一种低成本分析类癫痫活动及运动行为的方法 黑腹果蝇

本实验的总体目标是识别果蝇在运动或癫痫样行为上的改变。首先，使用麻醉剂将果蝇分离至单独的试剂瓶中，随后利用一个简单的网络摄像头记录果蝇的活动。

然后将数据导入 Image J 以开始分析。最后，使用定制的果蝇分析软件来确定记录期间运动的距离、速度和持续时间。最终，该实验可以显示与遗传学和药理学操作相关的运动或癫痫行为的变化。

现在，我们将介绍一种低成本的记录技术，该技术可用于分析果蝇的癫痫样行为和运动能力。特别是，我们已利用该技术鉴定出能够改变果蝇癫痫样行为的遗传和药物干预手段。今天，我实验室的本科研究助理 Chris Burner 将演示这一技术。首先，设置用于在运动和癫痫行为检测期间记录果蝇的网络摄像头。

摄像头就位后，打开便捷的 a VI 软件程序。要调整录制设置，请在“捕获”选项卡下选择“延时图像”选项，新窗口打开后，选择网络摄像头作为捕获设备。对于大多数实验，视频帧尺寸设置为 640 × 480 即可。在压缩选项下，选择 Intel IUV 编码器，并根据实验要求设置每帧的秒数。

在高级选项卡下，为每次采集创建位图图像文件，并选择一个文件夹用于存储程序录制后的图像序列。接下来，将一只死亡的果蝇放置在一张纸上。单击视频设置框，在设备设置选项卡下调整参数，直到明亮的白色背景与较暗的果蝇形成清晰对比。

单击开始按钮以开始录制。录制周期结束后，单击停止按钮。此时图像序列应已保存至选定的运动活性检测文件夹中。

将果蝇转移至装有棉塞的单独小瓶中。让果蝇静置20至30分钟，期间避免扰动。静置结束后，轻轻敲击小瓶，使待测果蝇从瓶中飞出，并移至培养皿盖下。

盖子上应有小缝隙，以允许空气流通，将果蝇置于先前设置好的网络摄像头下方。准备就绪后，按“开始”以记录运动活动。癫痫发作检测的第一步是用标准培养基或含有待测药物的培养基喂养两天大的对癫痫敏感的果蝇。

喂养两天后，轻轻敲击将果蝇转移至单独的空瓶中，并用棉塞封口。让果蝇静置20分钟，期间避免扰动，然后开始观察。准备就绪后，将瓶子放在实验室涡旋振荡器上，以最高档位涡旋10秒。

将固定好的果蝇立即置于网络摄像头正下方的一张白纸上。放置妥当后，开始录制。此为果蝇的活动情况。

果蝇将出现快速而不协调的运动，其间穿插着麻痹期。当果蝇恢复正位后，记录即结束。要开始分析数据，请打开免费的图像处理软件 ImageJ。

首先点击文件选项卡，然后选择导入，以导入所需的图像堆栈。最后，选择图像序列。选择包含图像堆栈的文件夹并打开一幅图像。

当序列选项对话框打开时，选择按数字顺序排序名称，然后选择“确定”。图像堆栈现在将被加载到 Image J 中。接下来，选择图像选项卡，并将数值类型设置为 8 位。再次点击图像选项卡，在调整选项下选择阈值。

此操作将对所有图像设置阈值，使每幅图像均呈现白色背景，果蝇则转换为一个黑色斑点。同时会打开阈值对话框，可在其中调整截断点。逐幅扫描图像，检查是否存在额外的黑色斑点或斑点缺失的情况。

如有必要，调整阈值以解决可能出现的问题。完成调整后，在阈值对话框中选择“应用”。当“转换为掩膜”对话框打开时，单击“确定”以对图像堆栈进行阈值处理。

为了以像素为单位测量果蝇的运动，请在“插件”选项卡下选择多目标追踪插件。当对象追踪对话框出现时，勾选所提供的全部四个选项，然后点击“确定”。多目标追踪插件随后将为黑色物体附上坐标。

在每个切片中记录这些数据，并在结果窗口中列出，同时列出以像素为单位的总长度。路径窗口提供果蝇运动路径的图形显示。从结果窗口复制 X 和 Y 坐标列表，并将数据粘贴到 Excel 电子表格中。

如果图像序列中的任意一张图像不包含黑色区域，多目标追踪程序将在该图像处停止运行。若发生此情况，请重新设置阈值，以确保果蝇呈现为黑色。

在相关幻灯片中。为将路径长度从像素转换为厘米，可在一张空白白纸上放置两个间距已知的点并拍摄图像。确定这两个点的 XY 像素坐标，并利用此信息计算出每厘米对应的像素数，以获得更准确的结果。

通过将XY坐标导入定制的果蝇分析程序来去除图像中的噪声。程序打开后，将每种基因型或处理的数据分别导入不同的电子表格中。接着，选择汇总表选项卡，然后点击“点击此处”按钮。

根据分析类型选择一个阈值，点击“确定”，程序将计算运动的速度、时间和距离。这些代表性轨迹显示了突变果蝇在有无二甲双胍处理情况下的癫痫样活动。在两种测试的突变体中，经处理后癫痫样活动有所减少。

二甲双胍显著减少了果蝇在癫痫样行为检测中的移动距离以及癫痫样活动的总持续时间。相比之下，这些个体运动轨迹的平均速度没有发生变化。野生型CS果蝇的运动轨迹显示其主要集中在圆形实验区域的边缘。

尽管A型突变BSS果蝇的运动轨迹浓度相似，但整体活动量较少。在新环境中进行运动能力检测时，与CS果蝇相比，BSS突变体的运动路径长度显著缩短。该检测方法还发现，在运动行为检测过程中，CS果蝇的移动速度发生了变化。

在整个实验过程中，BSS果蝇基本保持不活跃状态，仅出现几次短暂的活动爆发。使用该技术进行上述任一行为检测时，最重要的一点是确保在记录前不要对果蝇进行麻醉。事实证明，麻醉会影响果蝇的癫痫样行为和运动行为，从而显著改变实验结果。