺20等翻译延伸抑制剂将核糖体固定在mRNA上，然后通过超速离心将细胞质提取物在5–50%的线性蔗糖密度梯度中进行分离。随后对蔗糖梯度进行分级收集，可根据mRNA结合的核糖体数量对其进行分离。从各组分中提取的RNA可用于分析不同条件下mRNA在梯度中分布的变化情况，其中翻译效率从梯度顶部到底部逐渐升高。各组分中mRNA的水平可通过Northern印迹或定量反转录聚合酶链式反应（qRT-PCR）进行检测。
或者，可收集含有重多核糖体（通常指超过3个核糖体）的组分，并利用微阵列或深度测序技术测定全基因组范围内与多核糖体结合的mRNA水平。必须特别强调的是，多核糖体结合mRNA的水平不仅受翻译过程的影响，还受到转录及转录后机制的调控，这些机制会影响细胞质中mRNA的总体水平21。因此，若要利用全基因组多核糖体结合mRNA数据来确定翻译水平的差异，必须校正基因表达通路中翻译上游步骤所带来的影响21。为实现这一校正，需从每个样本中平行制备细胞质RNA和多核糖体结合RNA，并测定全基因组范围内的稳态mRNA水平21。目前，常使用所谓的“翻译效率”（TE）评分（i.e. 多核糖体结合mRNA数据与细胞质mRNA数据之间的对数比值）来校正细胞质mRNA&#160;水平变化对特定mRNA翻译效率的影响22。然而，由于TE评分存在一种被称为伪相关的数学特性，使用TE评分识别差异翻译会导致大量假阳性和假阴性结果27。事实上，对多个实验室数据集的调查表明，在分析转译组变化时，此类伪相关似乎是不可避免的23。这促使了“差异翻译分析”（anota）算法的开发，该算法克服了上述缺陷23。在anota分析过程中，采用回归模型推导出独立于细胞质RNA水平的翻译活性指标。随后在不同条件下比较这些指标并计算统计显著性。用户可选择应用方差压缩方法，以提高统计效能，并减少重复数较少的研究中假阳性结果的出现24。值得注意的是，最近的研究表明，anota检测到的转译组扰动与蛋白质组的变化相关，而TE评分则无此相关性25。因此，强烈推荐在全基因组范围内识别翻译变化时采用anota分析方法。尽管anota算法的理论基础已在先前研究中被详细讨论21,23,26，本文重点在于如何在实践中应用该方法。
除了研究细胞中 mRNA 翻译活性的变化外，该核糖体分级分离方案还可用于分离并从生物化学和功能角度表征与核糖体及多聚核糖体相关的蛋白质复合物。该方法此前已成功用于鉴定调控新合成多肽链稳定性的复合物27，以及参与翻译机制组分磷酸化的复合物。本文也将简要讨论多聚核糖体分级分离方法在这一方面的应用。

<table><tbody><tr><td>HEPES</td><td>Biobasic</td><td>HB0264</td><td></td></tr><tr><td>MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma</td><td>M8266</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>VWR</td><td>CABDH4532</td><td></td></tr><tr><td>二硫苏糖醇（DTT）</td><td>Biobasic</td><td>DB0058</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>Biobasic</td><td>TB0196</td><td></td></tr><tr><td>糖蓝（Glycoblue）</td><td>Ambion</td><td>AM9515</td><td>RNA沉淀载体</td></tr><tr><td>脱氧胆酸钠&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>D6750</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>X100</td><td></td></tr><tr><td>放线菌酮（Cycloheximide）</td><td>Sigma</td><td>C1988</td><td></td></tr><tr><td>蛋白酶抑制剂混合物&amp;nbsp;</td><td>Roche</td><td>04693132001</td><td>片剂（无EDTA）</td></tr><tr><td>RNase抑制剂&amp;nbsp;</td><td>Promega</td><td>N2515</td><td></td></tr><tr><td>0.45 &amp;micro;m 过滤系统 150 ml</td><td>Corning</td><td>431155</td><td></td></tr><tr><td>蔗糖</td><td>Sigma</td><td>S0389</td><td></td></tr><tr><td>RNeasy MinElute 纯化试剂盒&amp;nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>74204</td><td>RNA纯化试剂盒</td></tr><tr><td>薄壁聚碳酸酯超速离心管&amp;nbsp;</td><td>Beckman Coulter</td><td>331372</td><td></td></tr><tr><td>SW41Ti 转子套装（含配件）</td><td>Beckman Coulter</td><td>331336</td><td></td></tr><tr><td>Optima L100 XP 超速离心机</td><td>Beckman Coulter</td><td>DS-9340A</td><td></td></tr><tr><td>ISCO 馏分收集器&amp;nbsp;</td><td>Brandel</td><td>FC-176-R1</td><td></td></tr><tr><td>II型检测器配图表记录仪</td><td>Brandel</td><td>UA-6</td><td>紫外检测器</td></tr><tr><td>带流通池和注射泵的穿刺管装置</td><td>Brandel</td><td>BR-A86-5</td><td></td></tr><tr><td>UA-6 检测器电缆</td><td>Brandel</td><td>60-1020-211</td><td></td></tr><tr><td>FC-176 通信电缆</td><td>Brandel</td><td>FCC-176</td><td></td></tr><tr><td>梯度生成主控单元</td><td>Biocomp</td><td>108-1</td><td>梯度生成仪</td></tr><tr><td>梯度形成附件</td><td>Biocomp</td><td>105-914A-1R</td><td>梯度生成仪附件</td></tr><tr><td>Measurement Computing 8通道 50 kHz 数据采集设备</td><td>MicroDAQ</td><td>USB-1208FS</td><td>分析软件附件</td></tr><tr><td>Measurement Computing 数据采集软件</td><td>MicroDAQ</td><td>TracerDAQ Pro</td><td>分析软件（仅下载）</td></tr><tr><td>蔗糖梯度用10倍缓冲液：</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>200 mM HEPES (pH 7.6)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1 M KCl</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>50 mM MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>100 &amp;micro;g/ml 放线菌酮</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1倍蛋白酶抑制剂混合物（无EDTA）</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>100 单位/ml RNase抑制剂</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>裂解缓冲液</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>5 mM Tris-HCl (pH 7.5)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2.5 mM MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1.5 mM KCl&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1倍蛋白酶抑制剂混合物（无EDTA）]</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>然后根据正文说明加入放线菌酮（CHX）、DTT、RNase抑制剂、Triton和脱氧胆酸钠</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

多聚核糖体分级分离及哺乳动物转译组的全基因组规模分析

Polysome Fractionation and Analysis of Mammalian Translatomes on a Genome-wide Scale

mRNA 翻译在基因表达调控中起着核心作用，是哺乳动物细胞中能量消耗最多的过程。因此，mRNA 翻译的失调被认为在多种病理状态（包括癌症）中发挥重要作用。核糖体还结合有分子伴侣，这些伴侣可促进新生多肽链的折叠，从而调节新合成多肽的功能与稳定性。此外，越来越多的研究表明，核糖体可作为多种信号分子的平台，这些分子参与新合成多肽从核糖体 emerging 时发生的多种翻译后修饰，以及翻译机器组分的调控。本文介绍了一种成熟的核糖体分级分离方法——蔗糖密度梯度离心法。结合本实验室开发的“anota”算法，该方法可实现全基因组范围内对单个 mRNA 差异翻译的直接测定。此外，这一多功能方案还可用于多种生化研究，旨在解析与核糖体相关的蛋白质复合物的功能，包括那些在新合成多肽折叠与降解过程中起核心作用的复合物。

mTOR 是细胞网络中的一个关键节点，可协调整体蛋白质合成速率与营养物质的可利用性19。mRNA 翻译主要在限速的起始阶段受到调控6。核糖体参与多聚核糖体（polysomes）的比例与翻译起始速率呈正相关28。本文展示了一个应用多聚核糖体分离技术研究 mTOR 信号通路在介导胰岛素对 mRNA 翻译作用中的实例。为此，将 MCF7 人乳腺癌细胞维持在低血清培养基中，随后单独使用胰岛素刺激，或联合使用胰岛素与活性位点 mTOR 抑制剂 Torin1 进行刺激。未受刺激、持续培养在低血清条件下的细胞作为对照。采用多聚核糖体分离方法分离 mRNA-核糖核蛋白复合物（mRNPs）、单体核糖体（80S）及多聚核糖体组分。与对照组细胞相比，胰岛素处理导致对应于多聚核糖体的梯度组分吸光度升高，同时伴随单体核糖体组分吸光度的相应降低（图 1）。这些结果表明，在胰岛素处理的细胞中，参与多聚核糖体的核糖体比例高于对照组细胞，因此提示胰岛素如预期般促进了整体翻译起始速率。Torin1 可逆转胰岛素对吸光度分布图的影响（图 1），从而进一步证实 mTOR 信号通路在介导胰岛素对翻译机制作用中具有重要作用19。
基于梯度制备过程中不一致性无法避免这一原则，人们已对多聚核糖体分级分离方法所获得数据的可重复性提出了质疑22。为了实证检验这一潜在的不利问题，从经胰岛素单独处理或胰岛素联合Torin1处理的MCF7细胞中分离了胞质组分及与重多聚核糖体结合的RNA（与4个或更多核糖体结合的mRNA），共包含4个独立的生物学重复实验（图2）。采用微阵列方法在全基因组范围内确定了每个重复实验中胰岛素和Torin1对胞质及重多聚核糖体结合mRNA组成的影响。为评估多聚核糖体分级分离方法的可重复性，进行了主成分分析（PCA）。该分析显示，属于同一实验条件的样本在前两个主成分中紧密聚集，而不同实验条件之间则明显分离（图2）。这些结果表明，本文所述的多聚核糖体分级分离方法具有高度可重复性，因此适用于在全基因组水平上研究翻译过程的定性和定量变化。
<img alt="色谱结果图；紫外吸收值与组分编号；蛋白质分离分析。" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51455/51455fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51455/51455fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 1"> 
图 1. 多聚核糖体图谱显示血清饥饿、胰岛素及 mTOR 信号通路对 MCF7 细胞中全局翻译的影响。 MCF7 细胞在低营养条件下（维持于 0.1% FBS 培养基中）培养 16 小时后，分别用 5 nM 胰岛素（Ins）单独处理，或联合 250 nM Torin1 处理（Ins + Torin1），持续 4 小时。持续处于低营养状态（0.1% FBS）且未经任何处理的细胞作为对照。相应的细胞质提取物通过 5–50% 蔗糖梯度离心沉降。图中所示为游离核糖体亚基（40S 和 60S）、单体核糖体（80S）以及多聚核糖体组分中的核糖体数量。
<img alt="主成分分析（PCA）得分图，基于成分轴的数据聚类，统计方法。" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51455/51455fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51455/51455fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 2"> 
图 2. 通过多聚核糖体分析获得的全基因组数据具有高度可重复性。 对 MCF7 细胞的处理方式同 图 1。从 4 个独立的生物学重复样本中分别提取胞质和与多聚核糖体结合的 RNA（>3 个核糖体），并使用 GeneTitan 芯片（Affymetrix）测定其全基因组 mRNA 水平。采用主成分分析（PCA）评估所得数据的可重复性。图中显示了所有处理组（T1 = Torin 1；ctrl = 对照；Ins = 胰岛素）、RNA 来源（C = 胞质；P = 多聚核糖体结合）及重复样本的前两个主成分。相同条件和 RNA 来源的样本位置相近，表明数据具有高度可重复性。

核糖体在蛋白质合成中起着核心作用。通过蔗糖密度梯度离心法对多核糖体（多聚体）进行分级分离，可直接在全基因组范围内测定各个mRNA的翻译效率。此外，该方法还可用于对与核糖体和多核糖体相关的分子（如分子伴侣和信号分子）进行生物化学分析。

mRNA翻译在基因表达调控中起着核心作用，是哺乳动物细胞中能量消耗最大的过程。

以下实验的总体目标是分离正在翻译的核糖体多聚体，以研究细胞内 mRNA 翻译活性的变化。首先，在培养基中加入环己酰亚胺，使核糖体在 mRNA 上固定，从而防止核糖体脱离；第二步，从细胞中提取核糖体，并通过蔗糖密度梯度离心法根据其密度进行分离，以定量并分离游离核糖体亚基（40 s 和 60 s）、单体核糖体（monosome）以及正在翻译的核糖体多聚体（polysome）。随后可从蔗糖组分中提取RNA或蛋白质，以分别分析mRNA和蛋白质在前多聚体和多聚体组分中的丰度。实验结果可揭示mRNA翻译的定性和定量变化，这些变化可通过微阵列或新一代RNA测序技术在全基因组水平上进行检测，并利用NoDa算法进行分析。核糖体谱分析（poison profiling）方法可用于研究转录后水平基因表达调控中的关键问题，例如在全基因组范围内监测mRNA翻译的变化，以及蛋白质与核糖体和多聚体的结合情况。本实验室的研究助理 Valentina Gand 将演示该技术。首先，用去离子蒸馏水配制 100 毫升 60%（质量/体积）的蔗糖溶液，然后通过 0.22 微米滤膜过滤该溶液。接下来，将 60% 蔗糖溶液用一倍蔗糖梯度缓冲液稀释，分别配制 40 毫升的 5% 和 50% 蔗糖溶液。使用梯度装置附带的标记块，在六根聚丙烯超速离心管上标记半满刻度点。然后使用分层装置将5%蔗糖溶液加至管子半满刻度处。接着，将50%蔗糖溶液加至管底，直至两种溶液的界面达到半满刻度处。用速率区带离心专用帽密封离心管，并将密封后的离心管放入梯度制备仪的试管架中。启动梯度制备仪以形成从5%到50%的线性梯度。梯度制备仪以较大的倾斜角度高速旋转离心管，可在数分钟内形成六条线性梯度。实验当天，细胞应达到约80%融合度。使用含100微克/毫升环己酰亚胺的生长培养基处理细胞，在37摄氏度、5%二氧化碳条件下孵育5分钟。用10毫升含100微克/毫升环己酰亚胺的冰冻PBS溶液洗涤细胞两次，然后加入额外5毫升冰冻PBS溶液。刮取细胞并将细胞悬液转移至50毫升离心管中，在4°C下以200 × g离心5分钟。弃去上清液，将细胞重悬于425微升低渗裂解缓冲液中。随后，向细胞悬液中加入5微升10毫克/毫升的环己酰亚胺、1微升1摩尔的DTT以及100单位的RNase抑制剂。然后将溶液涡旋振荡5秒。向细胞悬液中加入25 µL 10% Triton X 和125 µL 10% 脱氧胆酸钠，再涡旋振荡额外5秒。接下来，在4°C条件下，以16,000 × g离心7分钟。将上清液转移至新的预冷的1.5毫升离心管中，并保留10%的裂解液作为对照，用于检测稳态MR.mRNA水平。测定每个裂解液样品在260纳米处的OD值，然后用低渗裂解缓冲液将各样品调整至相同的OD值，终体积为500微升。从蔗糖梯度顶部移除500微升液体，然后将调整后的裂解液样品加在每个梯度的上方。接下来，称重并平衡每根密度梯度管。将试管放入SW 41 TI转子中，并将超速离心机调至低刹车模式。然后在4°C条件下，以222,228 × g离心2小时。超速离心结束后，小心地从转子中取出梯度管，并将其放置在冰上。首先，用2毫升收集管装满组分收集器。然后在收集组分前半小时，打开计算机、泵、紫外检测器和组分收集器。将泵的流速设置为每分钟三毫升，然后用冲洗液填充管路以排除系统中的空气。让冲洗液流经管路，直至针头末端有液滴滴出。打开分析软件。然后将灵敏度设置为正负10毫电子伏特，时间基准设置为100秒。将超速离心管放入紫外检测器中，并确保管子处于正交位置。接着，旋转管架下方的旋钮，使针头刺穿离心管。将泵的流速调节至1.5毫升每分钟，并设置馏分收集器每30秒收集一次馏分，即每管750微升。将泵置于远程控制模式。然后同时启动泵和馏分收集器，并开始使用DAQ示踪系统进行记录。当洗脱液的第一滴落入收集管时，停止泵和DAQ示踪剂。同时，向每份收集到的组分中加入750微升三醇并迅速混合。用液氮速冻各组分。然后按照制造商的说明，从样品中分离与多聚核糖体结合的RNA以及胞质RNA。采用多聚核糖体分级分离技术，以评估经胰岛素处理的C7乳腺癌细胞的翻译活性。与对照细胞及经mTOR抑制剂Torin 1处理的细胞相比，胰岛素处理组的多聚核糖体比例有所增加。该结果表明，胰岛素可促进 mc seven 细胞中全局翻译起始速率。本研究采用胰岛素实验的四次独立重复试验结果，用于评估该多聚核糖体分级分离方法的可重复性。图中来自相同处理条件和RNA来源的样本位置相近，表明具有较高的可重复性。观看本视频后，您应充分掌握如何裂解细胞、制备蔗糖梯度，以及最终收集分级核糖体。该实验方案将使您能够在转录后水平分析基因表达。

polysome-fractionation-analysis-mammalian-translatomes-on-genome-wide

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科研

JoVE Journal

Biology

生物学

多聚核糖体分离和哺乳动物Translatomes分析在基因组范围内

本文介绍了一种从真核细胞中提取正在翻译的核糖体的实验方案。提取后，通过蔗糖梯度分级分离将核糖体分为单体核糖体和多聚核糖体，从而实现对不同核糖体群体的分析。因此，该方法是研究翻译调控的金标准。...

真核生物多聚核糖体图谱分析

本文介绍了一种用于分析真核细胞在应激条件下mRNA翻译起始变化的方法。该方法基于正在翻译的核糖体与非翻译核糖体在蔗糖梯度中沉降速度的差异进行分离。...

应激条件下通过多聚核糖体分析检测翻译起始

本方案介绍了多核糖体分级分离的关键改进方法，用于研究体内中枢神经系统（CNS）样本的翻译组。通过分离并比较总RNA与核糖体结合的RNA组分，可实现对翻译和转录调控的全局评估。...

in vivo 中通过多聚核糖体分级分离研究中枢神经系统翻译组

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稀有细胞群体的核糖体亲和纯化技术（TRAP-rc） 黑腹果蝇 胚胎

本方案描述了一种根据结合的核糖体数量从植物组织中提取和分级分离转录本的简便方法。该方法可用于全局评估翻译活性，并确定特定mRNA的翻译状态。...

一种简便的植物多聚核糖体分析方法

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利什曼原虫、人细胞和小鼠睾丸中的多聚核糖体分析

本文介绍了利用RiboTag系统从成年雄性小鼠特定生殖细胞群体中免疫沉淀核糖体及其结合RNA的方法。通过合理的杂交育种和严谨的免疫沉淀操作，可获得纯净且可重复的结果，从而揭示生殖细胞的翻译组特征，并有助于深入理解突变表型的作用机制。...

雄性小鼠生殖细胞中的RiboTag免疫沉淀

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利用多聚核糖体分析法研究小鼠发育大脑中的翻译过程

本实验方案描述了如何在不使用自动梯度生成仪或梯度分段收集系统的情况下，制备多聚核糖体图谱。...

无需梯度混合器或组分分离系统的多聚核糖体分析

本方案通过多聚核糖体分析，将与核糖体结合的转录组（即翻译组）分离为非多聚核糖体RNA和多聚核糖体RNA 拟南芥 通过蔗糖密度梯度离心法。该方法可检测热应激条件下翻译效率 拟南芥.

热应激条件下利用多聚核糖体图谱检测翻译效率

学习多聚核糖体分离技术，利用蔗糖密度梯度离心法分析哺乳动物细胞中的mRNA翻译活性。该方法可用于研究胰岛素等处理对乳腺癌细胞翻译效率的影响，实现基因组水平的翻译组学分析。

多聚核糖体分级分离及哺乳动物转译组的全基因组规模分析

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