限制性内切酶克隆方法，以评估在体外 HIV-1 C亚型的Gag-MJ4嵌合病毒的复制能力
2014年8月31日
HIV-1 的发病机制由病毒特征和宿主遗传因素定义。在这里，我们描述了一种稳健的方法，该方法允许进行可重复的测量，以评估 gag 基因序列变异对病毒体外复制能力的影响。
该程序的总体目标是将源自亚型 CHIV one 感染个体的 gag 基因掺入具有复制能力的 HIV one 质粒中。为了评估 gag 序列多态性对体外 HIV 一复制能力的影响，这是通过首先从患者血浆中扩增 gag 基因来实现的。第二步是将患者来源的 gag 序列克隆到具有复制能力的感染性分子克隆 MJ four 中。
接下来，转染 gag MJ 四嵌合体质粒以生成感染性病毒储液，并进行滴度测定以评估对指示细胞系的感染性。最后一步是测量 G XR 25 T 细胞系的体外复制能力。最终，使用放射性标记的逆转录酶测定法来量化病毒粒子随时间的产生，以便可视化病毒复制动力学。
我们今天要介绍的方法可以帮助回答 HIV 领域的关键问题。这些包括定义 HIV 复制适应性的决定因素以及了解 HIV 适应性如何影响长期发病机制。今天介绍这些方法的是我的两位研究生 Jessica Prince 和 Dan Klaban。
要开始此程序，请从 RNA 中逆转录 CDNA，并在一步法 RT PCR 中使用逆转录酶和热稳定 DNA 聚合酶扩增第一轮 DNA 产物。然后使用 1 μL 的第一轮 PCR 扩增作为 DNA 模板，进行巢式第二轮 PCR 扩增。接下来，将 3 μL 的 5 x 上样染料添加到 5 μL 的第二轮反应体积中。
在含有 UV 荧光 DNA 染料的 1%aros TAE 凝胶上以 120 伏电压运行，直到条带被解析。然后在蓝光照明器上可视化 1.6 KB 条带。之后，在含有 DNA 染色剂的 1%aros TAE 凝胶上运行剩余的 45 微升反应体积。
用干净的剃须刀片切除适当的条带，并将每个人的三个阳性反应混合在一起。随后使用凝胶纯化试剂盒从凝胶切片中提取 DNA，并在无核酸酶的水中加入。将产品冷冻在零下 20 摄氏度，以便稍后在此程序中使用。
扩增长末端后，重复 MJ 4 质粒的 5 个主要 UTR 区。在照明器上观察 1.3 KB PCR 产物，切除阳性扩增子，然后如前所述纯化和冷冻它们。接下来，通过剪接重叠延伸 PCR 创建融合的 MJ 四个 LTR gag 扩增子。
观察、切除、纯化和冷冻 3.2 kb 长的扩增子。现在，在 50 摄氏度下消化 1.5 μg MJ 四个质粒和 1.5 μg 纯化的 LTR gag PCR 产物和 BCL 一个限制性核酸内切酶 1.5 小时。随后，在消化反应中加入 1 微升 NGOM 4，并在 37 摄氏度下孵育 1 小时。
之后，向限制性消化反应中加入 5 x 上样染料。在含有 A DNA 染色剂的 1%aros、TAE 凝胶上以 100 伏特缓慢电泳总体积 1 至 2 小时。如前所述，可视化、切除和纯化用于克隆的指示条带。
接下来，使用纯化的 LTR gag 制备连接反应。以 3：1 的插入片段与载体比例插入 MJ 4 载体 DNA。将连接反应物在 4 摄氏度下孵育过夜。
然后转化 JM 1 0 9 化学感受态细菌，连接产物以 100 微克/毫升的浓度铺在 LB 螺旋板上。氨苄青霉素在 30 摄氏度下培养转化的细菌至少 22 小时。为了确认克隆的保真度，在 37 摄氏度下用 NGO M four 和 HPA one 限制性内切酶在双消化中切割小量制备 DNA，并放置 2 小时。
然后，在 1%aros 上进行分析。TAE 凝胶。根据 TZM BL 细胞测定中每微升滴度的 IU 计算每个原液所需的病毒体积，以便以 0.05 的感染复数感染 5 乘以 10 到第五个 G XR 2 5 个细胞。
在感染当天，请务必穿戴适当的个人防护装备，以便与具有复制能力的 HIV 合作，包括长袍、口罩和双层手套。从零下 80 摄氏度的冰箱中取出病毒原液并解冻。接下来，在 C-R-P-M-I 培养基中将病毒稀释至 100 微升的体积。
为了获得 0.05 MOI，将其添加到 vbo 组织培养处理的 96 孔板中，包括每组复制实验中的阳性和阴性对照，并设置板，使每隔一根色谱柱均为空白，以限制孔之间的交叉污染。之后，使用自动细胞计数器对 GXR 2 5 个细胞进行计数，并计算所有感染所需的细胞总数。将所需体积分装到 50 mL 锥形管中，离心以沉淀细胞。
然后小心吸出培养基，并以每 100 微升 10 至 5 倍的浓度重悬于 C-R-P-M-I 中，将细胞移液到无菌槽中并充分混合。随后使用多通道移液器，将 100 微升细胞加入含有稀释病毒的 96 孔板的每个孔中，并充分混合。之后，向每个孔中加入 2 微升每毫升 5 毫克的多脑溶液，并彻底混合细胞。
然后在 37 摄氏度下在 5% CO2 的组织培养箱中孵育 3 小时，以洗涤感染细胞离心机。96 孔 V 底板沉淀细胞。然后小心地去除 150 微升培养基，并用新鲜的 150 微升 C-R-P-M-I 代替，而不会干扰细胞沉淀。
在最后一次离心后，再重复该过程两次以充分洗涤细胞，并加入 150 微升 C-R-P-M-I 用多通道移液器重悬细胞沉淀。将每个孔中的混合物添加到 24 孔组织培养板的孔中的 800 微升 C-R-P-M-I 中。然后将板放入 37 摄氏度的 5% CO 2 组织培养箱中，每两天一次。
将 100 μL 上清液从培养孔表面转移到 96 孔 U 底板的孔中，并使用 RT 测定冷冻以供后续分析，然后彻底重悬细胞并去除剩余体积的一半以防止细胞过度生长。之后，通过在此过程中向每个孔中加入 550 微升新鲜 C-R-P-M-I 来恢复原始体积，向每 1 毫升等分试样中加入 1 至 2 微升 10 毫居里 DTTP 和 4 微升 1 微升 DIO 3 etol。用 1000 微升移液管小心混合每个 1.5 毫升微量离心管的 RT 预混液 DTT 和 DTTP，然后转移到无菌槽中。
接下来分配 25 微升标记的 RT。混入 96 孔薄壁 PCR 板的每个孔中。将 5 μL 每种上清液添加到含有 RT 预混液的 PCR 板中。然后用粘性铝箔盖密封 PCR 板，孵育后在 37 摄氏度下在热循环仪中孵育 2 小时，使用 200 微升多通道移液器在铝箔盖上打小孔。
将样品混合五次。将每个样品 5 微升转移到 DE 81 试纸上，让所有样品风干 10 分钟。将印迹放入单独的洗涤容器中。
随后用一个 XSSC 洗涤印迹 5 次。然后用 90% 乙醇 2 次，每次洗涤 5 分钟，然后让它们风干。干燥后，小心地将印迹膜包裹在 Saran 包装膜中，并在室温下将其暴露在紧密密封的膜盒中的磷酸化筛网上过夜。
准备好后，使用磷酸化成像仪分析磷酸化筛选并定量放射性转录本。显示。以下是具有代表性的凝胶图像，描述了生成能够克隆到 MJ 四质粒骨架中的患者来源的 gag 扩增子所需的各种 PCR 扩增子的电泳分离。该代表性凝胶图像描述了将患者 gag 基因克隆到 MJ 4 中的限制性酶切物的电泳分离。
而这个具有代表性的凝胶图像描绘了限制性电泳分离消化纯化的 gag MJ 四个嵌合体质粒 DNA。该图显示了 G XR 2 5 细胞系中复制测定随时间变化的可重复性。使用相同的 gag MJ 四种嵌合病毒感染 G XR 2 5 细胞，在相隔大约一年进行的两项独立实验中。
通过计算对数转换的 DLU 值的斜率并将该斜率归一化为野生型 MJ 4 来生成复制分数。两种独立的测量结果具有很强的相关性，并突出了在不同时间和不同传代细胞进行的分析的可重复性。这项技术为 HIV 辅助领域的研究人员探索病毒发病机制的决定因素铺平了道路。
在急性 C 亚型感染中，这是全球最普遍的亚型。与具有复制能力的 HIV 一起工作可能是极其危险的。所有涉及活病毒的步骤都应在 BSL two plus 设施中进行。
应定期对所有表面进行消毒，并始终佩戴双层手套。
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概述
本研究提出了一种评估gag基因序列变异对HIV-1体外复制能力影响的方法。通过将患者衍生的gag基因整合到复制能够的HIV-1质粒中，该研究旨在加深对HIV-1发病机制的理解。
关键研究组成部分
科学领域
- 病毒学
- HIV研究
- 遗传分析
背景
- HIV-1发病机制涉及病毒特征和宿主遗传学。
- 理解gag基因变异对HIV研究至关重要。
- 体外研究有助于评估病毒复制能力。
- 需要稳健的方法来进行可重复测量。
研究目的
- 评估gag序列多态性对HIV-1复制能力的影响。
- 开发一种将患者衍生的gag基因整合到HIV-1质粒中的方法。
- 量化病毒颗粒产生并可视化病毒复制动力学。
使用的方法
- 从患者血浆中扩增gag基因。
- 将gag序列克隆到感染性分子克隆MJ4中。
- 转染嵌合体质粒以产生感染性病毒库。
- 使用放射标记逆转录酶测定法测量复制能力。
主要结果
- 成功将患者衍生的gag基因整合到HIV-1质粒中。
- 量化随时间变化的病毒颗粒产生。
- 体外可视化病毒复制动力学。
- 展示gag序列变异对复制能力的影响。
结论
- 该方法提供了研究HIV-1复制的可靠方法。
- 获得的见解可以为未来的HIV研究和治疗策略提供信息。
- 理解gag基因变异对于理解HIV-1发病机制至关重要。
常见问题
Executive Industry Relevance
This method enables biopharma R&D to link HIV-1 gag sequence variation to in vitro replication capacity, providing a mechanistic basis for understanding viral fitness determinants. By quantifying how naturally occurring polymorphisms affect replication kinetics, the approach supports target validation and de-risking in early-stage antiviral discovery. It offers a reproducible platform for assessing how viral genetic changes influence pathogenesis-relevant phenotypes such as set point viral load.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates how gag gene polymorphisms impact viral replication capacity, informing therapeutic hypothesis testing.
- Operational Value: Enables functional assessment of viral genetic variants through chimeric virus construction in a standardized backbone.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative replication scores via RT assay readouts, enabling comparative fitness analysis across variant libraries.
- Operational Value: Establishes a robust, reproducible workflow for measuring virion production over time in a T-cell line.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Connects in vitro replication capacity to clinical parameters like set point viral load and CD4+ decline, supporting translational biomarker alignment.
- Operational Value: Provides a continuous assay system from discovery through preclinical validation for HIV-1 pathogenesis studies.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the HIV discovery continuum from variant identification to functional validation, supporting lead identification through phenotypic screening of gag-driven replication differences.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of how gag sequence changes affect viral fitness and replication capacity.
- Screening: Delivers quantitative, assay-ready viral stocks with titered infectivity for standardized compound or variant evaluation.
- Analytics: Employs RT-based kinetic measurements to generate replicative fitness scores normalizable to wild-type controls.
- Translational Research: Links in vitro replication outcomes to early pathogenesis markers, enabling risk-adjusted advancement decisions.
- Enterprise Reuse: Establishes a cloning and assay platform adaptable to other HIV-1 subtypes or viral systems beyond subtype C.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity in linking gag variation to replication phenotypes, increasing predictive confidence in target selection.
- Operational Value: Standardizes chimeric virus generation and replication measurement, improving reproducibility across labs and timepoints.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions by quantifying biological risk associated with viral escape variants.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets based on replication capacity thresholds derived from patient isolates.
Implementation Considerations
- Requires expertise in molecular cloning, HIV-1 handling, and BSL-2+ containment for replication-competent virus work.
- Dependent on restriction enzyme-based cloning infrastructure, gel purification, and nucleic acid quantification tools.
- Necessitates standardized cell culture practices for GXR25 T-cell line maintenance and infection normalization.
- Involves optimization considerations when adapting the cloning strategy to other HIV-1 subtypes or backbones.
- Dependent on radioisotope handling capacity for RT assay quantification, with associated safety and waste management requirements.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
1:53
Amplification of the HIV-1 Gag Gene from Infected, Frozen Plasma
3:29
Cloning Amplified Gag Genes into the MJ4, Subtype C, Infectious Molecular Clone
6:09
In vitro Replication of Gag-MJ4 Chimeras in GXR25 (CEM-CCR5-GFP) Cells
10:06
Analysis of Reverse Transcriptase in Cell Culture Supernatants
12:11
Results: A Restriction Enzyme Based Cloning Method to Assess the In vitro Replication Capacity of HIV-1 Subtype C Gag-MJ4 Chimeric Viruses
13:44
Conclusion
