Name: 牛龙在生物医学研究：视觉引导支气管镜，支气管内接种和在体内抽样技术 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-07-03T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 1 s
Description: 了解牛支气管镜技术用于研究呼吸道感染中的宿主-病原体相互作用。本方法通过支气管内接种、支气管肺泡灌洗和经支气管肺活检，在犊牛模型中实现重复采样和疾病进展监测。

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作者非常感谢德国联邦教育与研究部（BMBF）对其工作的资助。同时，作者感谢伊内斯·莱姆塞尔（Ines Lemser）、西尔克·施塔尔贝格（Sylke Stahlberg）、英戈尔夫·吕克纳格尔（Ingolf Rücknagel）以及动物房团队（FLI，德国）的所有其他同事在支气管镜检查方面提供的技术支持。作者非常感谢玛丽亚-克里斯蒂娜·哈泽（Maria-Christina Haase）（FLI，德国）在文献提供方面给予的帮助。此外，作者谨向安吉拉·贝尔特博士（Dr. Angela Berndt）（FLI，德国）和威斯康星河瀑大学（University of Wisconsin-River Falls）的尼科莱特·贝斯图尔（Nicolette Bestul）致以诚挚谢意，感谢她们对稿件的审阅与批评指正。

伦理声明 
本研究严格遵循欧洲及国家有关动物护理与使用的法律法规。实验方案经德国图林根州动物实验伦理与动物保护委员会批准（许可编号：04-004/11）。所有实验均在机构指定的动物保护负责人监督下进行。支气管镜检查严格在全身麻醉下实施。研究过程中，尽一切努力最大限度减少动物的不适或痛苦。
一般注意事项 
所描述的技术适用于约6至8周龄、体重约60至80公斤的犊牛。若用于其他大型动物物种或年龄及体重不同的犊牛，必须根据动物的体型、体重以及特定物种的肺部解剖结构对技术进行相应调整。所有使用的设备必须无菌。 鹦鹉热衣原体 是一个&#160;人畜共患细菌，可导致人类呼吸系统疾病和全身性疾病。非禽类 C. psittaci 本方案中使用的菌株DC15必须在生物安全二级条件下操作。所有涉及病原体及感染动物的操作均须佩戴个人防护装备，例如呼吸器、防溅防泼水连体服、橡胶靴和手套。佩戴合适的呼吸器尤为重要，因为该病原体的自然感染途径为 C. psittaci 是气溶胶传播的。样本的包装和标签必须能够耐受消毒剂，因为所有物品在离开动物饲养区域前，必须根据制造商说明书使用对衣原体有效的消毒剂进行处理。
1. 支气管镜检查前的动物准备
<ol>
	<li>根据小牛体重确定麻醉剂的给药剂量。</li>
	<li>在左侧颈静脉建立静脉（IV）通路。</li>
	<li>首先，在约30秒内缓慢注射赛拉嗪（0.2 mg/kg体重），待动物镇静后，再注射氯胺酮（2.0 mg/kg体重）。&#160;</li>
	<li>将动物抬至手术台，并使其呈右侧卧位。动物在台面上妥善安置后，检查静脉通路是否仍处于原位，必要时进行调整。在麻醉期间，应定期检查眼睑反射，以判断麻醉深度。</li>
	<li>待动物呼吸平稳后，由助手拉出舌头并伸展颈部。将金属管状开口器置入动物口中，并轻轻旋转推进。在手电筒照明下直视控制前进方向，直至可见喉部结构。</li>
	<li>在整个内镜操作过程中，根据需要追加7 mg赛拉嗪和70 mg氯胺酮的推注剂量，以维持麻醉状态。</li>
</ol>
2. 接种（接种部位：图1）
<ol>
	<li>制备 3&#160;含有1、2和5 ml接种物的注射器</li>
	<li>将聚四氟乙烯管插入内窥镜的工作通道中，确保导管末端不从内窥镜前端突出。</li>
	<li>将内窥镜插入金属窥器中。可能需要对窥器进行轻微调整，以使内窥镜顺利通过喉部。 气管支气管向右侧分支的部分有助于调整显示器上的图像。</li>
	<li>将装有5 ml接种物的注射器连接至聚四氟乙烯管末端。将导管插入需接种的支气管分支，注入所需剂量（右肺： 中叶: 0.5&#160;毫升 副叶: 0.5&#160;毫升 尾状叶: 0.5&#160;毫升和1.0&#160;毫升；左肺： 颅叶, 颅部: 0.5&#160;毫升 尾部: 0.5&#160;毫升 尾叶: 1.5&#160;毫升）。将带有1的注射器连接&#160;将 ml 接种物加入试管，然后移至 气管支气管 并接种接种物（颅叶，尾部: 1.0&#160;毫升）。建议始终按照相同的顺序进行定位。</li>
	<li>移除内窥镜和窥器。</li>
	<li>使用喷雾装置将1 ml接种物喷入每个鼻孔。</li>
	<li>将动物送回畜舍，并使其呈俯卧位以苏醒。在动物恢复足够的意识、能够维持胸卧位之前，不得让其无人看管或与其他动物同处。恢复期间的畜舍应配备空调，因为动物在全身麻醉状态下体温调节能力会下降。 
	注意：首次临床症状通常在接种后约24–36小时出现，具体时间取决于所使用的病原体。</li>
</ol>
3. 取样步骤（取样地点：图2）
<ol>
	<li>按照步骤 1.1–1.6 所述准备动物。</li>
	<li>支气管肺泡灌洗
	<ol>
		<li>将 5 支各含 20 ml 无菌等渗盐水的注射器放入水浴中，加热至约 38 °C。</li>
		<li>将灌洗导管插入内窥镜的工作通道，然后将内窥镜插入金属扩张器，并向前推进至左肺主支气管，直至达到“楔入位置”，即内窥镜无法再向前推进的位置。</li>
		<li>依次将装有温热 NaCl&#160;溶液的注射器连接至灌洗导管，注入液体后立即吸出。支气管肺泡灌洗液必须收集于硅化玻璃瓶中，并在回收后立即置于冰上，以防止肺泡巨噬细胞黏附于玻璃表面。需记录注入盐水的总量及回收液体的量。</li>
		<li>将灌洗导管从工作通道中取出。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>支气管刷检
	<ol>
		<li>将内窥镜推进至目标采样部位，在本方案中为Bifurcatio tracheae。</li>
		<li>在将刷子插入内窥镜工作通道前，先用套管覆盖刷子，直至刷尖在监视器上可见。</li>
		<li>用塑料套管将刷子向前推进约 5&#160;cm，并通过推动手柄使刷子从塑料套管中伸出，然后将其引导至需刷检的部位。</li>
		<li>在轻轻推拉刷子的同时移动内窥镜，以确保刷子与支气管壁充分接触，从而刮取上皮细胞。一旦出现出血应立即停止刷检。在将刷子从工作通道中拉出前，需先用套管将其覆盖。</li>
		<li>通过在载玻片上轻轻滚动刷子，制备最多五张涂片。用冷甲醇固定涂片 10 分钟，空气干燥后于 -20 °C 保存。</li>
		<li>可根据采样细胞的用途，将刷子冲洗于不同介质中。若使用同一把刷子进行多次刷检，务必仅使用不会刺激黏膜的冲洗介质。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>经支气管肺活检
	<ol>
		<li>将内窥镜推进至目标采样部位，在本方案中为Lobus cranialis的Pars caudalis。在将活检钳插入工作通道前，先反复开合数次，以确保其功能正常。</li>
		<li>将活检钳推入Bronchus trachealis的尾侧分支，直至遇到轻微阻力。后撤 2–3 cm，打开活检钳，向前推进约 2 cm，闭合活检钳，再后撤并从工作通道中取出活检钳。此操作需要一定练习。</li>
		<li>使用针头或小型镊子小心地从活检钳上取下组织。根据组织后续用途，将其保存于液氮或合适的固定液中。组织取出后应立即处理，以防止自溶过程发生。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>术后处理
	<ol>
		<li>将动物送回畜舍，并使其处于俯卧位以苏醒。在动物恢复足够的意识、能够维持胸卧位之前，不得让其独处或与其他动物同处。恢复室应配备空调，因为动物在全身麻醉下体温调节能力会下降。</li>
		<li>在接下来的 24 小时内密切监测动物是否有气胸迹象。当动物完全清醒后，提供饲料和新鲜饮水。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

作者&#160;无任何披露信息。

已建立一种支气管镜接种方法，并对多种支气管镜采样技术进行了改良，以便在实验条件下用于大型动物。所述技术易于掌握，即使对内窥镜经验较少的检查者亦然。支气管镜检查过程具有微侵入性，且在任何受试动物中均未观察到与接种方法或所述采样方法（支气管肺泡灌洗、经支气管肺活检、支气管刷检）相关的不良反应。在人类中，经支气管肺活检相关的并发症包括出血和气胸48，但在接受该操作的犊牛中未见此类并发症。经支气管肺活检比经皮法更耗时，且需要更多设备，但其侵入性更小，且不存在伤口感染的风险。
这种通过内窥镜进行视觉控制的接种方法，可在肺部特定部位接种确定数量的病原体，因此在所有接种动物中可产生高度一致的临床和病理学结果32-34。然而，该方法并不能完全模拟犊牛自然感染的所有特征。在呼吸道C. psittaci感染模型中，所述接种技术导致的肺部病变与病原体接种部位相关34，而在自然感染情况下，犊牛通常表现为肺尖叶肺炎。在评估实验结果对于牛自然获得性肺部感染的相关性时，必须考虑这一差异。
视频内镜支气管肺泡灌洗可对肺部特定区域进行取样。与在盲视条件下使用鼻导管相比，该方法在实验研究中具有优势。由于牛肺的解剖结构特点，盲插导管多数情况下会进入右侧膈叶。53,54 且检查者无法控制灌洗的肺部区域。在侧卧位麻醉犊牛中进行内镜支气管肺泡灌洗的另一优势是灌洗液回收率较高，平均超过80%。与其他研究比较显示，在站立位镇静犊牛中，灌洗液回收量为133.3 ± 1.6 ml 46 和 127.13 ± 3.53 ml&#160;45 向尾叶灌注240 ml液体后进行报告。在胸卧位且处于镇静状态的小牛中，可从头叶回收51%的灌注液体，从尾叶回收62%的灌注液体。43这意味着在小腿直立位时，大约可回收一半灌注的液体。根据后续样本制备所需的支气管肺泡灌洗液（BALF）量，这可能不足以支持所有预期实验的开展。牛的支气管肺泡灌洗已被多个研究团队应用，并在不同条件下检测了多种参数。大多数作者对基底肺叶进行了灌洗。43,45,46，但不同研究团队用于灌洗的液体量存在差异。这导致回收的细胞、蛋白质及其他物质的稀释程度不一致，使得不同文献之间的研究结果难以比较。因此，针对牛的应用，建议采用五次、每次20 ml的灌洗方式即 总共100 ml）体温的等渗盐水，灌注后立即回收。使用大直径灌洗导管时（即 &#62;2 mm）时，需要略微增加每份的体积，具体取决于导管中残留液体的量。
牛肺高度分段的解剖结构带来了一定的方法学局限性：从肺部某一区域获得的结果可能并不适用于肺部其他区域。由于无法直观控制经支气管活检和灌洗所探测的整个肺部区域，检查者无法确定所取样本的部位是否健康或已发生病变。因此，非常重要的一点是在先前接种病原体的部位进行采样，以提高病原体的回收率，并增加采集到病变肺组织的可能性。另一个局限性是临床状况较差的动物在麻醉过程中风险增加。所描述的方法仅适用于轻度至中度疾病模型，以尽可能降低对动物的负担。反刍动物的全身麻醉应尽可能缩短时间，因为瘤胃内气体的产生会增加该类动物的麻醉风险。支气管镜检查后，动物必须立即置于俯卧位，以利于积聚气体的排出，并需密切监测，直至完全从麻醉中恢复。此外，所描述的技术不适用于间隔少于24小时的采样。
所述方案可适用于其他病原体。已有文献描述了通过内镜接种多种病原体的方法，例如C. psittaci32-34、Pasteurella haemolytica38-40,42、Haemophilus somni55以及牛病毒性腹泻病毒44。此外，病原体在肺部的接种部位也可根据所需模型进行调整。在选择采样部位时，需考虑以下几个重要因素：（i）采样部位应根据接种位置及预期的病理学发现来确定；（ii）若需进行剖检，必须保留足够的未采样肺组织区域，以便进行离体（ex vivo）采样；（iii）采样部位的选择必须确保所用设备能够到达；特别是经支气管肺活检，受活检钳长度限制，存在一定的操作局限性；（iv）采样顺序至关重要，支气管刷检和经支气管肺活检可能引起轻微出血，从而污染支气管肺泡灌洗液（BALF）。因此，BALF的采集必须始终优先进行。若将该方案应用于其他物种，必须考虑该物种特有的肺部解剖结构。

大型动物模型在生物医学研究中的价值
在现代跨学科生物医学研究中，动物模型对于阐明哺乳动物体内与健康或疾病状态相关的复杂相互作用仍然不可或缺。尽管已有17项诺贝尔奖授予了以牛、马、羊或家禽作为生物医学研究模型的科学家1，但如今绝大多数动物实验均使用啮齿类动物进行，而仅不到1%的研究采用家畜或大型动物。
小型动物具有诸多实际优势（即 低成本、遗传可塑性强、通量高、拥有大量可用的遗传学和免疫学工具与试剂盒，转基因小鼠模型通常被用于开展揭示特定分子通路的机制性研究。然而，在复杂生物系统的生物医学研究中，小鼠模型的生物学相关性和临床应用价值正变得越来越值得质疑。它们可能产生误导，并存在过度简化生物复杂性的风险2-9.
由于物种间的特殊性差异，没有任何单一动物物种能够完全模拟人类的情况，因此在跨学科的生物医学研究方法中，使用多种模型似乎更有利。在转化医学的背景下，大型动物可作为比较模型，提供对人类和动物健康均具有高度生物学相关性的双重用途结果1。值得注意的是，牛的基因组比实验啮齿类动物的基因组更接近人类基因组。最近的研究也证实，与其他分类群相比，小鼠基因组发生了更多的重排10-12。
在复杂的研究设计中，利用家畜可通过重复采集多种样本，提供进行个体内部长期研究的独特机会 体内 无需牺牲动物即可从同一个体进行多次取样。因此，可在一段时间内对同一受试对象的功能、炎症及形态学变化进行监测。13.
牛肺作为合适的呼吸系统模型
由于小鼠在肺部解剖结构、呼吸生理学和肺部免疫学方面存在大量显著差异，无法模拟人类肺部疾病的许多重要病理生理特征。因此，在将其用作呼吸系统疾病的动物模型时必须充分考虑这一局限性2,9,14-16。尽管每种哺乳动物肺部在解剖和结构上均有其独特性，但由于成年牛犊与人类的体重相近（50–100&#160;kg），其功能特征（即肺容积、气流和呼吸力学）之间的可比性更好。
牛肺的物种特异性特征总结如下：左肺由两个肺叶组成（颅叶，分为两个片段，以及 尾状叶），而右肺由四个叶组成（颅叶, 中叶， 尾状叶，以及 副叶）。与其他大多数哺乳动物的肺解剖结构不同，牛右肺尖叶的支气管直接起源于气管的右侧壁。在亚大体解剖结构方面，牛肺表现出高度的分叶性以及较高比例的间质组织。17,18 导致肺组织顺应性相对较低，肺组织阻力较高19因此，与其他物种相比，其所需的呼吸活性相对较高20,21高度的肺叶分隔导致肺段之间具有较强的独立性。因此，炎症过程被结缔组织隔膜所局限，病变肺段与健康肺段常共存于同一肺叶内。由于缺乏侧支通气途径，牛肺特别适合用于模拟阻塞性肺功能障碍。13关于牛肺的血管系统，小肺动脉具有非常明显的平滑肌层。因此，小牛也可作为肺动脉高压或血管重塑的成熟动物模型。22-24.
在呼吸道感染方面，家畜中存在一些自然发生的疾病，这些疾病与人类相应的疾病具有许多相似之处。典型的例子包括牛结核病25、犊牛的呼吸道合胞病毒（RSV）感染26-28，以及自然获得的Chlamydia感染29。因此，大型动物模型能够高度模拟自然宿主中的真实情况。因此，它们对于研究宿主-病原体相互作用以及相应人类疾病的复杂病理生理学过程具有重要价值30,31。
作为呼吸道Chlamydia psittaci感染的一种具有生物学相关性的模型，选择犊牛是因为牛是该病原体的天然宿主32-35。通过该模型获得的有关疾病发病机制或动物与人类之间可能传播途径的信息，将有助于拓展我们对牛和人类两方面疾病的认知。该模型还可用于验证普遍接受的和替代性的治疗方案，以清除肺部C. psittaci感染，这在兽医和人类医学中同样具有重要意义。
应用于牛呼吸系统的实验技术及可获取的样本类型
本文描述并图示了适用于牛肺的实验技术与诊断方法，这些方法在我们的模型中用于评估病原体对哺乳动物肺部的影响以及治疗干预措施的有效性。
支气管镜检查 自20世纪60年代以来已应用于人类医学，被认为是一种安全的操作36。在犊牛中，实验性支气管镜检查于1968年首次被描述37。Potgieter 等 提出，在视频内镜引导下向支气管内接种特定数量的病原体，是诱发犊牛下呼吸道疾病的一种可靠方法38，目前该方法已在牛科动物研究中广泛应用34,39,40。在视频内镜控制下将定量病原体直接接种至支气管内，可实现感染因子在肺部的靶向定位。这可使所有实验动物表现出一致的临床和病理学特征34，并允许对因病原体暴露而预期发生病变的肺区进行靶向采样。
支气管肺泡灌洗液 支气管肺泡灌洗液（BALF）是反映肺部炎症存在及严重程度的明确指标。支气管肺泡灌洗（BAL）是人类医学中诊断多种呼吸系统疾病的常规操作。41在活体牛中，支气管肺泡灌洗（BAL）由 Wilkie 和 Markham 于上世纪七十年代末首次引入42被认为是一种研究牛下呼吸道的安全且可重复的技术。由于缺乏关于健康动物支气管肺泡灌洗液（BALF）参数的充分数据，1988年Pringle 等 对健康犊牛使用可弯曲纤维支气管镜进行支气管肺泡灌洗。作者还指出，在实验条件下需要标准化支气管肺泡灌洗操作流程，以获得可比较的结果43. BAL 仍被用作一种 体内 犊牛采样方法44-46.
支气管刷检在人类医学中常作为一种诊断工具，用于采集肿瘤性病变样本或进行微生物学分析36。出于研究目的，可通过细胞学刷取获得上皮细胞的原代细胞培养物47。在牛中，已有文献描述使用支气管刷检进行微生物学分析，以表征肺部的微生物环境43。
经支气管肺活检可提供肺组织样本，是人类弥漫性肺疾病诊断的重要工具。医源性气胸和与操作相关的出血是该技术可能发生的并发症，据报道在人类患者中的发生率低于百分之一48。由于所需设备成本较高且获取活检样本耗时较长，经支气管肺活检在牛群中并不常用。相比之下，经皮肺活检在野外条件下更为便捷49-51。

<table><tbody><tr><td>兽用视频内窥镜</td><td>Karl Storz GmbH &amp;amp; Co. KG, Tuttlingen, Germany</td><td>PV-SG 22&amp;ndash;140</td><td>直径：9 mm，工作通道：2.2 mm，工作长度：140 cm</td></tr><tr><td>灌洗导管</td><td>Karl Storz GmbH &amp;amp; Co. KG, Tuttlingen, Germany</td><td></td><td>直径：2 mm；长度：180 cm，鲁尔锁接头</td></tr><tr><td>驱动器</td><td>WEPA Apothekenbedarf GmbH &amp;amp; Co KG, Hillscheid, Germany</td><td>32660</td><td>长度：60 mm</td></tr><tr><td>活检钳</td><td>Karl Storz GmbH &amp;amp; Co. KG, Tuttlingen, Germany</td><td>REF 60180LT</td><td>1.8 mm，锯齿状，椭圆形</td></tr><tr><td>Omnifix 20 ml，鲁尔锁</td><td>B. Braun Melsungen AG, Melsungen, Germany</td><td>4617207V</td><td></td></tr><tr><td>细胞学刷</td><td>mtp GmbH, Neuhausen ob Eck, Germany</td><td>110240-10</td><td>工作长度：180 cm，刷头长度：15 mm，直径：1.8 mm</td></tr><tr><td>静脉通路</td><td>Henry Schein Vet GmbH, Hamburg, Germany</td><td>370-211</td><td>直径：1.2 mm；长度：43 mm</td></tr><tr><td>Rompun 2%（赛拉嗪）</td><td>Bayer Vital GmbH, Leverkusen, Germany</td><td></td><td>0.2 mg/kg 体重</td></tr><tr><td>氯胺酮 10%（氯胺酮）</td><td>bela-pharm GmbH &amp;amp; Co. KG, Vechta, Germany</td><td></td><td>2.0 mg/kg 体重</td></tr><tr><td>等渗盐水溶液</td><td>B. Braun Melsungen AG, Melsungen, Germany</td><td>3200950</td><td></td></tr><tr><td>SUB 6 水浴锅</td><td>CLF analytische Laborger&amp;auml;te GmbH, Emersacker, Germany</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>金属管状扩张器</td><td>n/a</td><td>n/a</td><td>直径：3.5 cm；长度：35 cm</td></tr><tr><td>手电筒</td><td>n/a</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>硅化玻璃瓶</td><td>n/a</td><td>n/a</td><td>使用 Sigmacote（Sigma-Aldrich Co. LLC）进行硅化处理</td></tr><tr><td>Omnifix Luer 3 ml</td><td>B. Braun Melsungen AG, Melsungen, Germany</td><td>4616025V</td><td></td></tr><tr><td>Omnifix Luer 5 ml</td><td>B. Braun Melsungen AG, Melsungen, Germany</td><td>4616057V</td><td></td></tr><tr><td>密封塞</td><td>Henry Schein Vet GmbH, Hamburg, Germany</td><td>900-3057</td><td></td></tr><tr><td>接种物</td><td></td><td>n/a</td><td>将病原体稀释于 8 ml 缓冲液中</td></tr></tbody></table>

牛肺在生物医学研究中的应用：可视化引导支气管镜检查、支气管内接种及 体内 采样技术

The Bovine Lung in Biomedical Research: Visually Guided Bronchoscopy, Intrabronchial Inoculation and In Vivo Sampling Techniques

在呼吸系统医学研究中，人们一直在寻找替代的动物模型。根据研究目的的不同，大型动物作为肺部疾病的模型通常比小鼠更能准确地模拟人类肺部的情况。使用大型动物还提供了在一定时间内对同一动物进行多次采样的机会，从而可以在不牺牲动物的情况下开展长期研究。
目的是建立适用于牛呼吸道Chlamydia psittaci感染模型的体内采样方法。在研究期间，应在每个动物的不同时间点进行采样，所采集的样本应适用于在实验条件下研究宿主反应以及病原体。
支气管镜检查在人类医学和兽医学中均是一种重要的诊断工具。该操作安全且具有微创性。本文描述了对犊牛进行支气管内接种以及下呼吸道采样的方法。通过视频内镜引导的支气管内接种可在所有接种动物中产生高度一致的临床和病理学表现，因此非常适用于感染性肺部疾病模型。所描述的采样方法包括支气管肺泡灌洗、支气管刷检和经支气管肺活检。这些方法在人类医学中均为重要的诊断手段，亦可适用于6至8周龄的犊牛实验研究。所获得的样本既可用于病原体检测，也可用于评估宿主肺部炎症的严重程度。

疾病进程
病原体对动物健康的影响可通过临床检查进行评估。在我们的呼吸道感染模型中，动物每日接受两次检查，并采用评分系统记录临床观察结果。此外，通过开展其他检测获取补充信息。 在体 采样方法， 例如 ，血液和拭子采集或肺功能测定。在接种后不同时间点进行病理学检查，以描述感染的进展情况32-34.
支气管肺泡灌洗液回收率
灌注液体的回收率为83.05 ± 4.58%（均值 ± 标准差）。
病原体检测
可从支气管刷检样本中对病原体进行再次培养。此外，还可通过PCR方法对多种样本进行筛查以检测该病原体。 例如 组织活检，细胞学刷检样本，BALF细胞52 或咽拭子。通过肺活检组织冷冻切片和支气管肺泡灌洗液（BALF）细胞沉淀涂片的免疫组织化学染色，可实现对病原体的可视化检测。图3）。在先前的实验中，对血液样本及拭子样本（结膜、粪便、鼻腔）进行了PCR检测，以表征病原体的传播与排出情况32.
肺组织局部炎症的标志物
在支气管肺泡灌洗液（BALF）中，可研究肺部炎症的多种参数。当存在肺部炎症时，总细胞计数和中性粒细胞比例通常会升高。对于细胞分类，可将BALF细胞的沉淀制片，采用吉姆萨（Giemsa）染色法染色，并通过油镜观察进行分类（图4）。BALF中的细胞成分与液体成分可通过离心（300 × g；20分钟）分离。BALF上清液中含有多种在肺部炎症过程中发生变化的标志物，可在实验条件下进行研究，例如总蛋白和二十碳脂类物质29,34。
所述样本潜在的进一步用途示意图如图5所示。
<img alt="&lt;b&gt;肺部解剖示意图；支气管和肺叶标注，用于教学研究。&lt;/b&gt;" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51557/51557fig1highres.jpg" width="500" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图1"> 
图1. 牛肺示意图及接种部位（黄色）。 数字表示将接种物注入不同支气管的顺序。R：右；L：左。右肺：1 Lobus medius：0.5 ml，2 Lobus accessorius：0.5 ml，3 Lobus caudalis：0.5 ml 和 4：1.0 ml；左肺：Lobus cranialis，5 Pars cranialis：0.5 ml，6 Pars caudalis：0.5 ml，7 Lobus caudalis：1.5 ml，8 Lobus cranialis, Pars caudalis：1.0 ml。
<img alt="肺部淋巴引流示意图，突出显示用于教育研究的淋巴结通路。" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51557/51557fig2highres.jpg" width="500" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 2"> 
图 2. 牛肺示意图，显示接种部位（黄色）和采样部位：支气管肺泡灌洗（蓝色）、支气管刷检（绿色）和肺组织活检（橙色）。 请注意，所有样本均取自病原体先前沉积的区域。R：右，L：左。
<img alt="组织学染色切片；a) 组织结构，b) 细胞计数；显微镜图像，100 μm 比例尺。" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51557/51557fig3highres.jpg" width="500" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图3"> 
图3. a) 接种 Chlamydia psittaci 后第4天（dpi）的犊牛肺活检组织，b) 接种 C. psittaci 后第9天（dpi）的犊牛支气管肺泡灌洗液（BALF）细胞沉淀。针对衣原体的免疫组织化学标记。衣原体包涵体（箭头）存在于肺组织（a）和肺泡巨噬细胞中（b）。苏木精复染。
<img alt="染色人细胞的显微镜图像；比例尺 20μm；细胞结构观察。" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51557/51557fig4highres.jpg" width="500" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 4"> 
图 4. 接种 C. psittaci 后第 9 天犊牛支气管肺泡灌洗液（BALF）的细胞沉淀物。 肺泡巨噬细胞（#）是 BALF 中主要的细胞类型。当中性粒细胞（*）数量增加时，提示存在炎症过程。改良帕彭海姆染色法。
<img alt="支气管采样流程：灌洗、刷检、活检示意图；包含PCR、显微镜检查步骤。" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51557/51557fig5highres.jpg" width="600" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 5"> 
图5. 样本制备的可能方法。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51557/51557fig5highres.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>

本文描述了在实验条件下牛肺的支气管镜技术。 即 支气管镜引导接种、支气管肺泡灌洗、支气管刷检和经支气管肺活检。

呼吸系统医学研究中，人们一直在寻找替代的动物模型。根据研究目的的不同，可选用大型动物作为……

以下实验的总体目标是利用牛的呼吸道感染模型来研究宿主与病原体之间的相互作用。通过在疾病过程中对犊牛进行支气管内接种目标病原体以诱导呼吸道感染，进而实现该目标。在实验期间，通过支气管肺泡灌洗对动物进行多次采样。接下来获取支气管刷检样本和经支气管肺活检样本，分别用于回收上皮细胞和肺泡或肺组织样本。最终可通过支气管肺泡灌洗液中的炎症改变、细胞学检查以及病原体的免疫组化检测等方法，确诊病原体特异性的呼吸道疾病。在经支气管肺活检中，该大型动物模型相较于其他现有动物模型和啮齿类动物的主要优势在于，我们能够在同一个体中通过重复取样，长期研究疾病的发展过程。尽管该方法可为体内宿主与病原体的相互作用提供见解，但也可应用于其他系统，例如其他病原体或宿主物种。麻醉的维持及采样辅助工作将由一位名为Fisher的兽医负责，她来自我们的实验室。在开始操作前，用一、二和五毫升的接种物分别填充三支注射器。确认麻醉成功后，拉出动物的舌头并伸展颈部。接着，使用轻微的旋转动作，将金属开口器插入犊牛的口腔内。在视野控制下向前推进开口器，并用手电筒观察以确定喉部是否可见。接下来，将聚四氟乙烯管插入内窥镜的工作通道中。该管不应从内窥镜的顶端突出。将内窥镜通过窥器插入。可能需要对窥镜进行轻微调整以使内窥镜顺利通过。为通过喉部，使用支气管气管，其向肺的右侧分支，有助于在显示器上对齐图像。然后将装有5 mL接种物的注射器连接到聚四氟乙烯管的末端。将导管插入需接种的支气管分支部位，并注入适量的接种物。接着，将装有1毫升接种物的注射器连接至导管。推进至气管支气管区域，并将接种物注入目标支气管分支。取出内窥镜和窥器。然后将最后一支注射器连接至驱动装置，向每侧鼻孔喷入一毫升接种物。将动物以俯卧位放回其圈舍中，使其苏醒。恢复室应配备空调。由于动物在全身麻醉状态下体温调节能力下降，需在采样前将五支各含有20毫升无菌等渗盐水的注射器置于38摄氏度水浴中预热。然后将灌洗导管插入内镜的工作通道，并将内镜插入金属扩张器中。接着，向前推进至左肺主支气管，直至到达楔形位置，此时内窥镜无法继续前进。然后依次将装有温热氯化钠溶液的注射器连接至灌洗导管，用于注入液体并直接抽吸回收。回收后立即将支气管肺泡灌洗液储存于冰上的硅化玻璃瓶中，以防止肺泡巨噬细胞黏附于玻璃表面。记录灌注的生理盐水量以及回收液体的量。随后将灌洗导管从工作通道中取出，以收集上皮细胞。接下来，将内窥镜导航至目标采样位置。例如，在本实验中为气管分叉处，当内窥镜就位后，用导管套住支气管刷，并将其插入内窥镜的工作通道，直至刷头在监视器上可见。将刷子和塑料导管向前推进约五厘米。然后推动刷子的手柄，使其从塑料管中伸出。当刷子到达指定位置后，将其引导至需要刷拭的部位。在操作内窥镜的同时，轻柔地前后推动刷子进行刷拭。为确保刷子与支气管壁接触以刮取上皮细胞。一旦发生出血，即停止刷拭。然后将刷子套入导管内，并将其从工作通道中取出。轻轻将带有上皮细胞的刷毛在最多五张显微镜载玻片上滚动，并将涂片置于冷甲醇中固定10分钟。随后让载玻片自然晾干，并于-20摄氏度保存，以进行经支气管肺活检。接下来，将内窥镜引导至目标取样位置。例如，在本实验中，于将活检钳插入工作通道之前，应先将其开合数次，以确保其功能正常；随后将活检钳推进至支气管的支气管分支，直至遇到轻微阻力。此时，后撤活检钳2至3厘米并打开钳口，再次向前推进约2厘米，然后闭合钳口。将活检钳从工作通道中回撤并取出。使用针头小心地将组织从活检钳上取下，并将其置于合适的固定液中，以防止自溶过程的发生。最后，让犊牛在圈舍中恢复后，再次监测动物24小时内的气胸情况，并提供饲料和新鲜饮水。当动物完全恢复意识后，可对经支气管肺活检的冷冻切片进行免疫组织化学染色。为观察接种的病原体，请注意该动物肺组织中呈棕色的沙眼衣原体包涵体，该动物在采样前四天接种了沙眼衣原体。对灌洗细胞进行免疫组织化学染色可实现对胞内病原体的可视化观察。例如，在此图像中，可见从一头小牛采集的肺泡巨噬细胞内存在沙眼衣原体包涵体。支气管内接种沙眼衣原体9天后，可观察到衣原体包涵体（CTAC）。支气管肺泡灌洗细胞可通过细胞学染色进行鉴别。肺泡巨噬细胞是灌洗液中的主要细胞类型。然而，当存在炎症过程时，中性粒细胞的数量会增加。一旦掌握操作技巧，接种可在10至15分钟内完成，正确操作时取样可在20至30分钟内完成。观看本视频后，您应能够充分掌握如何在犊牛中进行支气管内接种，以及如何在麻醉动物中采集支气管肺泡灌洗液、支气管刷检样本和经支气管肺活检组织。

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牛肺在生物医学研究中的应用：可视化引导支气管镜检查、支气管内接种及体内采样技术

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