利用聚焦离子束制备冷冻电子显微镜样品

本实验的总体目标是通过从低温冷冻的大块样品中提取聚焦离子束薄片，制备用于冷冻透射电镜（cryo TEM）的样品。该过程首先将样品在液氮中快速冷冻，并将其装入冷冻聚焦离子束扫描电镜（cryo focused ion beam SEM）中。第二步是利用离子束切割出一片薄的lamella，并通过冷却的纳米操纵器将其转移至透射电镜载网（TEM grid）上。

接下来，将透射电镜载网从扫描电镜样品台转移到传递站中的透射电镜样品台。最后一步是将透射电镜样品台转移至冷冻透射电镜中进行进一步分析。最终，利用冷冻透射电镜获得提取出的薄片的高分辨率图像、断层扫描图像或X射线元素分布图。

该技术将使我们能够通过其他显微技术（如光学显微镜或扫描电子显微镜）预先选定分析位置，从而在透射电子显微镜中对软物质实现最高分辨率的分析。与现有的Mac cryo切片技术相比，该方法的主要优势在于避免了样品制备过程中产生的压缩和变形等制备伪影。首先，安装两个用于聚焦离子束样品的透射电子显微镜载网。

在SEM转移 holder 上，使用螺丝刀拧紧相应的螺丝以固定载网，并关闭快门，安装适合样品的样品台，并添加一部分样品。例如，使用移液器将液滴沉积到平坦的样品台上。然后将SEM转移 holder 安装到真空转移装置（VTD）上。

将液氮加入制浆站并抽真空后，打开制浆站，迅速将SEM转移杆浸入液氮中进行速冻，再次抽真空，直至沸腾结束并重新形成浆状物。接着，将SEM转移杆缩回VTD的真空腔室中并密封。对制浆站和冷冻制样室进行放气，并打开外侧气闸进行放气。

然后将VTD密封装置与冷冻制样室的气闸对接并抽真空。当达到良好的真空度时，调节气闸销以打开VTD与外部气闸的密封。随后插入SEM转移 holder。

随后，使用冷刀打开透射电镜（TEM）载网槽的保护盖。关闭聚焦离子束扫描电镜（FIB-SEM）的高压，打开内腔空气锁。然后使用真空传递装置（VTD）将SEM样品台转移至样品腔室。

将SEM样品台放入冷台后，通过推压并旋转来解除VTD。将VTD杆完全缩回VTD真空腔室中，并关闭内层气闸、外层气闸以及VTD密封。此时，将前驱气体加热至24至26摄氏度，并将气体注入系统（GIS）针头调节至距样品表面约一毫米的高度。

使用电子束成像时，打开气体阀门数秒钟。随后，在低倍率下使用1000皮安的离子束对感兴趣区域（ROI）上方的沉积物进行固化。固化完成后，将样品倾斜至52度，使样品表面与离子束垂直。

研磨去除。两个用于标记的沟槽。在感兴趣区域（ROI）两侧将样品倾斜回零度，并使用离子束切去薄片的两侧及底面，确保切割痕迹贯穿整个薄片。

插入GIS针后，调节纳米操纵器，使其尖端与薄片发生物理接触，最好从侧面接触。打开GIS阀门数秒，并通过电子束连续成像监测冷冻沉积过程。当铂已冷冻沉积额外1至2微米厚度时，关闭阀门，随后仅对纳米操纵器与薄片接触点周围数微米范围内的铂进行固化。

然后使用高离子束电流将薄片切离。小心操作纳米操纵器，将薄片从沟槽中取出，并将其移至距样品表面至少500微米以上的高度。收回探针后，将样品台下降几毫米，并移动样品台，直至视野中出现一个透射电镜（TEM）载网。

将网格上的附着区域移至工作位置，并插入GIS针。接着，小心操控纳米操纵器，使已附着的薄片与透射电镜（TEM）网格上的附着区域实现物理接触，打开气体阀门数秒钟，冷冻沉积一层额外的一到两微米厚的铂层，仅在薄片与TEM网格接触点周围几微米范围内固化铂。然后使用高离子束电流将薄片从纳米操纵器上切割下来。

将样品倾斜至52度，并使用离子束将其减薄至电子透明。用干燥氮气冲洗冷冻转移站后，将冷冻转移透射电镜样品杆插入冷冻转移站的相应插槽中，并加入液氮。随后，将螺丝刀、透射电镜样品夹紧工具和镊子浸入装有液氮的低温杯中，以使它们的尖端冷却至所需温度。

当VTD与外层气闸舱对接后，将冷台升至16毫米的转移高度。关闭高压后，打开VTD密封、外层气闸舱和内层气闸舱。然后使用VTD杆插入SEM转移夹具，并通过推入和顺时针旋转将其锁定。

此时，将SEM转移杆缩回至冷冻制样室中。使用冷刀关闭透射电镜载网的保护盖。然后使用VTD杆将样品移入VTD的真空腔室，并关闭和密封气闸。

然后释放外层气闸室中的气体，并拆下VTD。将VTD与冷冻转移站的SEM接口对接。在用干燥氮气吹扫的同时，利用转移站上的销钉打开VTD的密封，将SEM转移 holder 推入冷冻转移站的腔门内。

使用冷却的螺丝刀打开其中一个盖子，并松开相应的螺丝，同时保持透射电镜载网位置不变。然后用冷却的镊子夹起透射电镜载网，并将其放入透射电镜样品 holder 中。随后，将透射电镜载网固定在透射电镜样品 holder 上。

使用冷却的六边形环，关闭冷冻转移透射电镜载物台的快门，并将冷冻转移站从抽气系统上断开。将该转移站及透射电镜载物台的加热控制器移至透射电镜附近，并重新连接。将透射电镜样品台设置为负70度的倾斜角度。

接下来，设置气闸室最短的抽气时间，仅用干燥氮气进行一次吹扫循环。从冷冻转移站中取出透射电镜样品杆，将其插入倾斜测角仪的第一级，此时将开始抽气循环。循环完成后，在固定住透射电镜样品杆以防止其随测角仪旋转的同时，将测角仪调回至零度倾角。

然后将样品杆完全插入透射电子显微镜（TEM）中的测角器内。最后，用液氮重新填充冷冻转移TEM样品杆的杜瓦瓶。在本方法中，首先通过扫描电子显微镜（SEM）对黑曲霉（Aspergillus niger）孢子进行成像，以确定提取位点。

任何孢子的横截面均足以进行观察，但也可对感兴趣区域（ROI）进行亚微米级精确定位，以在距细胞膜特定距离处切割特定细胞。一旦确定了目标特征，便开始实施冷冻沉积的第一步操作。为保护样品在离子铣削过程中免受电子束损伤，需将样品倾斜至52度角，随后在黑色素（mella）两侧溅射出两条沟槽。然后将样品重新转回原位并进一步铣削，仅保留两个微小的连接桥与主体部分相连。

将冷却的纳米操纵器与薄片接触，并通过另一轮低温铂沉积将其焊接在一起。随后铣削去除细小的连接桥，纳米操纵器将薄片移至透射电镜级样品台的附着区域，并通过最终的低温铂沉积完成焊接。之后，纳米操纵器与薄片分离，薄片被减薄至电子透明。

利用离子束，可将薄片转移至透射电子显微镜（TEM）中，进行高分辨率成像、光谱分析、断层扫描及其他技术操作。该方法将有助于理解神经探针或骨植入物等系统中心脏软物质界面的特性。观看本视频后，您应能够充分掌握如何制备无伪影的冷冻透射电镜样品，并能以亚微米级精度从生物样品的特定区域提取此类样品。