Name: 牛痘病毒记者量化病毒功能在基因表达的各个阶段 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-05-15T13:45:00.000+00:00
Duration: 10 min 48 s
Description: 了解利用三重报告基因牛痘病毒实时测量病毒感染性和基因表达的方法。该技术可识别小分子抑制剂影响的病毒复制特定阶段，为抗病毒策略研究提供重要工具。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

我们感谢位于俄勒冈州科瓦利斯的SIGA Technologies提供了ST-246。D.K.R. 的研究得到了美国国立卫生研究院（NIH）对波士顿大学免疫学培训项目（5T32AI 7309）的资助。本工作部分由P41 086180、NIH RO1AI1096159-01以及RO3 &#160;（资助对象：J.H.C.）支持。

1. 铺板细胞
<ol>
	<li>将HeLa细胞从培养板上解离，并用生长培养基（DMEM，2 mM L-谷氨酰胺，10%胎牛血清）稀释至约2.0 × 105 个细胞/ml。取100 μl/孔加入黑色壁、透明平底的96孔板中（每孔20,000个细胞）。</li>
	<li>将细胞在37 °C、5% CO2的培养箱中孵育24小时，直至形成汇合单层。</li>
</ol>
2. 感染细胞
<ol>
	<li>稀释病毒并感染细胞。
	<ol>
		<li>解冻TrpV（三重病毒；早期Venus、中期mCherry、晚期TagBFP）和PLV（无启动子Venus）荧光病毒，并使用超声处理5分钟以分散病毒颗粒。或者，可将粗制病毒原液与含0.25 mg/ml胰蛋白酶的感染培养基按1:1比例混合，在37 °C孵育30分钟。</li>
		<li>将粗制病毒原液用37 °C感染培养基（DMEM，2 mM L-谷氨酰胺，2% FBS）稀释。对于高MOI感染（10 PFU/细胞），将病毒原液稀释至1.0 × 107 PFU/ml，假设为 5 x 104 每孔细胞数和接种体积为50 μl。每种处理需设置3个复孔用TrpV感染，另设3个复孔用PLV感染，以校正每种处理特有的背景荧光。</li>
		<li>在感染培养基中加入50 μl/孔的稀释病毒进行感染，此时间点定义为感染后0小时（0 hpi）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将所需处理化合物稀释至感染培养基中。所有处理均应配制一份2倍浓度的母液混合物，并将其加入至重复孔中。例如 总体积350 μl，用于六块96孔板，每孔50 μl。
	<ol>
		<li>将实验化合物稀释至感染培养基中。</li>
		<li>稀释用溶剂对照例如 PBS、DMSO）加入感染培养基中。注意：溶剂对照组的终浓度应与实验化合物所用的浓度相同（例如 如果您的IBT储备液是用DMSO配制的，并以1 μl/ml的终浓度使用，则应使用1 μl/ml的DMSO作为溶剂对照。</li>
		<li>将对照化合物稀释至感染培养基中。推荐的对照化合物包括：3.6 μM（1 μg/ml）1-β-D-阿拉伯呋喃糖基胞嘧啶（AraC）、50 μM（11.7 μg/ml）异靛素β-硫代半卡巴腙（IBT）、60 μM（50 μg/ml）利福平（Rifampicin）或5 μM（1.9 μg/ml）ST-246。 8,15,16参见代表性结果部分以了解预期效果。注意：配制该稀释液时浓度应为所需最终浓度的两倍（2×），因其将与孔中现有体积以1:1比例混合。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>病毒加入后立即加入50 μl含有所需处理因素和对照的感染培养基，该培养基按步骤2.2稀释制备。注意：若需检测早期表达前的抑制作用，可将化合物直接加入稀释后的病毒接种物（步骤2.1.2）中，或在感染前（步骤2.1.3之前）加入宿主细胞中。</li>
	<li>在37 °C、5% CO₂培养箱中孵育6-24小时2.</li>
</ol>
3. 固定细胞
<ol>
	<li>通过向每孔中已有的感染培养基加入 100 μl 8% 多聚甲醛固定细胞。室温避光孵育 15 分钟。注意：建议直接将 2 倍浓度的多聚甲醛（8%）加入感染培养基中，以防止在固定前将高滴度培养基直接倾倒至废液皿时产生具有传染性的痘苗病毒气溶胶。</li>
	<li>将培养板倒置放入废液皿中，去除固定液。</li>
	<li>加入 100 μl 室温 PBS。</li>
	<li>用光学透明粘性封板膜密封培养板。注意：若不立即检测，培养板可在 4 °C 条件下储存。检测前务必使密封的培养板恢复至室温，以防止冷凝水影响分光光度计读数。</li>
</ol>
4. 定量病毒生长
<ol>
	<li>在515:530 nm（Venus）、587:610 nm（mCherry）和415:457 nm（TagBFP）处测定终点荧光（激发波长:发射波长，单位为nm）。每个孔需使用各通道优化的增益设置进行四次测量并取平均值。注意：合适的发射波长可能因所用酶标仪的具体型号和滤光片特性而异。可通过执行发射波长扫描实验，确定各通道中TrpV与PLV之间差异最大的波长点，以经验方式确定最佳波长。</li>
	<li>对原始数据进行归一化处理，以便于不同实验之间的比较。
	<ol>
		<li>针对每个通道，计算重复孔中TrpV和PLV的平均值。</li>
		<li>将每种处理条件下TrpV感染组的平均测量值减去相应PLV感染对照组的平均背景值。</li>
		<li>将各背景校正后的数值除以仅含载体（vehicle-only）处理组的数值，进行数据归一化。</li>
		<li>当实验重复多次后，可对各通道数据进行单因素方差分析（one-way ANOVA）及多重比较事后检验，以判断任一处理组是否与仅含载体处理组之间存在统计学上的显著差异。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. 替代方案：&#160;动力学平板检测
<ol>
	<li>执行所有步骤，直至加入处理物（步骤 2.3）。</li>
	<li>用粘性封板膜密封培养板，并置于已平衡至 37 °C 的酶标仪腔室内。注意：必须特别注意保持培养板始终处于 37 °C，以避免细胞受到非必要应激和冷凝水产生。对于动力学检测，尤其重要的是使用缓冲培养基（碳酸氢钠和 HEPES），以在无需添加 5% CO2 的条件下维持合适的 pH 值。</li>
	<li>手动设置酶标仪增益，以防止后续时间点信号饱和。注意：可通过在相似条件下进行终点检测来准确优化增益。</li>
	<li>在感染后 8–24 小时内每小时采集一次读数，并使用与终点检测相似的程序进行归一化处理（步骤 4.2）。</li>
	<li>可采用与前述终点检测相似的方法，对各个时间点进行统计学显著性分析。</li>
</ol>

<ol><li>Yen, J., Golan, R., Rubins, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vaccinia+virus+infection+%26+temporal+analysis+of+virus+gene+expression%3A+part+1%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Vaccinia virus infection & temporal analysis of virus gene expression: part 1.</a> J Vis Exp. 26 (26), (2009).</li>
<li>Hansen, S. G., Cope, T. A., Hruby, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BiZyme%3A+a+novel+fusion+protein-mediating+selection+of+vaccinia+virus+recombinants+by+fluorescence+and+antibiotic+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22BioTechniques%22%5BJournal%5D)">BiZyme: a novel fusion protein-mediating selection of vaccinia virus recombinants by fluorescence and antibiotic resistance.</a> BioTechniques. 32 (5), 1182-1187 (2002).</li>
<li>Popov, S., Mirshahidi, S., Essono, S., Song, R., Wang, X., Ruprecht, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+recombinant+vaccinia+viruses+via+green+fluorescent+protein+selection%5BTitle%5D)+AND+%22DNA+and+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Generation of recombinant vaccinia viruses via green fluorescent protein selection.</a> DNA and Cell Biology. 28 (3), 103-108 (2009).</li>
<li>Bartee, E., Mohamed, M. R., Lopez, M. C., Baker, H. V., McFadden, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+addition+of+tumor+necrosis+factor+plus+beta+interferon+induces+a+novel+synergistic+antiviral+state+against+poxviruses+in+primary+human+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">The addition of tumor necrosis factor plus beta interferon induces a novel synergistic antiviral state against poxviruses in primary human fibroblasts.</a> Journal of Virology. 83 (2), 498-511 (2009).</li>
<li>Ward, B. M., Moss, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+intracellular+movement+of+vaccinia+virus+virions+containing+a+green+fluorescent+protein-B5R+membrane+protein+chimera%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Visualization of intracellular movement of vaccinia virus virions containing a green fluorescent protein-B5R membrane protein chimera.</a> Journal of Virology. 75 (10), 4802-4813 (2001).</li>
<li>Johnson, M. C., Damon, I. K., Karem, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid%2C+high-throughput+vaccinia+virus+neutralization+assay+for+testing+smallpox+vaccine+efficacy+based+on+detection+of+green+fluorescent+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virological+Methods%22%5BJournal%5D)">A rapid, high-throughput vaccinia virus neutralization assay for testing smallpox vaccine efficacy based on detection of green fluorescent protein.</a> Journal of Virological Methods. 150 (1-2), 14-20 (2008).</li>
<li>Dower, K., Rubins, K. H., Hensley, L. E., Connor, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+Vaccinia+reporter+viruses+for+rapid%2C+high+content+analysis+of+viral+function+at+all+stages+of+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Antiviral+Research%22%5BJournal%5D)">Development of Vaccinia reporter viruses for rapid, high content analysis of viral function at all stages of gene expression.</a> Antiviral Research. 91 (1), 72-80 (2011).</li>
<li>Dower, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+pyridopyrimidinone+inhibitor+of+orthopoxviruses+from+a+diversity-oriented+synthesis+library%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Identification of a pyridopyrimidinone inhibitor of orthopoxviruses from a diversity-oriented synthesis library.</a> Journal of Virology. 86 (5), 2632-2640 (2012).</li>
<li>De Clercq, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+Potential+of+the+Acyclic+Nucleoside+Phosphonates+Cidofovir%2C+Adefovir%2C+and+Tenofovir+in+Treatment+of+DNA+Virus+and+Retrovirus+Infections%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Microbiology+Reviews%22%5BJournal%5D)">Clinical Potential of the Acyclic Nucleoside Phosphonates Cidofovir, Adefovir, and Tenofovir in Treatment of DNA Virus and Retrovirus Infections.</a> Clinical Microbiology Reviews. 16 (4), 569-596 (2003).</li>
<li>Prichard, M. N., Kern, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Orthopoxvirus+Targets+for+the+Development+of+New+Antiviral+Agents%5BTitle%5D)+AND+%22Antiviral+Research%22%5BJournal%5D)">Orthopoxvirus Targets for the Development of New Antiviral Agents.</a> Antiviral Research. 10, (2012).</li>
<li>Fenner, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+successful+eradication+campaign.+Global+eradication+of+smallpox%5BTitle%5D)+AND+%22Reviews+of+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">A successful eradication campaign. Global eradication of smallpox.</a> Reviews of Infectious Diseases. 4 (5), 916-930 (1982).</li>
<li>Breman, J. G., Henderson, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Poxvirus+dilemmas--monkeypox%2C+smallpox%2C+and+biologic+terrorism.+The+New+England%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Poxvirus dilemmas--monkeypox, smallpox, and biologic terrorism. The New England.</a> Journal of Medicine. 339 (8), 556-559 (1998).</li>
<li>Baker, R. O., Bray, M., Huggins, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potential+antiviral+therapeutics+for+smallpox%2C+monkeypox+and+other+orthopoxvirus+infections%5BTitle%5D)+AND+%22Antiviral+Research%22%5BJournal%5D)">Potential antiviral therapeutics for smallpox, monkeypox and other orthopoxvirus infections.</a> Antiviral Research. 57, 1-2 (2003).</li>
<li>Rimoin, A. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Major+increase+in+human+monkeypox+incidence+30+years+after+smallpox+vaccination+campaigns+cease+in+the+Democratic+Republic+of+Congo%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Major increase in human monkeypox incidence 30 years after smallpox vaccination campaigns cease in the Democratic Republic of Congo.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the U S A. 107 (37), 16262-167 (2010).</li>
<li>Sodeik, B., Griffiths, G., Ericsson, M., Moss, B., Doms, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assembly+of+vaccinia+virus%3A+effects+of+rifampin+on+the+intracellular+distribution+of+viral+protein+p65%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Assembly of vaccinia virus: effects of rifampin on the intracellular distribution of viral protein p65.</a> Journal of Virology. 68 (2), 1103-1114 (1994).</li>
<li>Grosenbach, D. W., Jordan, R., Hruby, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+the+small-molecule+antiviral+ST-246+as+a+smallpox+therapeutic%5BTitle%5D)+AND+%22Future+Virology%22%5BJournal%5D)">Development of the small-molecule antiviral ST-246 as a smallpox therapeutic.</a> Future Virology. 6 (5), 653-671 (2011).</li>
<li>Broyles, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vaccinia+virus+transcription%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+General+Virology%22%5BJournal%5D)">Vaccinia virus transcription.</a> Journal of General Virology. 84 (9), 2293-2303 (2003).</li>
<li>Condit, R. C., Niles, E. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+viral+transcription+elongation+and+termination+during+vaccinia+virus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta+%28BBA%29+-+Gene+Structure+and+Expression%22%5BJournal%5D)">Regulation of viral transcription elongation and termination during vaccinia virus infection.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Gene Structure and Expression. 1577 (2), 325-336 (2002).</li>
<li>Díaz-Guerra, M., Rivas, C., Esteban, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inducible+expression+of+the+2-5A+synthetase%2FRNase+L+system+results+in+inhibition+of+vaccinia+virus+replication%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Inducible expression of the 2-5A synthetase/RNase L system results in inhibition of vaccinia virus replication.</a> Virology. 227 (1), 220-228 (1997).</li>
<li>Cohrs, R. J., Condit, R. C., Pacha, R. F., Thompson, C. L., Sharma, O. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+ppp%28A2%E2%80%99p%29nA-dependent+RNase+by+a+temperature-sensitive+mutant+of+vaccinia+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Modulation of ppp(A2’p)nA-dependent RNase by a temperature-sensitive mutant of vaccinia virus.</a> Journal of Virology. 63 (2), 948-951 (1989).</li>
<li>Sánchez-Puig, J. M., Sánchez, L., Roy, G., Blasco, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Susceptibility+of+different+leukocyte+cell+types+to+Vaccinia+virus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Virology+Journal%22%5BJournal%5D)">Susceptibility of different leukocyte cell types to Vaccinia virus infection.</a> Virology Journal. 1 (1), (2004).</li>
<li>Bengali, Z., Satheshkumar, P. S., Yang, Z., Weisberg, A. S., Paran, N., Moss, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+S2+cells+are+non-permissive+for+vaccinia+virus+DNA+replication+following+entry+via+low+pH-dependent+endocytosis+and+early+transcription%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Drosophila S2 cells are non-permissive for vaccinia virus DNA replication following entry via low pH-dependent endocytosis and early transcription.</a> PLoS One. 6 (2), (2011).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突披露，且针对病毒或筛选方法无待批准的专利。

&#160;本文介绍了多阶段痘苗病毒报告病毒（TrpV）的实际应用，该病毒可对病毒复制提供可重复的实时反馈测量。通过使用明确的痘病毒抑制剂，我们证明了TrpV的反应方式与各抑制剂已知的作用机制一致。尽管TrpV病毒能够提供关于病毒各阶段进展的最全面信息，但两阶段（IREV、LREV）和单阶段（EV、IV、LV）病毒也可类似地使用，充分利用Venus荧光蛋白优异的折叠能力、稳定性以及更高的信噪比。

本方案中的概念验证实验表明，可通过一种简单、高通量的板式实验，检测已知的痘病毒抑制剂所影响的病毒基因表达阶段。该实验方法还可进一步扩展，用于对未知的化合物文库进行快速、全面的筛选。可通过在低感染复数（MOI）下，利用病毒接种经小分子处理的细胞，从而特异性地鉴定出可阻断病毒生命周期任一阶段的化合物。随后，可使用TrpV在多个MOI条件下对这些抑制剂进行筛选，以确定其抑制的病毒生命周期阶段，包括病毒进入（无基因表达）、早期、中期或晚期基因表达，以及组装阶段（完全基因表达但无病毒扩散）。我们已利用该技术成功鉴定出一种新的抗痘病毒抑制剂，其...

传统上，病毒表达的研究采用分子生物学技术例如 Northern 印迹，Western 印迹，微阵列杂交 等等。) 1尽管这些方法能够提供有关单个 mRNA 或蛋白质表达变化分类的详细信息，但通常难以适用于实时和高通量的检测流程。以往在痘病毒研究中已应用基于荧光报告分子的替代方法；然而，这些方法的开发和使用基于不同的研究目的。其中一些方法旨在筛选重组病毒 2,3这些技术在重组痘苗病毒克隆中外源DNA正确整合并表达时，可表达EGFP。类似地，已有多种稳定表达可溶性EGFP或由天然痘苗病毒启动子驱动的GFP标记蛋白的痘苗病毒株被广泛使用。这些病毒株通常用于基于抗体的中和试验、化学抑制实验或抗病毒效果比较中，定量检测病毒的进入与复制情况。 4–6尽管这些病毒已被证明具有一定的应用价值，但由于其使用了单一且具有模糊性的早期/晚期病毒启动子，因而难以提供关于抑制作用位点的详细信息。此外，以往的方法还采用了信噪比较差的EGFP蛋白。

由于痘病毒复制的复杂性以及目前尚无可用的工具来检测病毒基因表达的实时变化，我们开发了一系列单阶段和多阶段报告病毒7,8。如先前发表的研究所述，这些病毒在感染的早期、中期或晚期阶段，利用天然的痘苗病毒启动子表达一种、两种或三种光谱上可区分的荧光蛋白。这些病毒可用于荧光显微镜下监测病毒复制进程，同样也适用于基于微孔板和读板仪的高通量检测。这些病毒可直接替代野生型病毒使用，其生长动力学相似，并能达到相当的滴度7。在设计和构建这些病毒的过程中，我们精心选择了具有高信噪比、优异折叠效率的荧光蛋白（Venus、mCherry 和 TagBFP），以实现对表达变化的可靠定量和快速响应。此外，所选用的病毒启动子组合能够实现高保真、明确的阶段特异性表达，可分别反映早期（C11R 启动子）、中期（G8R 启动子）和晚期（F17R 启动子）基因表达的完整范围，避免了传统早期/晚期模糊启动子带来的不确定性。

这些病毒可作为研究痘苗病毒这一典型痘病毒生命周期的工具。尽管对痘苗病毒的研究已有很长历史，但关于宿主与病毒相互作用的许多方面仍不清楚。痘苗病毒结构复杂，可产生超过200种独特的蛋白质，其中许多具有免疫调节功能并可拮抗宿主防御机制。感染发生后，痘苗病毒立即启动早期mRNA转录。这一过程由RNA聚合酶及转录因子介导，这些因子在病毒颗粒组装期间即已加载至病毒基因组上，并处于暂停状态，直至后续感染时被激活。早期基因表达主要产生抑制宿主免疫系统的蛋白质（如mRNA脱帽酶、双链RNA结合蛋白、诱饵受体蛋白，以及凋亡、应激反应和Toll、IL、NF-κB信号通路的抑制因子）和参与基因组复制的蛋白。早期表达还包括产生介导中期基因表达所需的转录因子。中期基因表达则进一步产生晚期阶段所需的转录因子。这一级联式表达过程最终导致感染晚期结构蛋白和病毒酶类蛋白的合成，这些蛋白对于成熟痘苗病毒颗粒的完整组装至关重要。

我们构建的一系列荧光报告病毒有助于快速推进对痘病毒生物学特性的理解。在病毒学领域，最常用且耗时较长的方法之一是病毒生长实验。该方法通常包括感染细胞、实施一系列处理、通过裂解感染细胞收获病毒，并通过噬斑实验定量测定最终的病毒滴度。使用本文所述的报告病毒，可对病毒生长进行实时监测，并能方便地平行比较多种不同处理条件下的病毒增殖情况。我们预计这一系列试剂将广泛应用于各种实验方案中，以检测药物处理、RNA干扰敲低或宿主范围限制等因素对病毒基因表达的影响。

该方法还能实现比以往更大规模的高内涵分析，从而对特定目标阶段进行高通量抗病毒药物筛选。尽管已鉴定出多种用于对抗痘病毒感染的潜在治疗方法，但目前美国食品药品监督管理局（FDA）唯一批准的有效治疗药物仅为无环磷酰核苷类似物西多福韦（Cidofovir）以及痘苗病毒免疫球蛋白治疗9,10。尽管天花已于1977年被根除11，痘病毒仍对人类健康构成重大威胁12。由于停止对天花病毒进行广泛疫苗接种，人群对其他痘病毒的易感性随之增加13。例如，此前因接种疫苗而受到保护的中非地区，目前正面临猴痘病毒感染病例的激增14。此外，人们对天花病毒可能被蓄意释放所引发的潜在风险也高度关注。由于现有疗法极为有限，开发新型治疗方法已成为当务之急。这些报告病毒可用于快速、高通量地筛选小分子抑制剂，以抑制病毒复制的特定阶段。发现作用于目前尚未被抑制的病毒表达阶段的抑制剂，将有助于开发更具效力的联合疗法。


通过观察各个阶段基因表达的变化，可以深入了解痘苗病毒的细胞生物学特性。对感染的宿主细胞进行化学或遗传学操作所导致的病毒减毒，通常以病毒滴度降低来表示。然而，通过比较病毒表达级联反应各个阶段的变化，可以更全面地理解特定处理对病毒适应性的影响。这些数据已被证明与传统的病毒滴度结果具有良好的相关性，同时还能提供更为详细的机制信息以及高通量分析能力7。

<table><tbody><tr><td>杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）</td><td>Gibco</td><td>11995-065</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清 - 优级，热灭活（FBS）</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>S12450H</td><td></td></tr><tr><td>200 mM L-谷氨酰胺（L-glut）</td><td>Gibco</td><td>25030-081</td><td></td></tr><tr><td>96孔平底透明黑色聚苯乙烯TC处理微孔板</td><td>康宁</td><td>3603</td><td></td></tr><tr><td>384孔平底透明底部黑色聚苯乙烯TC处理微孔板</td><td>康宁</td><td>3712</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白酶，2倍浓度，无菌，经辐照</td><td>沃辛顿生化公司</td><td>TRLVMF</td><td></td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液（PBS）</td><td>Gibco</td><td>10010-023</td><td></td></tr><tr><td>二甲基亚砜，细胞培养级（DMSO）</td><td>American Bioanalytical</td><td>AB03091</td><td></td></tr><tr><td>1-&amp;beta;阿糖胞苷&amp;nbsp; （阿糖胞苷），分子量 = 280 g/mol</td><td>SigmaAldrich 公司</td><td>C6645</td><td></td></tr><tr><td>异吲哚啉二酮 &amp;beta; -噻吩甲酰肼（IBT），分子量= 234 g/mol</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9075202</td><td></td></tr><tr><td>利福平，分子量 = 823 g/mol</td><td>SigmaAldrich 公司</td><td>R3501</td><td></td></tr><tr><td>ST-246，分子量 = 376 g/mol</td><td>SIGA Labs，科瓦利斯，俄勒冈州</td><td></td><td></td></tr><tr><td>8% 甲醛（Paraformaldehyde）水溶液</td><td>电子显微镜科学公司</td><td>157-8</td><td></td></tr><tr><td>TempPlate RT 透明光学膜</td><td>USA Scientific</td><td>2978-2700</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM 低血清培养基</td><td>Gibco</td><td>31985-070</td><td></td></tr></tbody></table>

用于量化基因表达各阶段病毒功能的痘苗病毒报告病毒

Vaccinia Reporter Viruses for Quantifying Viral Function at All Stages of Gene Expression

痘病毒是一类双链DNA病毒，包含多种对人类具有致病性的病毒，例如猴痘病毒、传染性软疣病毒和传染性脓疱病病毒。该病毒家族还包括天花病毒——天花病毒（Variola）。由于痘病毒复制过程复杂，目前对其基因表达策略仍有许多问题尚未阐明。本文介绍了重组痘苗病毒的设计与应用，该技术能够在高通量条件下实时检测病毒基因表达的单个或多个阶段。该方法利用光谱特性不同的荧光蛋白作为报告分子，分别标记病毒复制的三个阶段。这些病毒在保持各阶段特异性表达模式的同时，具有高信噪比，可用于基于孔板的检测以及对病毒传播和复制过程的显微观察。这些工具可用于抗病毒药物筛选、病毒与宿主相互作用研究以及进化生物学研究。

作为这些病毒典型用途的一个示例，三重荧光报告病毒被用于比较几种明确的痘病毒抑制剂的作用抑制位点。
将HeLa细胞接种于经组织培养处理的黑色壁透明平底96孔板中，过夜培养。使用三重报告病毒（TrpV；表1）或无启动子Venus（PLV）对汇合的单层细胞进行感染，感染复数（MOI）为10，具体操作依据孔板图（图1）进行。向感染培养基中加入处理试剂，终浓度分别为0.1% DMSO、3.6 μM（1 μg/ml）AraC、50 μM（11.7 μg/ml）IBT、5 μM（1.9 μg/ml）ST-246或60 μM（50 μg/ml）利福平，每组设三个重复。以0.1% DMSO作为溶剂对照，因为所有抑制剂储备液均以DMSO配制，使用时终体积比为1 μl/ml。将培养板放回37 °C培养箱，继续培养至感染后18小时（18 hpi）。通过向每孔加入100 μl 8%多聚甲醛固定细胞，固定15分钟，随后将板置于PBS中避光保存，直至使用酶标仪检测。采用Tecan Infinite M1000酶标仪及i-control软件（v1...

我们描述了一种荧光报告型痘苗病毒的使用方法，该病毒可通过光谱上可区分的报告荧光蛋白的时相特异性表达，实现对病毒感染性和基因表达的实时检测。我们详细介绍了一种基于孔板的方法，用于精确定位小分子抑制剂作用下病毒复制受干扰的具体阶段。

痘病毒是一类双链DNA病毒，包括一些对人类具有致病性的人痘病毒，如猴痘病毒、传染性软疣病毒和接触性口疮病毒。

本实验的总体目标是确定化学处理影响病毒基因表达的阶段。为此，将组织培养细胞接种并培养至完全融合。随后，使用三重报告基因痘苗病毒或不含启动子的对照病毒对细胞进行感染。随后加入处理化合物，并将细胞孵育18小时，以完成病毒基因表达的所有阶段。然后使用酶标仪测定产生的荧光信号。最终可获得结果，显示实验化合物引起的基因表达相对变化。与表达单一荧光融合蛋白的病毒感染相比，该技术的主要优势在于，这一系列病毒能够提供更多关于特定治疗药物作用于病毒生命周期中哪个阶段的信息，从而揭示其作用机制。尽管该方法可用于鉴定病毒入侵的抑制剂，也可用于检测病毒在非许可性细胞系或RNA干扰筛选中完成复制的阶段，进而鉴定感染所必需的宿主细胞因子。本方案采用三重病毒（TrpV）多阶段报告病毒，该病毒将三种光谱上可区分的荧光蛋白整合到单个痘苗病毒的双链基因组中。这些荧光蛋白各自受特定发育阶段启动子的精确调控：C 11 R 启动子驱动 Venus 的早期表达，G eight R 中期启动子调控 m-cherry 的表达，F 17 R 启动子则介导 tag BFP 的晚期表达。因此，在感染过程中，Venus、m-Cherry 和 tag BFP 依次表达。作为对照，使用无启动子的病毒。PLV 包含与 TrpV 中相似的 Venus 结构，但不含功能性转录启动子。首先，将培养在10厘米培养皿上的HeLa细胞进行消化，然后用生长培养基将细胞稀释至大约每毫升2.0 × 10⁵个细胞。接着，将100 µL细胞悬液加入黑色壁透明平底96孔板的每个孔中。将细胞置于含5% CO₂的37 °C培养箱中培养24小时，直至细胞达到完全汇合。为稀释病毒，将TrpV和PLV在37 °C水浴中解冻，随后超声处理5分钟以分散聚集体。然后，将病毒原液用已预热至37 °C的感染培养基稀释至1.0 × 10⁷ PFU/mL。为了感染细胞，将每孔中的培养基替换为50微升稀释后的病毒液。每种处理条件下，用TrpV感染三个重复孔，另用PLV感染三个重复孔，以校正每种处理特有的背景荧光。此步骤定义为感染后0小时（time equals zero hours post-infection）。例如，为6个96孔板（每孔50微升）配制共350微升病毒液。每种化合物应稀释至最终浓度的两倍，因为其将被加入到孔中已有的接种液体积中。接下来，针对每种处理条件，通过将实验化合物或对照溶剂（如PBS或DMSO）稀释至足够的感染培养基中，配制两倍浓度的母液，体积需覆盖所有重复孔外加一孔的用量。请注意，实验组和仅含载体的对照组中溶剂的浓度应保持一致。例如，若你使用溶于DMSO的IBT（1微升/毫升），则你的载体对照组也应使用相同浓度的DMSO（1微升/毫升）作为对照。在加入病毒后立即按照本图所示，向每孔加入50微升含有目标处理化合物或对照化合物的感染培养基。请注意，每种化合物均使用TrpV和PLV进行三次重复测试，每种病毒均设置三次重复的溶剂对照。 在37摄氏度、含5%二氧化碳的培养箱中孵育18小时。次日，向每孔已有的感染培养基中加入100微升8%多聚甲醛，固定细胞。将培养板在室温下避光孵育15分钟。将两倍浓度的 8% 多聚甲醛直接加入感染培养基中，可防止病毒气溶胶化，否则若未固定的病毒直接倒入选废液皿中，可能发生气溶胶扩散。15 分钟后，通过将培养板倒置入废液皿中去除固定液。然后加入 100 µL 室温 PBS，并用光学透明粘性封板膜密封培养板。如果平板不能立即读数，请将其保存在4°C条件下。在读数前，务必先将密封的平板恢复至室温，以防止冷凝水影响分光光度计的测量结果。 为了定量病毒的生长，使用分光光度计测量终点荧光。每个孔进行四次测量，每条通道使用优化的增益设置。本视频中使用的Tecan Infinite M1000 Pro酶标仪会将原始荧光数据导出至Microsoft Excel文件。获取读数后，在Microsoft Excel中打开原始数据。然后将其复制并粘贴到 GraphPad Prism 结果表中。在 Prism 中计算复孔 TrpV 和 PLV 孔的平均值。随后，对每种处理条件，用 TrpV 孔的平均值减去 PLV 孔的平均值。为了便于与重复实验进行比较，将背景校正后的数据除以仅含载体（vehicle）的 TrpV 孔数据进行归一化处理。当实验重复多次后，进行单因素方差分析（one-way ANOVA）及多重比较事后检验，以确定每种通道中是否有任何处理条件与 DMSO 处理组存在显著差异。进行动力学检测时，感染细胞并按前述方法加入待测化合物，此时尤其重要的是使用缓冲培养基，以在不添加 5% 二氧化碳的条件下维持合适的 pH 值。用粘性封板膜密封后，将培养板放入已平衡至 37 摄氏度的酶标仪腔室中。必须特别注意始终保持培养板处于 37 摄氏度环境中，以避免细胞受到不必要的应激反应以及产生冷凝水。 手动设置酶标仪增益以防止后期时间点信号饱和。在感染后每小时检测一次，持续八至24小时，并按照终点法检测进行归一化处理。可采用与前述终点法检测相似的统计方法，对各个时间点进行显著性分析。为了比较抑制位点，将感染TrpV或PLV痘苗病毒的HeLa细胞在存在痘病毒抑制剂AraC、IBT、利福平和ST 246的条件下培养。该延时电影显示了在对照细胞中病毒生长期间绿色、红色和蓝色荧光团的依次表达。当在DNA复制阻断药物AraC存在下感染时，早期绿色荧光团如前所述产生，但中期和晚期的红色及蓝色荧光表达则不发生。光谱法定量分析显示，用araC处理的细胞早期基因表达增加了210%，但缺乏中期和晚期基因表达。在存在IBT的情况下感染的细胞中，由于IBT被认为可促进通读转录，其中期和晚期基因表达水平分别为对照组的24.7%和2.9%。在存在ST246和利福平的情况下感染的细胞，由于这两种药物在病毒粒子组装和成熟阶段抑制晚期基因表达之后的过程，其基因表达水平与对照组相比无显著差异。这些结果与这些化合物已知的作用机制一致，表明TrpV报告病毒可用于鉴定未知化合物抑制病毒复制的具体阶段。进行该实验操作时，务必记得设置适当的对照组。这不仅有助于对实验结果进行正确的归一化处理，还能帮助确定实验化合物的潜在作用机制。请注意，操作痘苗病毒可能具有极高危险性，务必穿戴适当的个人防护装备，并严格遵循推荐的生物安全二级（BSL-2）防护措施。

vaccinia-reporter-viruses-for-quantifying-viral-function-at-all

Research

科研

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学与感染

牛痘病毒记者量化病毒功能在基因表达的各个阶段

HeLa 细胞的痘苗病毒感染实验方案及宿主与病毒基因表达分析。第 1 部分（共 3...

痘苗病毒侵染及病毒基因表达的时间进程分析：第一部分

HeLa细胞感染痘苗病毒及宿主与病毒基因表达分析的实验方案。第2部分（共3部分）。...

痘苗病毒感染及病毒基因表达的时间分析：第二部分

海拉细胞感染痘苗病毒及宿主与病毒基因表达分析的实验方案。第3部分描述了通过氨基烯丙基偶联染料对宿主和病毒样本的扩增RNA进行荧光标记的过程。共3部分，第3部分。...

痘苗病毒感染及病毒基因表达的时间分析：第3部分

通过基于细胞的全基因组功能缺失RNA干扰筛选，可以鉴定出参与病毒感染的新型宿主因子。Drosophila 细胞培养模型特别适用于该方法，因为其RNA干扰操作简便且效率高。本文以痘苗病毒（vaccinia...

RNAi 筛选参与痘苗病毒（Vaccinia）感染的宿主因子：利用果蝇（Drosophila）细胞

本视频演示了一种 体外 检测乙型肝炎病毒（HBV）感染的技术 通过...

一种用于检测病毒感染的体外重组病毒报告系统

本视频展示了一种利用表达重组荧光素酶和荧光蛋白的双报告流感病毒A在小鼠模型中追踪病毒感染的方法。该方法可同时用于活体（in vivo）和离体（ex...

一种带有荧光素酶-荧光报告基因的流感病毒用于追踪病毒感染

本视频展示了一种用于研究痘病毒感染细胞中翻译调控的检测方法。将未感染和病毒感染的细胞共同转染编码萤火虫荧光素酶（Fluc）和海肾荧光素酶（Rluc）的mRNA，其中Fluc mRNA含有5'端Poly(A)前导序列。在向裂解细胞加入生物发光底物后，检测两种荧光素酶的信号，以确定由前导序列赋予Fluc...

一种用于研究痘病毒感染细胞中翻译调控的荧光素酶报告基因检测方法

一种快速且模块化的方案，用于生成表达荧光蛋白的重组痘苗病毒 此处描述了使用瞬时显性选择方法同时标记蛋白质的技术。...

高效生成荧光标记的痘苗病毒蛋白的方法学

我们介绍一种利用体外转录RNA为基础的荧光素酶报告基因检测方法，用于研究痘病毒感​​染细胞中mRNA翻译的调控。该检测方法可用于研究mRNA的顺式作用元件（cis-elements）对翻译的调控，包括5’-非翻译区（UTR）和3’-UTR。此外，该方法也可用于分析不同的翻译起始模式。...

基于体外转录RNA的荧光素酶报告基因检测法研究痘病毒感染细胞中的翻译调控

甲型流感病毒（IAV）是具有传染性的呼吸道病原体，可引起每年的流行和偶发的大流行。本文介绍了一种利用新型重组荧光素酶和荧光双报告甲型流感病毒（BIRFLU）在活体中追踪病毒感染的实验方案。该方法为研究人员提供了在活体内研究甲型流感病毒的优良工具。...

一种用于活体成像与病毒侵染定量检测的荧光素酶-荧光报告流感病毒

本方案利用表达荧光素酶和荧光蛋白的重组（r）SARS-CoV-2 及其 体内 在K18-hACE2转基因小鼠中使用成像系统（IVIS）以克服研究SARS-CoV-2感染所需的次级方法 体内.

利用报告基因表达的重组SARS-CoV-2对K18 hACE2转基因小鼠进行病毒感染的活体成像与定量分析

了解利用三重报告基因牛痘病毒实时测量病毒感染性和基因表达的方法。该技术可识别小分子抑制剂影响的病毒复制特定阶段，为抗病毒策略研究提供重要工具。

用于量化基因表达各阶段病毒功能的痘苗病毒报告病毒

探索更多视频