Name: 在结直肠癌细胞的三维模型的入侵肿瘤微环境的分子剖析和体外成纤维细胞 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-04-29T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 33 s
Description: 学习使用激光显微切割技术分离结直肠癌细胞与肿瘤相关基质细胞，构建三维器官型共培养模型进行分子剖析。该方法可精准表征侵袭前沿的生物学特征，助力癌症研究。

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MB 获得英国医学研究理事会（MRC）研究员项目的资助。KP 和 AHM 获得威塞克斯医学研究基金会以及癌症研究英国/皇家外科学院（英格兰）（C28503/A10013）资助项目的支持。我们感谢南安普顿大学组织化学研究单元提供的支持。

1. 从结肠组织外植体建立原代成纤维细胞培养
<ol>
	<li>从外科手术室直接获取正常人结肠黏膜组织样本，并将其悬浮于 7-10 ml 含 100 单位/ml 青霉素、100 μg/ml 链霉素和 0.25 μg/ml 两性霉素 B 的磷酸盐缓冲液（PBS）中。</li>
	<li>在实验室中，将组织样本置于 10 cm 组织培养皿中央，用 PBS/青霉素-链霉素/两性霉素 B 溶液清洗 3 次。最后一次清洗后不要抽吸去除液体。</li>
	<li>使用无菌镊子和手术刀将组织切成小块（约 2 mm），并将每一块组织放置在 12 孔板中用手术刀片划出的十字线中心。轻轻晃动手术刀，使组织贴附于孔底。</li>
	<li>将样本培养于 750 μl 原代成纤维细胞生长培养基中（DMEM 培养基添加 20% 胎牛血清（FCS）、100 U/ml 青霉素、100 μg/ml 链霉素和 292 μg/ml L-谷氨酰胺），培养基应浸没组织但防止其漂浮。在接下来的 5 天内避免扰动培养板，仅每 2 天换液一次。</li>
	<li>在接下来的 5 天内，成纤维细胞将缓慢地从组织边缘开始生长，约 7 天时更为明显。大约 3-4 周后，若已有足够数量的成纤维细胞迁出，向每孔加入 750 μl 胰蛋白酶。待细胞脱落后（可能需要 5-10 分钟），收集细胞并转移至 T-25 组织培养瓶中。</li>
</ol>
2. 器官型制备
成纤维细胞浸润的组织型凝胶的制备：
<ol>
	<li>在补充有10%胎牛血清（FCS）和292 μg/ml L-谷氨酰胺的DMEM中制备含有每类器官5 × 105个细胞的成纤维细胞悬液。</li>
	<li>在冰上按以下比例配制类器官凝胶：
	<ul>
		<li>7体积的大鼠尾胶原：Matrigel混合液（1:1）</li>
		<li>1体积的过滤灭菌10×DMEM</li>
		<li>1体积的FCS</li>
		<li>1体积含有5 × 105个成纤维细胞的细胞悬液 
		为制备9个凝胶（每个凝胶1 ml），共配制10 ml混合液，并轻柔混匀以避免产生气泡。</li>
	</ul>
	</li>
	<li>将1 ml混合液加入24孔板的每个孔中，在37 °C、湿润环境中孵育1小时，使凝胶凝固。1小时后，在凝胶表面加入1 ml含10% FCS的DMEM/谷氨酰胺培养基，放回培养箱过夜。</li>
	<li>次日，吸除凝胶表面的培养基，并接种1 ml含有5 × 105个结直肠癌（CRC）上皮细胞的培养基。</li>
</ol>
凝胶包被尼龙膜的制备：
<ol start="5">
	<li>提前准备无菌、经高压灭菌的尼龙膜片，尺寸为 1.5 cm × 1.5 cm。</li>
	<li>使用无菌镊子将所需数量的尼龙膜片放入 10 cm 培养皿中（通常每个培养皿可容纳 4 片尼龙膜片）。</li>
	<li>在冰上按以下顺序配制凝胶溶液（每片尼龙膜片需 250 μl 总体积）：
	<ul>
		<li>7 份大鼠尾胶原蛋白（Rat-Tail Collagen）</li>
		<li>1 份过滤后的 10 倍浓度 DMEM</li>
		<li>1 份胎牛血清（FCS）</li>
		<li>1 份含 10% FCS 和谷氨酰胺的 DMEM（DMEM 10% FCS/Glut）</li>
	</ul>
	</li>
	<li>若溶液呈黄色，需逐次加入 50 μl 的 0.1 M NaOH 进行中和，直至溶液变为粉红色。</li>
	<li>向每片尼龙膜片上加入 250 μl 上述溶液，并在 37 °C、含 5% CO2 的湿润环境中孵育 30 分钟，使凝胶充分凝固。</li>
	<li>用 PBS 配制 1% 戊二醛溶液。待凝胶凝固后，向每个 10 cm 培养皿中加入 10 ml 该溶液，并在 4 °C 下孵育 1 小时。</li>
	<li>用 PBS 洗涤尼龙膜片 3 次，再用含 10% FCS 的 DMEM/谷氨酰胺（DMEM/Glu）洗涤 1 次，随后在 4 °C 下用 DMEM/Glu 溶液孵育过夜。</li>
</ol>
将类器官凝胶置于钢丝网上以诱导侵袭：
<ol start="12">
	<li>通过将不锈钢片折叠成三脚架形状，预先制备支架网格。使用前进行高压灭菌。</li>
	<li>使用经乙醇灭菌的镊子将一个钢网放入六孔板的每个孔中。</li>
	<li>将胶原层面朝上的明胶包被尼龙膜放置在每个支架网格上。</li>
	<li>使用经乙醇灭菌的刮铲，小心地将类器官凝胶从24孔板转移至抬高的尼龙膜上。</li>
	<li>向孔中加入含10% FCS补充的DMEM 10% FCS/Glut培养基，直至尼龙膜与培养基接触但未浸没。确保培养基不接触类器官凝胶。</li>
	<li>在37 °C、5% CO2的湿化环境中孵育14天，每2天更换一次培养基。</li>
</ol>
3. 器官型固定
<ol>
	<li>从孔板中取出包含尼龙网的整个器官型组织，放置在保鲜膜上。</li>
	<li>使用洁净的一次性手术刀将器官型组织和尼龙网沿中线切开，并将两半均在室温下用甲醛固定24小时。</li>
	<li>24小时后，将甲醛替换为70%乙醇，过夜放置，随后进行石蜡包埋、切片和染色。</li>
</ol>
4. 侵袭边缘的激光显微切割
<ol>
	<li>将组织切片至10 μm厚度，并贴附于膜载玻片上。</li>
	<li>加入二甲苯处理1分钟以脱蜡，随后去除二甲苯，并用75%乙醇固定1分钟。</li>
	<li>去除乙醇，用0.125%焦油紫（Cresyl Violet）溶液染色1分钟。焦油紫可使上皮细胞着色，便于与间质组织区分。</li>
	<li>去除焦油紫溶液，再用100%乙醇处理1分钟，随后用100%乙醇漂洗。将载玻片置于室温下晾干30分钟。</li>
	<li>使用选定的平台进行激光显微切割（e.g. Leica AS系统）。</li>
	<li>将带有染色组织切片的玻璃载玻片反向放置于显微镜载物台上，使切片面朝下。</li>
	<li>将0.5 ml微量离心管插入收集盒中，并向管盖内加入50 μl细胞裂解缓冲液（e.g.&#160;DNA、RNA或蛋白裂解缓冲液），用于收集激光显微切割所得组织。</li>
	<li>在直接观察下，使用操纵杆定位目标组织区域，并通过软件界面标注染色的组织切片，圈选出肿瘤侵袭前沿需进行显微切割的细胞区域。</li>
	<li>启动激光，使其切割所圈选区域，并将切割下的组织弹射至微量离心管的管盖中。</li>
	<li>当收集到足够量的组织后，取出收集盒，盖上微量离心管，轻轻离心，使裂解缓冲液沉降至管底。</li>
	<li>将样品置于冰上保存，直至显微切割完成。随后采用适当方法处理样品，提取目标分析物。</li>
</ol>

<ol><li>Nystrom, M. L., Thomas, G. J., Stone, M., Mackenzie, I. C., Hart, I. R., Marshall, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+quantitative+method+to+analyse+tumour+cell+invasion+in+organotypic+culture%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Development of a quantitative method to analyse tumour cell invasion in organotypic culture.</a> J Pathol. 205 (4), 468-475 (2005).</li>
<li>Zhang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((miR-153+supports+colorectal+cancer+progression+via+pleiotropic+effects+that+enhance+invasion+and+chemotherapeutic+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">miR-153 supports colorectal cancer progression via pleiotropic effects that enhance invasion and chemotherapeutic resistance.</a> Cancer Res. , (2013).</li>
<li>Bullock, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pleiotropic+actions+of+miR-21+highlight+the+critical+role+of+deregulated+stromal+microRNAs+during+colorectal+cancer+progression%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+Dis%22%5BJournal%5D)">Pleiotropic actions of miR-21 highlight the critical role of deregulated stromal microRNAs during colorectal cancer progression.</a> Cell Death Dis. 20 (4), (2013).</li>
<li>Jenei, V., Nystrom, M. L., Thomas, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+invasion+in+an+organotypic+model%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Measuring invasion in an organotypic model.</a> Methods Mol Biol. 769, 223-232 (2011).</li>
<li>De Wever, O., Demetter, P., Mareel, M., Bracke, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stromal+myofibroblasts+are+drivers+of+invasive+cancer+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Cancer%22%5BJournal%5D)">Stromal myofibroblasts are drivers of invasive cancer growth.</a> Int J Cancer. 123 (10), 2229-2238 (2008).</li>
<li>Fries, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+of+fibroblast+heterogeneity+and+the+role+of+fibroblast+subpopulations+in+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Immunol+Immunopathol%22%5BJournal%5D)">Evidence of fibroblast heterogeneity and the role of fibroblast subpopulations in fibrosis.</a> Clin Immunol Immunopathol. 72 (3), 283-292 (1994).</li>
<li>Moutasim, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Betel-derived+alkaloid+up-regulates+keratinocyte+alphavbeta6+integrin+expression+and+promotes+oral+submucous+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Betel-derived alkaloid up-regulates keratinocyte alphavbeta6 integrin expression and promotes oral submucous fibrosis.</a> J Pathol. 223 (3), 366-377 (2011).</li>
<li>Winter, J., Jung, S., Keller, S., Gregory, R. I., Diederichs, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Many+roads+to+maturity%3A+microRNA+biogenesis+pathways+and+their+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Many roads to maturity: microRNA biogenesis pathways and their regulation.</a> Nat Cell Biol. 11 (3), 228-234 (2009).</li>
<li>Li, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+miRNA+expression+patterns+using+total+RNA+extracted+from+matched+samples+of+formalin-fixed+paraffin-embedded+%28FFPE%29+cells+and+snap+frozen+cells%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Comparison of miRNA expression patterns using total RNA extracted from matched samples of formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) cells and snap frozen cells.</a> BMC Biotechnol. 7 (36), (2007).</li>
<li>Szafranska, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accurate+molecular+characterization+of+formalin-fixed%2C+paraffin-embedded+tissues+by+microRNA+expression+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Diagn%22%5BJournal%5D)">Accurate molecular characterization of formalin-fixed, paraffin-embedded tissues by microRNA expression profiling.</a> J Mol Diagn. 10 (5), 415-423 (2008).</li>
</ol>

作者声明不存在任何潜在的利益冲突。

本文介绍一种方法，用于特异性分离和表征在转移进展的最早阶段获得侵袭癌相关间质能力的肿瘤细胞，该方法基于上皮细胞与间质细胞的三维共培养体系。
由结直肠癌上皮细胞与含合成基质的间质相邻组成的共培养模型 ex&#160;体内 人结肠成纤维细胞被用于研究三维环境下的结直肠癌侵袭。这一在生理上具有相关性的系统可模拟 在&#160;体内 条件可通过替换上皮中的细胞并使用构建的间质来适应其他癌症情况 ex&#160;活体 不同解剖来源的成纤维细胞。&#160; 该方法的一个局限性在于仅使用成纤维细胞来简化间质区室，而实际上间质区室的组成更为复杂。 在&#160;体内 结肠间质是一种复杂且动态的组织，其细胞组成具有异质性。以免疫来源的细胞为例，这类细胞在原发性肿瘤组织中大量存在，但在本模型中则不存在。&#160; 尽管如此，该模型可靠的可重复性以及其细胞组分易于进行实验操作的特点（例如 通过在上皮和间质区室中对单个基因进行过表达或敲低），这使得该模型相比传统方法更具价值且成本效益更高 在&#160;体...

类器官共培养是一种组织工程模型，通过将恶性上皮细胞与间质细胞共同置于含有重要细胞外基质组分的胶原凝胶中，从而在三维空间中重建体内肿瘤微环境1-3。该模型最初被设计用于评估肿瘤侵袭能力，可减少对体内动物模型的依赖，并克服其他体外技术（如Transwell侵袭实验）的局限性——在这些实验中，侵袭细胞被迫人为地处于单一分散状态2-4。在这些模型中引入间质细胞（如成纤维细胞），反映了肿瘤微环境在调控恶性侵袭和转移中的关键作用3-4。然而，由于间质细胞存在显著的表型异质性，为了最大程度提高类器官模型的生理相关性，应尽可能使用器官特异性、解剖学上精确的离体成纤维细胞3,6。
类器官是一种多功能平台，可用于研究肿瘤细胞与基质细胞之间的相互作用，并正以越来越多的新方式被用于探究化学抑制剂和靶向基因改变对肿瘤侵袭的影响7,8研究侵袭性肿瘤边缘具有特别令人兴奋的前景。在类器官模型中，已建立的结直肠癌（CRC）细胞系通常形成层次分明的上皮层，通过横切面可清晰辨识出获得侵袭细胞外基质（ECM）能力的细胞。鉴于肿瘤及肿瘤相关间质细胞已知的微地形异质性 体内通过激光显微切割技术分离这些细胞并进行独立研究，可能揭示有关结直肠癌转移起源的重要生物学见解，并有助于更高效地确定治疗靶点。在以下方法学描述中，所有提供组织样本的患者均签署了书面知情同意书，且本研究已获得相关机构地区研究伦理委员会的批准。

<table><tbody><tr><td>结直肠癌细胞系——示例为 SW480</td><td>ATCC</td><td>ATCC CCL-228</td><td></td></tr><tr><td>胶原蛋白</td><td>BD 生物科学</td><td>354265</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>BD生物科学</td><td>354234</td><td></td></tr><tr><td>尼龙膜</td><td>默克密理博</td><td>VVLP01300</td><td></td></tr><tr><td>金属网格</td><td>The Mesh Company</td><td>WSS20-A4</td><td>themeshcompany.com</td></tr><tr><td>激光显微切割平台</td><td>Leica Microsystems</td><td>Leica AS LMD</td><td></td></tr><tr><td>膜片载玻片</td><td>分子装置</td><td></td><td></td></tr><tr><td>焦宁蓝</td><td>默克密理博</td><td>1052350025</td><td></td></tr></tbody></table>

结直肠癌细胞三维模型中侵袭性肿瘤微环境的分子谱分析 离体 成纤维细胞

Molecular Profiling of the Invasive Tumor Microenvironment in a 3-Dimensional Model of Colorectal Cancer Cells and Ex vivo Fibroblasts

侵袭性结直肠癌（CRC）细胞已获得从其姐妹细胞中脱离、浸润间质并重塑细胞外基质（ECM）的能力。对这一表型独特细胞群体的生物学特性进行表征，有望显著加深我们对转移级联过程中早期事件的理解。

肿瘤侵袭是一个动态过程，由恶性上皮与癌症相关间质之间的双向相互作用所促进。为了研究肿瘤间质界面处的细胞特异性反应，我们结合了器官型共培养与激光显微切割技术。
在类器官模型中，成纤维细胞等关键间质成分与癌变上皮细胞进行三维共培养，这类模型是高度可调控的实验工具，可在接近生理条件的情况下研究肿瘤侵袭及癌细胞与间质的相互作用。

激光显微切割（LMD）是一种以微米级精度对肿瘤组织内不同层次进行手术分离和提取的技术。
通过将这些技术与基因组学、转录组学和表观遗传学分析相结合，我们旨在更深入地理解侵袭性肿瘤细胞及其周围间质组织的分子特征，从而有可能揭示结直肠癌（CRC）中新的生物标志物以及药物开发的新机遇。

我们已将上述方法应用于多种结直肠癌细胞系与间质细胞的组合。本文展示的一个示例是SW480上皮性结直肠癌细胞系与原代人源ex vivo结肠成纤维细胞的共培养。构建三维共培养体系（图1），进行显微观察和激光捕获显微切割（图2），并通过microRNA（miRNA）表达谱分析（图3），比较侵袭性肿瘤前沿区域细胞与分层（非侵袭性）肿瘤区域细胞之间差异表达的miRNA。
<img alt="结直肠癌细胞侵袭实验示意图；胶原蛋白包被的网格上的类器官凝胶；细胞分析。" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51475/51475fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51475/51475fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 1">...

对合成的组织工程结直肠癌模型中激光显微切割的细胞及其间质进行分子谱分析，代表了一种新颖且可操控的方法，可用于表征和解析肿瘤侵袭前沿的肿瘤细胞与癌相关间质细胞之间界面处独特的生物学特性。&#160;

侵袭性结直肠癌（CRC）细胞已获得脱离其相邻细胞、浸润间质并重塑……的能力

本实验的总体目标是表征侵袭性肿瘤前沿恶性上皮细胞与癌症相关间质细胞之间界面上独特的生物学特性。首先通过建立结肠种植组织来源的原代成纤维细胞培养体系来实现该目标；第二步是利用原代结肠成纤维细胞与培养的结直肠癌细胞构建类器官共培养模型。接下来，将类器官模型用甲醛固定，切片后置于膜包被的载玻片上，并用结晶紫染色。最后一步是激光显微切割，以分离侵袭性肿瘤细胞与非侵袭性肿瘤细胞以及肿瘤相关间质细胞。最终，可利用分子谱型分析技术来表征侵袭性与非侵袭性肿瘤细胞及其周围肿瘤微环境中间质细胞的生物学特性。当我们意识到在结直肠癌的三维类器官共培养模型中，侵袭性细胞与非侵袭性细胞之间的区别非常清晰时，我们首次提出了该方法的构想。首先，直接从实验室的外科手术室获取正常人结肠黏膜组织样本。将一份标本置于10厘米组织培养皿的中央，随后用磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤培养物三次，PBS中需添加青霉素、链霉素和真菌抑制剂（fungi zone）。最后一次用无菌镊子和手术刀清洗后，不要进行抽吸操作，将组织切成小块。然后将每一块组织放置在用手术刀划出的十字线中心位置。在12孔板中，轻轻移动手术刀，使组织贴附于培养表面。将标本置于750微升的原代成纤维细胞生长培养基中，培养基应浸没组织但防止其漂浮。随后将标本放入37摄氏度、5%至10% CO2的培养箱中培养，持续5天。成纤维细胞将在约7天时开始从组织边缘缓慢向外生长。大约三到四周后，这一现象将更加明显。如果已有足够数量的成纤维细胞生长出来，在细胞脱离后，向每个孔中加入 750 微升胰蛋白酶，然后将细胞转移至 T25 组织培养瓶中，用于制备含成纤维细胞的原位凝胶。首先，用添加了补充物的 dmm 制备成纤维细胞悬液，每凝胶含 500,000 个细胞。在冰上按照文本方案中所述比例制备九个凝胶，每个凝胶体积为一毫升。共配制十毫升，轻柔混匀以避免产生气泡。随后将一毫升混合液加入24孔板的每个孔中，在37摄氏度、湿润的环境中孵育一小时。为使凝胶在一小时后充分凝固，在凝胶上方加入一毫升添加了补充物的 DMEM 培养基，并放回培养箱中过夜。次日，吸去凝胶表面的培养基，并在涂有凝胶的尼龙膜上接种一毫升含 500,000 个结直肠癌上皮细胞的培养基。使用无菌镊子预先准备好尺寸为 1.5 厘米 × 1.5 厘米的无菌尼龙膜片。将所需数量的尼龙膜片放入一个 10 厘米的培养皿中。按照文本方案所述，在冰上制备凝胶混合液，并向凝胶混合液中滴加 0.1 摩尔的氢氧化钠，直至溶液变为粉红色，表明溶液已中和。然后将 250 µL 该溶液加入每张尼龙膜上。随后在 37°C、5% CO2 的湿润环境中孵育 30 分钟，使凝胶充分凝固。接着，向每个 10 cm 培养皿中加入 10 mL 含 1% 戊二醛的 PBS 溶液。凝胶在4°C条件下孵育一小时后已完全凝固，随后用PBS洗涤尼龙膜三次，再用添加补充物的DME洗涤一次。将尼龙膜在相同缓冲液中于4°C条件下过夜孵育，以使类器官凝胶升起到钢网上，用于侵袭已灭菌的支架网格，这些支架网格是通过将不锈钢片折叠成三脚架结构制备而成。然后用已灭菌的镊子和乙醇将钢网放入六孔板的每孔中。将胶原层面朝上的凝胶涂层尼龙膜放置在每个网格上。使用经灭菌和乙醇处理的刮铲，小心地将24孔板中的类器官凝胶转移至抬高的尼龙膜上。向孔中加入含补充剂的DMEM培养基，直至尼龙膜与培养基接触但未浸没。确保培养基不接触器官型凝胶。在37°C、5% CO2的湿润环境中培养14天，每两天更换一次培养基。取出包含尼龙膜的整个器官型组织，从孔板中移出并置于保鲜膜上。使用干净的一次性手术刀将器官型组织和尼龙膜沿中线切开，将两半组织分别置于甲醛中固定24小时。在室温下，24小时后将甲醛更换为70%乙醇，过夜放置，随后进行石蜡包埋、切片和染色，以进行激光显微切割。第一部分，将组织切片切至10微米厚度并置于膜包被的载玻片上。按照文本方案中描述的方法处理切片后，准备使用选定的平台进行激光显微切割。将带有染色切片的玻片放置到位以进行显微切割。将0.5毫升微量离心管安装到显微镜载物台的收集盒中，倒置放置，并向管盖内加入50微升细胞裂解缓冲液，显微切割所得组织将在直视下落入其中。使用操纵杆定位目标组织，通过软件界面标注染色的组织切片，圈选出肿瘤浸润前沿需进行显微切割的细胞区域。启动激光，使其切割所圈选区域，并将显微切割下的组织弹射至微量离心管的管盖内。采用适当方法继续处理样品，以提取目标分析物。此处显示的是SW 480结肠直肠癌细胞侵入类器官间质的激光显微切割图像。使用结晶紫对结肠直肠癌上皮细胞进行染色以突出显示。在进行激光显微切割之前，首先界定侵袭性肿瘤岛，随后将切割下的组织片段转移至收集装置。采用相同方法识别并分离非侵袭性细胞和间质细胞。通过微小RNA表达谱分析三维共培养体系，以比较位于肿瘤侵袭前沿的细胞与位于分层肿瘤区域的细胞之间差异表达的微小RNA。数据根据全变化以及数据值上下两倍进行排序。展示了一个代表性实验的结果，显示侵袭边缘细胞与非侵袭边缘细胞之间微小RNA基因表达的差异。观看本视频后，您应能充分了解如何构建解剖结构适当的类器官模型，以及如何利用激光显微切割技术分离特定细胞群体以进行后续研究。哇。

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科研

JoVE Journal

Medicine

医学

在结直肠癌细胞的三维模型的入侵肿瘤微环境的分子剖析和<em&gt;体外</em&gt;成纤维细胞

我们描述了一种用于解离结直肠癌（CRC）组织以获得可存活单细胞的方法，随后将这些单细胞捕获在定制的识别表面抗原的抗体微阵列上（DotScan CRC...

使用抗体微阵列和荧光多重技术对结直肠癌细胞表面蛋白进行分析

我们开发了三维共培养模型，可用于实时活细胞成像，以观察乳腺肿瘤细胞与其微环境中其他细胞之间的相互作用，这些相互作用影响着向侵袭性表型的进展。这些模型可作为临床前筛选工具，用于靶向筛选影响侵袭性的旁分泌诱导的蛋白水解、趋化因子/细胞因子及激酶通路的药物。...

用于肿瘤的4D活细胞成像的MAME模型：影响恶性进展的微环境相互作用

该视频展示了以微米级精度对三维类器官共培养模型进行激光显微切割的过程。在三维类器官模型中，成纤维细胞等间质成分与癌源性上皮细胞进行三维共培养。该三维模型作为一种实验工具，可在接近生理条件的环境中研究肿瘤侵袭及癌-间质相互作用。...

激光显微切割：一种从三维类器官培养模型中分离侵袭性结直肠癌细胞的技术

由成纤维细胞构建的组织工程天然基质是一种新兴工具，可用于生成支持上皮细胞增殖和分化的间质基底。本文介绍了一种应用该方法评估不同类型间质细胞对肿瘤细胞生物学特性影响的实验方案。...

肿瘤间质微环境的组织工程构建及其在癌细胞侵袭研究中的应用

本文详细介绍了利用三维（3D）实验方法定量分析乳腺癌细胞侵袭的技术。具体而言，我们讨论了建立此类实验所需的步骤、定量方法与数据分析，以及检测细胞侵袭过程中细胞膜完整性丧失的相关方法。...

三维模型定量分析乳腺癌细胞侵袭性

本文介绍一种三维共培养方案，可用于研究多细胞相互作用以及细胞外基质对癌细胞行为的调控作用。在此实验模型中，将癌细胞培养在嵌有人大肠癌相关成纤维细胞的胶原凝胶上。...

三维共培养模型用于肿瘤-间质相互作用研究

本文介绍了一种三维培养方法，用于分析原代乳腺癌细胞的形态，以及研究它们与单核细胞的直接/间接相互作用及其结果，例如胶原降解、免疫细胞募集、细胞侵袭和促进癌症相关炎症。...

基于细胞外基质提取物（ECME）的三维系统中单核细胞与原发性乳腺癌细胞间通讯的分析

本实验方案的目的是建立一种三维体外模型，用于在类似肿瘤组织的环境中研究癌相关成纤维细胞（CAFs）的分化过程，该模型可应用于多种分析系统，如免疫荧光、转录分析和活细胞成像。...

一种更接近生理条件的三维球体模型用于癌相关成纤维细胞分化与侵袭的体外研究

本方案介绍了一种新颖、稳定且可重复的培养体系，用于从Caco2结肠腺癌细胞生成并培养三维球状体。研究结果首次证明了该方法适用于癌症干细胞生物学研究，包括对化疗反应的研究。...

用于研究结肠癌干细胞的三维类球体模型

采用肺腺癌细胞、成纤维细胞和单核细胞制备多细胞三维肿瘤球体，随后从这些球体中分离出肿瘤相关成纤维细胞（CAFs）。将分离得到的CAFs与正常成纤维细胞进行比较，通过检测线粒体膜电位、活性氧水平及酶活性来评估线粒体功能状态。...

评估从三维多细胞肺癌球体中分离出的肿瘤相关成纤维细胞的线粒体健康状况

迫切需要能够模拟异质细胞间串扰的三维癌症模型来研究癌症转移。本研究展示了在有支架和无支架环境中构建异质多细胞间质-上皮模型的方法，可用于研究细胞侵袭行为及空间分布特征。...

无支架三维上皮癌细胞培养中异源多细胞间质细胞驱动侵袭

学习使用激光显微切割技术分离结直肠癌细胞与肿瘤相关基质细胞，构建三维器官型共培养模型进行分子剖析。该方法可精准表征侵袭前沿的生物学特征，助力癌症研究。

结直肠癌细胞三维模型中侵袭性肿瘤微环境的分子谱分析离体成纤维细胞

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