用于量化基因表达各阶段病毒功能的痘苗病毒报告病毒

本实验的总体目标是确定化学处理影响病毒基因表达的阶段。为此，将组织培养细胞接种并培养至完全融合。随后，使用三重报告基因痘苗病毒或不含启动子的对照病毒对细胞进行感染。

随后加入处理化合物，并将细胞孵育18小时，以完成病毒基因表达的所有阶段。然后使用酶标仪测定产生的荧光信号。最终可获得结果，显示实验化合物引起的基因表达相对变化。

与表达单一荧光融合蛋白的病毒感染相比，该技术的主要优势在于，这一系列病毒能够提供更多关于特定治疗药物作用于病毒生命周期中哪个阶段的信息，从而揭示其作用机制。尽管该方法可用于鉴定病毒入侵的抑制剂，也可用于检测病毒在非许可性细胞系或RNA干扰筛选中完成复制的阶段，进而鉴定感染所必需的宿主细胞因子。本方案采用三重病毒（TrpV）多阶段报告病毒，该病毒将三种光谱上可区分的荧光蛋白整合到单个痘苗病毒的双链基因组中。

这些荧光蛋白各自受特定发育阶段启动子的精确调控：C 11 R 启动子驱动 Venus 的早期表达，G eight R 中期启动子调控 m-cherry 的表达，F 17 R 启动子则介导 tag BFP 的晚期表达。因此，在感染过程中，Venus、m-Cherry 和 tag BFP 依次表达。

作为对照，使用无启动子的病毒。PLV 包含与 TrpV 中相似的 Venus 结构，但不含功能性转录启动子。

首先，将培养在10厘米培养皿上的HeLa细胞进行消化，然后用生长培养基将细胞稀释至大约每毫升2.0 × 10⁵个细胞。接着，将100 µL细胞悬液加入黑色壁透明平底96孔板的每个孔中。将细胞置于含5% CO₂的37 °C培养箱中培养24小时，直至细胞达到完全汇合。为稀释病毒，将TrpV和PLV在37 °C水浴中解冻，随后超声处理5分钟以分散聚集体。然后，将病毒原液用已预热至37 °C的感染培养基稀释至1.0 × 10⁷ PFU/mL。

为了感染细胞，将每孔中的培养基替换为50微升稀释后的病毒液。每种处理条件下，用TrpV感染三个重复孔，另用PLV感染三个重复孔，以校正每种处理特有的背景荧光。此步骤定义为感染后0小时（time equals zero hours post-infection）。例如，为6个96孔板（每孔50微升）配制共350微升病毒液。每种化合物应稀释至最终浓度的两倍，因为其将被加入到孔中已有的接种液体积中。接下来，针对每种处理条件，通过将实验化合物或对照溶剂（如PBS或DMSO）稀释至足够的感染培养基中，配制两倍浓度的母液，体积需覆盖所有重复孔外加一孔的用量。请注意，实验组和仅含载体的对照组中溶剂的浓度应保持一致。例如，若你使用溶于DMSO的IBT（1微升/毫升），则你的载体对照组也应使用相同浓度的DMSO（1微升/毫升）作为对照。在加入病毒后立即按照本图所示，向每孔加入50微升含有目标处理化合物或对照化合物的感染培养基。

请注意，每种化合物均使用TrpV和PLV进行三次重复测试，每种病毒均设置三次重复的溶剂对照。

在37摄氏度、含5%二氧化碳的培养箱中孵育18小时。次日，向每孔已有的感染培养基中加入100微升8%多聚甲醛，固定细胞。将培养板在室温下避光孵育15分钟。

将两倍浓度的 8% 多聚甲醛直接加入感染培养基中，可防止病毒气溶胶化，否则若未固定的病毒直接倒入选废液皿中，可能发生气溶胶扩散。15 分钟后，通过将培养板倒置入废液皿中去除固定液。然后加入 100 µL 室温 PBS，并用光学透明粘性封板膜密封培养板。

如果平板不能立即读数，请将其保存在4°C条件下。在读数前，务必先将密封的平板恢复至室温，以防止冷凝水影响分光光度计的测量结果。

为了定量病毒的生长，使用分光光度计测量终点荧光。每个孔进行四次测量，每条通道使用优化的增益设置。本视频中使用的Tecan Infinite M1000 Pro酶标仪会将原始荧光数据导出至Microsoft Excel文件。获取读数后，在Microsoft Excel中打开原始数据。

然后将其复制并粘贴到 GraphPad Prism 结果表中。在 Prism 中计算复孔 TrpV 和 PLV 孔的平均值。随后，对每种处理条件，用 TrpV 孔的平均值减去 PLV 孔的平均值。为了便于与重复实验进行比较，将背景校正后的数据除以仅含载体（vehicle）的 TrpV 孔数据进行归一化处理。当实验重复多次后，进行单因素方差分析（one-way ANOVA）及多重比较事后检验，以确定每种通道中是否有任何处理条件与 DMSO 处理组存在显著差异。进行动力学检测时，感染细胞并按前述方法加入待测化合物，此时尤其重要的是使用缓冲培养基，以在不添加 5% 二氧化碳的条件下维持合适的 pH 值。

用粘性封板膜密封后，将培养板放入已平衡至 37 摄氏度的酶标仪腔室中。必须特别注意始终保持培养板处于 37 摄氏度环境中，以避免细胞受到不必要的应激反应以及产生冷凝水。

手动设置酶标仪增益以防止后期时间点信号饱和。在感染后每小时检测一次，持续八至24小时，并按照终点法检测进行归一化处理。可采用与前述终点法检测相似的统计方法，对各个时间点进行显著性分析。

为了比较抑制位点，将感染TrpV或PLV痘苗病毒的HeLa细胞在存在痘病毒抑制剂AraC、IBT、利福平和ST 246的条件下培养。该延时电影显示了在对照细胞中病毒生长期间绿色、红色和蓝色荧光团的依次表达。当在DNA复制阻断药物AraC存在下感染时，早期绿色荧光团如前所述产生，但中期和晚期的红色及蓝色荧光表达则不发生。

光谱法定量分析显示，用araC处理的细胞早期基因表达增加了210%，但缺乏中期和晚期基因表达。在存在IBT的情况下感染的细胞中，由于IBT被认为可促进通读转录，其中期和晚期基因表达水平分别为对照组的24.7%和2.9%。在存在ST246和利福平的情况下感染的细胞，由于这两种药物在病毒粒子组装和成熟阶段抑制晚期基因表达之后的过程，其基因表达水平与对照组相比无显著差异。这些结果与这些化合物已知的作用机制一致，表明TrpV报告病毒可用于鉴定未知化合物抑制病毒复制的具体阶段。

进行该实验操作时，务必记得设置适当的对照组。这不仅有助于对实验结果进行正确的归一化处理，还能帮助确定实验化合物的潜在作用机制。请注意，操作痘苗病毒可能具有极高危险性，务必穿戴适当的个人防护装备，并严格遵循推荐的生物安全二级（BSL-2）防护措施。