慢性肾脏病患者血管功能的评估

以下实验的总体目标是评估慢性肾病患者的血管功能。首先从患者体内采集血管内皮细胞，随后测量主动脉脉搏波传导速度，以评估大弹性动脉的僵硬度。接下来，通过测量肱动脉血流介导的舒张功能，进一步评估血管内皮功能。

最终可以获得表征血管内皮功能的结果。该方法有助于回答血管领域中的关键问题，例如各种蛋白质在细胞水平上的表达会发生何种变化。通常，刚接触该方法的研究人员会遇到困难，因为掌握超声成像技术需要大量的实践和培训。

由本实验室研究助理 Lonnie Perino 演示该操作流程。首先，使用局部抗菌剂准备操作部位。接着，在操作部位覆盖无菌有孔洞巾。

应由经过培训的护士或医生放置静脉导管并连接肝素帽适配器。在手术单上放置两根J形导丝以解开J形弯曲。将两根导丝的J形弧度拉开。

导丝展开后，打开肝素帽，将JWI插入静脉内约8厘米。在拔出前，前后推动导丝数次，以避免血液在导丝上过度积聚。接下来，使用剪线钳将导丝剪断，使其能够放入含有约30毫升解离缓冲液的50毫升锥形管中。

当样本采集完成后，对第二根导线重复上述步骤。返回湿实验室，用镊子夹住导线，将其置于管内但液面之上，静置10分钟。

使用电动移液器从管中吸取解离缓冲液冲洗金属丝。释放缓冲液，使其沿金属丝长度方向流下，并将多余的液体甩入管中。取出金属丝，离心样品以形成沉淀。

取出样品，用 PBS 重悬沉淀，然后离心。之后再用吸管末端的吸头吸取，使试管中剩余约两毫升液体，其余液体在不扰动沉淀的情况下抽去。

将沉淀重悬，并用移液器将样品均匀加入八个预先标记的载玻片的椭圆区域。将载玻片置于37摄氏度培养箱中孵育5小时，然后于-80摄氏度保存，直至准备开始分析。受试者应换上一次性短裤，在安静、光线昏暗且温湿度受控的房间内仰卧。

准备就绪后，将超声和动脉硬化检测设备的电极放置到位。接着，将血压袖带戴在受试者手臂上。20分钟后开始测量血压，重复测量直至连续读数之间的差异在5毫米汞柱以内。

每次测量之间休息两分钟，并至少进行三次测量。接下来触诊肱动脉搏动，放置测速仪记录肱动脉波形。依次对桡动脉、股动脉和颈动脉重复上述操作。

使用卷尺测量从胸骨上切迹到肱动脉、桡动脉和颈动脉各测量点的距离，使用定制尺测量股动脉的距离。接下来，使用专用软件计算颈-肱动脉、颈-桡动脉和颈-股动脉脉搏波传导速度。将前臂血压袖带置于肘突远端附近。

将血管软件设置为触发模式，并记录至少10个心动周期的基线肱动脉超声图像和血流速度测量值。如有需要，可使用机械臂固定超声探头。接下来，将前臂血压袖带充气至250毫米汞柱。

并开始计时。指导受试者保持完全静止。当计时器显示4分45秒时，开始记录速度。

在五分钟时松开袖带，并将超声切换为记录B模式图像。当计时器显示5分10秒时，继续记录，直至计时器显示7分钟。

接下来，测量受试者的血压。如果收缩压大于或等于100毫米汞柱，则将0.4毫克的硝酸甘油片置于受试者舌下，并启动计时器。当计时器显示为3分钟时，开始记录B模式图像，并随后停止记录。

当计时器显示八分钟时。为了分析染色的内皮细胞，应由一名单盲实验者系统性地扫描载玻片，通过VE-cadherin的阳性染色来鉴定内皮细胞，并通过DAPI的阳性染色确认细胞核的完整性。此外，细胞还应针对目标蛋白进行染色。

每张载玻片应成像30个细胞，用于后续分析。对染色批次中的每张载玻片（包括VE对照载玻片）重复此过程。使用定性软件分析目的一抗染色强度。

该图像显示了慢性肾病患者在解除袖带压迫两分钟后，评估期间获得的肱动脉基线直径。该记录显示了由R波门控的直径变化。这些波形在颈动脉和股动脉处分别获取。

利用时间和距离的差异来计算主动脉脉搏波速度的报告。在此，对照组和患者的细胞被用于分析细胞核完整性（通过DPI检测内皮细胞表达VE钙黏蛋白）以及氧化酶NADPH氧化酶的表达。在进行该操作时，重要的是要记住，必须获取质量尽可能高的超声图像、波形图以及内皮细胞图像，以实现准确且定量的评估。

请注意，处理人类样本可能具有极高的危险性，在进行本操作时，应始终采取预防措施，例如穿戴合适的一次性个人防护装备。