Name: 鼠标型号病原体引起的慢性炎症局部及全身站点 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-08-08T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 52 s
Description: 了解使用牙龈卟啉单胞菌口腔感染小鼠建立慢性炎症模型的方法。通过MRI和显微CT技术评估局部牙槽骨吸收及全身动脉粥样硬化斑块形成，为研究感染与宿主免疫机制提供可靠的动物实验平台。

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本工作获得了美国国家过敏与传染病研究所授予 C.A.G. 的资助项目 P01 A1078894 的支持。

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作者声明不存在任何竞争性经济利益。

P. gingivalis 口腔感染模型为研究病原体在局部和全身部位诱导的慢性炎症提供了有价值的工具。该独特模型可用于表征宿主和病原体特异性机制，这些机制共同参与慢性炎症和免疫病理过程。此外，该模型还可用于筛选新型治疗策略，包括免疫接种和药物干预。本方案所述步骤详细描述了该模型的成功应用，并阐述了评估P. gingivalis诱导的慢性炎症的起始、进展及结局的方法学。
在使用本方案研究炎症性骨丢失时，有几个关键方面需要注意。首先，应当注意，P. gingivalis 感染的结果由三个关键因素决定：1）宿主对感染的遗传易感性；2）病原体的毒力（病原体的遗传特性）；以及 3）宿主与病原体之间的相互作用（两个基因组之间的相互作用）。小鼠对 P. gingivalis 诱导的牙槽骨丢失具有遗传决定的易感性，因此在选择实验小鼠品系时必须谨慎17。利用近交系小鼠在宿主反应上的差异，可开展正向遗传筛选，以鉴定参与病原体诱导的慢性炎症易感性与抗性相关的基因。此外，不同 P. gingivalis<...

慢性炎症是导致病理性组织损伤的主要因素，也是人类多种慢性疾病的共同特征。这些疾病包括肿瘤性疾病、自身免疫性疾病和慢性炎症性疾病1。许多慢性疾病的病因尚不明确，但已知其成因复杂且为多因素所致，涉及遗传易感性以及环境因素的共同作用。尽管炎症持续存在的机制仍不清晰，但免疫激活的细胞和分子特征与宿主对病原体反应中所观察到的模式存在显著重叠2。
越来越多的证据表明，微生物病原体感染与慢性炎症的发生、发展及其多种临床表现密切相关2,3。病原体可通过破坏宿主免疫系统并建立持续性感染，直接诱导和维持慢性炎症4。即使在病原体未持续存在的条件下，感染仍可能通过分子模拟引发针对自身抗原的自身免疫反应、改变自身抗原使其具有免疫原性，或通过组织损伤释放原本被屏蔽的宿主抗原，从而诱发慢性炎症。然而，极少有特定病原体被确认为某种特定慢性疾病的普遍病因。相反，现有大多数数据表明，在遗传易感宿主中，不同病原体通过各自独特的机制引发慢性炎症，导致广泛的临床表现和疾病结局3。因此，深入理解特定病原体诱导慢性炎症的具体机制，对于公共卫生以及多种慢性疾病的治疗和预防具有重要意义。
尽管宿主与病原体特异性机制在慢性炎症的诱导与维持中的作用尚不明确，但病原体诱导慢性炎症模型的研究进展已开始加深我们对这些过程的理解。P. gingivalis 口腔感染模型是一种独特且已被充分表征的小鼠模型，可用于研究宿主与病原体特异性机制在局部（口腔骨质流失）和全身性部位（动脉粥样硬化）引发慢性炎症中的作用5,6。
P. gingivalis 是一种革兰氏阴性、厌氧的口腔病原体，与人类牙周病相关。牙周病是一种由感染引发的慢性炎症性疾病，其特征是牙齿支持组织的破坏7。除了在感染初始部位引起病理变化外，越来越多的证据表明，P. gingivalis 诱导的慢性炎症还参与了包括动脉粥样硬化5在内的多种全身性疾病的发病与进展。动脉粥样硬化是一种以动脉血管壁慢性炎症为特征的疾病。在无特定病原体小鼠中进行 P. gingivalis 口腔感染，可引发局部炎症反应，导致牙齿支持性牙槽骨的破坏8。P. gingivalis 可在感染后小鼠口腔中持续检出长达42天8，且小鼠体内可产生高水平的病原体特异性血清抗体滴度9。在利用载脂蛋白E-/-小鼠（ApoE-/-）建立的动脉粥样硬化小鼠模型中，P. gingivalis 的口腔感染可诱发慢性炎症，促进主动脉窦10和无名动脉11内的炎性斑块沉积。P. gingivalis 感染小鼠无名动脉内的进行性炎症可通过活体 in vivo MRI 在活体动物中进行监测。组织学上，P. gingivalis 感染小鼠的动脉病变表现为脂质积聚增加，同时伴有血管内皮细胞活化、免疫细胞浸润增多以及炎症介质表达水平升高12。在基因敲除小鼠中应用该模型，已阐明宿主信号通路组分和炎症介质的作用，以及驱动 P. gingivalis 诱导免疫病理过程的细胞特异性相互作用12–14。此外，利用特定细菌突变株开展的实验已鉴定出多个对局部和全身慢性炎症至关重要的 P. gingivalis 毒力因子15。
本文详细介绍了用于评估的方法学 P. gingivalis诱导的局部和全身性慢性炎症。我们提供了使用Amira软件通过显微CT分析牙槽骨吸收的详细实验方案。此外，我们阐述了连续切片 体内 用于评估无名动脉内进行性炎症的活体动物磁共振成像。我们提供了动脉病变中炎症斑块的可视化与定量方法，并描述了其组织学特征。利用转基因小鼠和特定的细菌突变株，该模型特别适用于鉴定参与疾病起始、进展及结局的宿主与微生物因素。此外，该模型还可用于筛选新的治疗策略，包括疫苗接种和药物干预。

<table><tbody><tr><td>Amira 分析软件</td><td>Visualization Sciences Group</td><td></td><td></td></tr><tr><td>厌氧培养箱 DW Scientific 型号 MG500&amp;nbsp;</td><td>Microbiology International</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BHI&amp;nbsp;</td><td>Becton-Dickinson&amp;nbsp;</td><td>211059</td><td></td></tr><tr><td>血红素&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>51280-5G</td><td></td></tr><tr><td>甲萘醌（维生素 K）</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>M5625-25G</td><td></td></tr><tr><td>酵母提取物</td><td>Becton-Dickinson&amp;nbsp;</td><td>212750</td><td></td></tr><tr><td>羧甲基纤维素（中等黏度）&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>C-4888</td><td></td></tr><tr><td>复方磺胺甲噁唑口服混悬液 200 mg/40 mg 每 5 ml</td><td>Hi-Tech Pharmacal</td><td>NDC 50383-823-16</td><td></td></tr><tr><td>&amp;mu;CT 40&amp;nbsp;</td><td>Scanco</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HistoChoice 组织固定液</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>H2904</td><td></td></tr><tr><td>苏丹 IV</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>S4261-25G</td><td></td></tr><tr><td>垂直腔 11.7T Avance 波谱仪&amp;nbsp;</td><td>Bruker</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Paravision</td><td>Paravision</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>NIH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>大鼠抗小鼠 F4/80 抗体</td><td>Serotec</td><td>MCA497R</td><td></td></tr><tr><td>大鼠抗小鼠 TLR2 抗体</td><td>eBioscience</td><td>13-9021-80</td><td></td></tr><tr><td>Leica S4 解剖显微镜</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microm HM 550 冷冻切片机</td><td>Microm</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

一种用于研究病原体诱导局部及全身慢性炎症的小鼠模型

A Mouse Model for Pathogen-induced Chronic Inflammation at Local and Systemic Sites

慢性炎症是导致病理性组织损伤的主要因素，也是人类多种慢性疾病（包括肿瘤性疾病、自身免疫性疾病和慢性炎症性疾病）的共同特征。越来越多的证据表明，病原体诱导的慢性炎症在具有多种临床表现的慢性疾病的发生和发展中起着重要作用。由于慢性疾病的病因复杂且涉及多种因素，在人体中设计实验证明其因果关系并建立机制性联系几乎不可能。使用动物模型的一个优势在于，可以控制可能影响特定疾病进程的遗传和环境因素。因此，建立与感染相关的动物模型是识别宿主和病原体特异性机制的关键步骤，这些机制共同参与了慢性炎症的形成。
本文描述了一种小鼠模型，用于研究口腔病原菌Porphyromonas gingivalis感染后在局部和全身部位引发的慢性炎症。该细菌与人类牙周病密切相关。在无特定病原体的小鼠中，口腔感染可诱导局部炎症反应，导致支持牙齿的牙槽骨破坏，这是牙周病的典型特征。在已建立的动脉粥样硬化小鼠模型中，P. gingivalis感染会加速主动脉窦和无名动脉内炎症斑块的沉积，并伴随血管内皮细胞活化、免疫细胞浸润增加以及病灶内炎症介质表达升高。我们详细阐述了评估局部和全身炎症的实验方法。利用转基因小鼠和特定的细菌突变株，使该模型特别适用于鉴定参与疾病起始、进展及结局的宿主和微生物因素。此外，该模型还可用于筛选新的治疗策略，包括疫苗接种和药物干预。

采用合适的小鼠模型和口服感染方案，P. gingivalis 可在局部（口腔）和全身（动脉）部位诱导慢性炎症和免疫病理改变（图1）。
在小鼠中，经口感染P. gingivalis可诱导局部炎症反应，进而导致支持牙齿的牙槽骨破坏8。感染P. gingivalis的小鼠会产生针对该病原体的血清抗体反应，主要为IgG亚型9。图4所示结果代表了一项实验，其中C57BL/6小鼠每隔两天接受一次P. gingivalis感染，共感染三次，6周后处死，通过显微CT评估牙槽骨丧失情况。使用Amira软件进行容积分析显示，与未感染的对照组相比，P. gingivalis感染小鼠表现出显著的骨量丢失（图4A）。对重建的半上颌骨进行肉眼观察，可见感染小鼠的磨牙根部暴露表面积较对照组增加（图4B和图4C）。...

动物模型在阐明宿主和病原体特异性机制以促进慢性炎症发展方面已被证明是不可或缺的工具。本文描述了一种利用人类病原体牙龈卟啉单胞菌（Porphyromonas gingivalis）进行口腔感染的小鼠模型，并详细介绍了评估局部和全身部位炎症进展的方法。

慢性炎症是导致病理性组织损伤的主要因素，也是人类多种慢性疾病的共同特征，包括……

以下实验方案的总体目标是利用生理相关性动物模型，在体内研究微生物感染对慢性炎症的影响。通过口服感染小鼠牙龈卟啉单胞菌（porphyromonas gingivalis），诱导局部和全身性慢性炎症。随后可利用磁共振成像（MRI）在活体动物中检测全身性炎症的进展，通过显微CT评估局部炎症引起的骨质流失，并在处死动物后采用脂质染色法对动脉粥样硬化斑块进行可视化观察。最终，可以通过显微CT分析和面部脂质染色分别测量牙龈卟啉单胞菌感染小鼠与未感染对照小鼠之间在肺泡骨量差异和动脉粥样硬化斑块积聚方面的变化。本动物模型的主要优势在于，它可使您研究慢性炎症过程中涉及的宿主与病原体机制，特别是感染远端部位的机制。因此，您可利用转基因小鼠和已定义的细菌突变株，同时考察感染的系统性部位和局部部位。该模型有助于识别发病机制的关键方面，例如参与疾病发生的宿主和微生物因素。尽管该方法可揭示炎症性骨质流失和动脉粥样硬化中涉及的特定宿主与病原体机制，但也可适用于其他小鼠疾病模型，包括类风湿性关节炎、糖尿病和癌症。这是波士顿大学的高场强磁共振成像核心设施，我的博士后同事Ning将演示小鼠成像的若干步骤。首先将冻存的牙龈卟啉单胞菌381（*Porphyromonas gingivalis* 381）在厌氧血琼脂平板上划线接种，并将平板置于厌氧培养箱中，于37°C条件下孵育。培养三到五天后，用平板上生长的菌落接种5毫升脑心浸液肉汤（brain heart infusion broth，BHI）液体培养基。过夜培养后，将菌液转接到45毫升BHI培养基中，在厌氧条件下继续培养18至24小时。在对数中期，于室温下以7,000 ×g离心10分钟收集细菌，弃上清。用50毫升磷酸盐缓冲液（PBS）将菌体沉淀洗涤三次后，使用血清移液管将菌体充分重悬于5毫升PBS中，调整浓度使菌液经1:10稀释后在660纳米处的光密度值（OD）为1.0。然后加入足量的中等黏度羧甲基纤维素，配制成2%（重量/体积）的溶液，并在涡旋振荡的同时缓慢将羧乙基纤维素加入细菌悬液中，以避免结块。为检测C2中炎症的进展，首先将固定装置连同呈仰卧位的小鼠头部一起放入30毫米垂直探头，并置入11.7 T MRI扫描仪的垂直孔腔中。完成匀场和调谐步骤后，使用特殊序列获取沿三个正交方向的定位像，以生成轴向、冠状和矢状图像。随后，先采用低分辨率磁共振血管成像确认所获取图像位于目标区域，再对无名动脉进行高分辨率磁共振血管成像，使用未门控的3D梯度回波序列，具体参数如下： slab 厚度为 1.5 cm，翻转角为 45°，重复时间（TR）为 20 ms，回波时间（TE）为 2.2 ms，视野（FOV）为 1.5 cm × 1.5 cm × 1.5 cm，矩阵为 128 × 128 × 128，平均次数为 4，总扫描时间约为 22 分钟。然后选择锁骨下动脉分叉下方0.3至0.5毫米处的命名动脉的轴向图像进行ROI分析。固定主动脉时，需始终用PBS覆盖组织。首先将主动脉按解剖位置放置，使主动脉球位于左侧。随后依次在以下五个位置放置临时Mnuchin针：主动脉弓第三分支下方的主动脉顶端、降主动脉中段、靠近降主动脉末端处，以及股动脉分支上方。接下来，使用超细弹簧剪从股动脉左支开始，沿腹主动脉左侧向上剪至升主动脉最下分支的下方。剪开各分支并用针固定以暴露其内表面后，继续固定组织。整个内表面完全暴露，从上方清晰可见，且无固定针造成的视觉干扰。为了染色脂质并定量分析病变，首先用新配制的苏丹四或油红O溶液覆盖固定好的主动脉。50分钟后，用70%异丙醇洗涤组织1至5分钟，然后用双蒸水轻轻冲洗主动脉，直至从组织流出的水不再呈红色为止。接着，用PBS覆盖主动脉，并在组织旁放置一把尺子，以辅助图像校准。然后使用连接在体视显微镜上的高分辨率相机拍摄组织图像，并将图像保存为TIFF文件。最后，在图像分析软件中手动勾画每条内膜表面以测定其面积。随后，通过自动颜色阈值法计算病灶面积时，需为每幅图像设置阈值，以定义能够区分病灶区域与正常区域的颜色强度。随后可在该代表性实验中计算感染牙龈卟啉单胞菌的小鼠动脉内膜表面被动脉粥样硬化病变覆盖的百分比。体积分析显示，与未感染的对照组相比，感染小鼠表现出显著的骨质流失。对重建的半上颌骨进行肉眼观察，表明与对照组及易患动脉粥样硬化的小鼠相比，感染小鼠的磨牙根部暴露表面积增加。POE 缺陷小鼠。牙龈卟啉单胞菌可诱导慢性炎症，这种炎症在末次感染后仅 24 小时即可导致牙槽骨丧失以及主动脉窦和某一命名动脉内炎症性斑块的沉积，该过程可通过在感染后不同时间点对活体小鼠进行连续活体磁共振成像（MRI）来监测，如这些代表性图像所示。进一步通过对苏丹 IV 染色的主动脉进行表面测量表明，牙龈卟啉单胞菌感染显著增加了内膜表面的脂质沉积和病变区域面积。此外，对主动脉窦病变进行免疫组织化学分析显示，感染小鼠的巨噬细胞浸润增加，且天然免疫受体Toll样受体2的表达水平升高。在实施该实验时，需注意评估炎症的时间点应与疾病进展过程相匹配。在完成磁共振成像后，可进一步采用其他方法，如整体染色或免疫组织化学，以回答其他科学问题，例如全身动脉粥样硬化负荷或病变中的细胞组成成分。观看本视频后，您应该能够充分理解一种活体小鼠模型，该模型可用于研究慢性炎症过程中涉及的宿主因素和致病因素。请务必注意，操作病原体可能具有极高危险性，在进行本实验操作时，应始终采取适当防护措施，例如正确使用个人防护装备（PPE）。

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小鼠类风湿性关节炎的过继转移模型

本文描述了两种不同的手术注射模型，用于在小鼠附睾的起始段（间质注射）和附睾尾部（管内注射）诱导炎症刺激。这些方法可用于研究附睾不同区域的部位特异性反应。...

由病原体相关分子模式诱导的附睾炎小鼠模型

了解使用牙龈卟啉单胞菌口腔感染小鼠建立慢性炎症模型的方法。通过MRI和显微CT技术评估局部牙槽骨吸收及全身动脉粥样硬化斑块形成，为研究感染与宿主免疫机制提供可靠的动物实验平台。

一种用于研究病原体诱导局部及全身慢性炎症的小鼠模型

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