一种用于研究病原体诱导局部及全身慢性炎症的小鼠模型

以下实验方案的总体目标是利用生理相关性良好的动物模型，在体内研究微生物感染对慢性炎症的影响。通过口服感染小鼠牙龈卟啉单胞菌（porphyromonas gingivalis），诱导局部和全身性慢性炎症。随后可采用磁共振成像（MRI）在活体动物中检测全身性炎症的进展，通过显微CT评估局部炎症引起的骨质流失，并在处死动物后利用脂质染色对动脉粥样硬化斑块进行原位可视化观察。

最终，可以通过显微CT分析和面部脂质染色分别测量牙龈卟啉单胞菌感染小鼠与未感染对照小鼠之间在牙槽骨体积差异和动脉粥样硬化斑块积聚方面的变化。本动物模型的主要优势在于，它可使您研究慢性炎症过程中涉及的宿主与病原体机制，特别是感染远端部位的机制。因此，您可以利用转基因小鼠和已定义的细菌突变株，同时观察感染的局部部位和全身性部位。

该模型有助于确定发病机制的关键方面，例如参与疾病发生的宿主和微生物因素。尽管该方法可揭示炎性骨质流失和动脉粥样硬化中涉及的特定宿主与病原体机制，但也可适用于其他小鼠疾病模型，包括类风湿性关节炎、糖尿病和癌症。这是波士顿大学的高场强磁共振成像核心设施，我的博士后同事Ning将演示小鼠成像的若干步骤。首先将冻存的牙龈卟啉单胞菌381（Porphyromonas gingivalis 381）在厌氧血琼脂平板上划线接种，并将平板置于37摄氏度的厌氧培养箱中孵育。

培养三到五天后，用平板上生长的菌落接种5毫升脑心浸液肉汤（BHI）液体培养基。过夜培养后，将菌液转接到45毫升BHI培养基中，在厌氧条件下继续培养18至24小时。在对数中期，于室温下以7,000 ×g离心10分钟收集细菌，弃上清。用50毫升PBS洗涤菌体沉淀三次后，使用血清移液管将沉淀充分重悬于5毫升PBS中，调整菌液浓度，使培养物1:10稀释后的660纳米处光密度（OD）值为1.0。

然后向足量的中等黏度羧甲基纤维素中加入，使其达到2%（重量/体积）的溶液，并在涡旋振荡的同时缓慢将羧乙基纤维素加入细菌悬液中，以避免结块。为检测C2中炎症的进展，首先将固定装置置于30毫米垂直探针中，使小鼠头部呈仰卧位，并将其放入11.7 T MRI扫描仪的垂直孔腔内。

完成匀场和调谐步骤后，使用一个罕见序列采集三个正交方向的定位图像，以生成轴向、冠状和矢状图像。随后，先采用低分辨率磁共振血管成像确认所采集图像位于目标区域，再对无名动脉进行高分辨率磁共振血管成像，使用未门控的3D梯度回波序列，参数如下： slab 厚度为 1.5 厘米，翻转角为 45 度，重复时间 20 毫秒，回波时间 2.2 毫秒，视野 1.5 × 1.5 × 1.5 厘米，矩阵 128 × 128 × 128，平均次数为 4，总扫描时间约为 22 分钟。

然后选择锁骨下动脉分叉下方0.3至0.5毫米处的命名动脉的轴向图像进行ROI分析。固定主动脉时，需始终使其组织保持在PBS溶液中。首先将主动脉按解剖位置放置，使主动脉球部位于左侧。随后依次在以下五个位置放置临时Mnuchin针：主动脉弓第三分支下方的主动脉顶端、降主动脉中段、靠近降主动脉末端处，以及股动脉分支上方。

接下来，使用超细弹簧剪从股动脉左支开始，沿腹主动脉左侧向上剪至升主动脉最下分支的下方。剪开各分支并用针固定以暴露其内表面后，继续固定组织。整个内表面从上方清晰可见，且无固定针造成的视觉干扰。

为了染色脂质并定量分析病变，首先用新配制的苏丹四或油红O溶液覆盖固定好的主动脉。50分钟后，用70%异丙醇洗涤组织1至5分钟，然后用双蒸水轻轻冲洗主动脉，直至从组织流出的水不再呈红色为止。接着，用PBS覆盖主动脉，并在组织旁放置一把尺子，以辅助图像校准。

然后使用连接在体视显微镜上的高分辨率相机拍摄组织图像，并将图像保存为 TIFF 文件。最后，在图像分析软件中手动勾勒每条内膜表面以测定其面积。随后，通过自动化的颜色阈值分割法计算病灶面积：为每幅图像设定阈值，定义能够区分病灶区域与正常区域的颜色强度。

随后可在该代表性实验中计算感染牙龈卟啉单胞菌的小鼠动脉内膜表面被动脉粥样硬化病变覆盖的百分比。体积分析显示，与未感染的对照组相比，感染小鼠表现出显著的骨质流失。对重建的半上颌骨进行肉眼观察，表明与对照组及易患动脉粥样硬化的小鼠相比，感染小鼠的磨牙根部暴露表面积增加。

POE 缺陷小鼠。牙龈卟啉单胞菌可诱导慢性炎症，这种炎症在末次感染后仅 24 小时即可导致牙槽骨吸收以及主动脉窦和某一命名动脉内炎症性斑块的沉积，该过程可通过感染后不同时间点的系列活体磁共振成像（MRI）在活体小鼠中进行监测，如这些代表性图像所示。进一步通过对苏丹 IV 染色的主动脉进行表面测量表明，牙龈卟啉单胞菌感染显著增加了内膜表面的脂质沉积和病变区域面积。

此外，对主动脉窦病变进行免疫组织化学分析显示，感染小鼠的巨噬细胞浸润增加，并且天然免疫受体Toll样受体2的表达水平升高。在实施该实验时，需注意评估炎症的时间点应与疾病进展过程相适应。在完成磁共振成像后，可进一步采用其他方法，如整体染色或免疫组织化学，以回答其他科学问题，例如全身动脉粥样硬化负荷或病变中的细胞组成成分。

观看本视频后，您应该能够充分理解一种活体小鼠模型，该模型可用于研究慢性炎症过程中涉及的宿主因素和致病因素。请务必注意，操作病原体可能具有极高危险性，在进行本实验操作时，应始终采取适当防护措施，例如正确使用个人防护装备（PPE）。