多聚核糖体分离和哺乳动物Translatomes分析在基因组范围内

以下实验的总体目标是分离翻译核糖体多核糖体，以研究细胞中 mRNA 翻译活性的变化。这是通过在生长培养基中添加环六轴来实现的，以冻结 mRNA 上的核糖体，从而防止核糖体流失作为第二步。从细胞中提取核糖体，并通过蔗糖密度梯度离心根据其密度进行分离，以定量和分离游离核糖体亚基 40 s 和 60 s 单区 a DS，并翻译核糖体多核糖体。

接下来，可以从蔗糖级分中提取 RNA 或蛋白质，以便分别分析前体和多体级分中的 Mr NA 和蛋白质丰度。结果显示了 mRNA 翻译的定量和定性变化，可以使用微阵列或下一代 RNA 测序在全基因组水平上进行检查，并使用 NoDa 算法进行分析。毒物分析方法可用于解决转录后水平基因表达调控方面的主要问题，例如监测 mRNA 的变化、全基因组水平的翻译以及蛋白质与核糖体和多聚体的关联。

我们实验室的助理研究员 Valentina Gand 将演示这项技术首先，在去离子蒸馏水中制备 100 毫升每体积重量为 60% 的蔗糖溶液，然后通过 0.22 微米过滤器过滤溶液。接下来，在一种 X 蔗糖梯度缓冲液中稀释 60% 蔗糖溶液，制成 40 毫升 5% 和 50% 蔗糖溶液。使用梯度单元随附的标记块在 6 个 poly aamer 超速离心管上标记半满点。

然后使用分层装置将 5% 蔗糖溶液加入到半满点。接下来，将 50% 蔗糖溶液添加到试管底部，直到两种溶液的界面到达带有速率分区盖的半全点密封管，然后将密封管放入梯度制造器上的试管支架中。运行梯度生成器以获得从 5% 到 50% 的线性梯度梯度生成器以较高的倾斜角度旋转试管，在几分钟内形成六个线性梯度。

在实验当天，细胞应达到大约 80% 的汇合度。在生长培养基中用每毫升 100 微克的环六环离子处理细胞，并在 37 摄氏度和 5% 二氧化碳下孵育 5 分钟用 10 毫升含 100 微克/毫升环六环离子的冰冷 PBS 洗涤细胞两次。然后再加入 5 毫升冰冷的 PBS 溶液。

刮擦细胞，将细胞悬液转移至 50 毫升中，以 200 倍 G 的离心力在 4 摄氏度下离心细胞 5 分钟。然后弃去上清液，将细胞重悬于 425 μL 低渗裂解缓冲液中。接下来，向细胞悬液中加入 5 微升 10 毫克/毫升环六环、1 微升 1 摩尔 DTT 和 100 单位的 RNA 抑制剂。

然后将溶液涡旋 5 秒钟。在细胞悬液中补充 25 微升 10% tritton X 125 微升 10% 脱氧钠涂层，然后再涡旋 5 秒。接下来，将裂解物在 4 摄氏度下以 16， 000 倍 G 离心 7 分钟。

将超级 natin 转移到新的预冷 1.5 ml 试管中，并保存 10% 的裂解物作为对照，以测量稳态 MR.mRNA 水平。测量每个裂解物样品在 260 纳米处的 OD，然后在最终体积为 500 μL 的低渗裂解缓冲液中将其调整为相同的 OD。从蔗糖梯度的顶部去除 500 μL，并将调整后的裂解物样品加载到每个梯度的顶部。

接下来，称量并平衡每个梯度管。将试管放入 SW 41 TI 转子中，并将 ultra 离心机置于低断裂模式。然后将样品在 4 摄氏度下以 222、228 倍 G 离心 2 小时。

超速离心完成后，小心地从转子上取下梯度管并将其放在冰上。首先，用两毫升收集管填充馏分收集管。然后在收集馏分前半小时打开计算机泵、UV 检测器和馏分收集器。

将泵设置为以每分钟 3 毫升的速度运行，然后用追逐溶液填充管道以去除系统中的空气。将追踪溶液穿过管道，直到一滴从针头中流出。打开分析软件。

然后将灵敏度设置为正负 10 毫电子伏特，将时基设置为 100 秒。将超速离心管放入 UV 检测器中，确保管处于正交位置。接下来，扭动试管架下方的旋钮，用针头刺穿试管。

将泵流速调整为 1.5 mL/min，并将馏分收集器设置为每 30 秒收集一次馏分，相当于每个馏分 750 μL。将泵置于远程位置。然后启动泵和馏分收集器，同时开始使用 DAQ 示踪剂进行记录。

当第一滴追逐溶液落入收集管时，停止泵和 DAQ 示踪剂。同时，向每个收集的馏分中加入 750 微升三醇并闪蒸。在液氮中冷冻馏分。

然后按照制造商的说明从样品中分离出多核糖体相关 RNA 和胞质 RNA。多核糖体分级分离用于评估胰岛素处理的 C 7 乳腺癌细胞的翻译活性。与对照细胞和用 mTOR 抑制剂 Torin one 处理的细胞相比，胰岛素处理后多核糖体的比例增加。

该结果表明胰岛素刺激 mc 7 细胞中的整体翻译起始率。胰岛素实验的四项独立试验的结果用于评估这种多核糖体分级分离方法的可重复性。来自相同处理条件和 RNA 来源的样品在此图表上的位置很近，表明具有很高的可重复性。

看完这个视频，你应该对如何溶出细胞、准备蔗糖、梯度，最后收集分级分离的核糖体有一个很好的了解。该实验方案将允许您在转录后水平分析基因表达。