牛肺在生物医学研究中的应用：可视化引导支气管镜检查、支气管内接种及 体内 采样技术

以下实验的总体目标是利用牛的呼吸道感染模型来研究宿主与病原体之间的相互作用。通过在疾病过程中对犊牛进行支气管内接种目标病原体以诱导呼吸道感染，进而实现该目标。在实验期间，通过支气管肺泡灌洗对动物进行多次采样。

接下来获取支气管刷检样本和经支气管肺活检样本，分别用于回收上皮细胞和肺泡或肺组织样本。最终可通过支气管肺泡灌洗液中的炎症改变、细胞学检查以及病原体的免疫组化检测等方法，确诊病原体特异性的呼吸道疾病。在经支气管肺活检中，该大型动物模型相较于其他现有动物模型和啮齿类动物的主要优势在于，我们能够在同一个体中通过重复取样，长期研究疾病的发展过程。

尽管该方法可为体内宿主与病原体的相互作用提供见解，但也可应用于其他系统，例如其他病原体或宿主物种。麻醉的维持及采样辅助工作将由一位名为Fisher的兽医负责，她来自我们的实验室。在开始操作前，用一、二和五毫升的接种物分别填充三支注射器。

确认麻醉成功后，拉出动物的舌头并伸展颈部。接着，使用轻微的旋转动作，将金属开口器插入犊牛的口腔内。在视野控制下向前推进开口器，并用手电筒观察以确定喉部是否可见。

接下来，将聚四氟乙烯管插入内窥镜的工作通道中。该管不应从内窥镜的顶端突出。将内窥镜通过窥器插入。

可能需要对窥镜进行轻微调整以使内窥镜顺利通过。为通过喉部，使用支气管气管，其向肺的右侧分支，有助于在显示器上对齐图像。然后将装有5 mL接种物的注射器连接到聚四氟乙烯管的末端。

将导管插入需接种的支气管分支部位，并注入适量的接种物。接着，将装有1毫升接种物的注射器连接至导管。推进至气管支气管区域，并将接种物注入目标支气管分支。

取出内窥镜和窥器。然后将最后一支注射器连接至驱动装置，向每侧鼻孔喷入一毫升接种物。将动物以俯卧位放回其圈舍中，使其苏醒。

恢复室应配备空调。由于动物在全身麻醉状态下体温调节能力下降，需在采样前将五支各含有20毫升无菌等渗盐水的注射器置于38摄氏度水浴中预热。然后将灌洗导管插入内镜的工作通道，并将内镜插入金属扩张器中。

接着，向前推进至左肺主支气管，直至到达楔形位置，此时内窥镜无法继续前进。然后依次将装有温热氯化钠溶液的注射器连接至灌洗导管，用于注入液体并直接抽吸回收。

回收后立即将支气管肺泡灌洗液储存于冰上的硅化玻璃瓶中，以防止肺泡巨噬细胞黏附于玻璃表面。记录灌注的生理盐水量以及回收液体的量。随后将灌洗导管从工作通道中取出，以收集上皮细胞。

接下来，将内窥镜导航至目标采样位置。例如，在本实验中为气管分叉处，当内窥镜就位后，用导管套住支气管刷，并将其插入内窥镜的工作通道，直至刷头在监视器上可见。将刷子和塑料导管向前推进约五厘米。

然后推动刷子的手柄，使其从塑料管中伸出。当刷子到达指定位置后，将其引导至需要刷拭的部位。在操作内窥镜的同时，轻柔地前后推动刷子进行刷拭。

为确保刷子与支气管壁接触以刮取上皮细胞。一旦发生出血，即停止刷拭。然后将刷子套入导管内，并将其从工作通道中取出。

轻轻将带有上皮细胞的刷毛在最多五张显微镜载玻片上滚动，并将涂片置于冷甲醇中固定10分钟。随后让载玻片自然晾干，并于-20摄氏度保存，以进行经支气管肺活检。接下来，将内窥镜引导至目标取样位置。

例如，在本实验中，于将活检钳插入工作通道之前，应先将其开合数次，以确保其功能正常；随后将活检钳推进至支气管的支气管分支，直至遇到轻微阻力。此时，后撤活检钳2至3厘米并打开钳口，再次向前推进约2厘米，然后闭合钳口。

将活检钳从工作通道中回撤并取出。使用针头小心地将组织从活检钳上取下，并将其置于合适的固定液中，以防止自溶过程的发生。最后，让犊牛在圈舍中恢复后，再次监测动物24小时内的气胸情况，并提供饲料和新鲜饮水。

当动物完全恢复意识后，可对经支气管肺活检的冷冻切片进行免疫组织化学染色。为观察接种的病原体，请注意该动物肺组织中呈棕色的沙眼衣原体包涵体，该动物在采样前四天接种了沙眼衣原体。对灌洗细胞进行免疫组织化学染色可实现对胞内病原体的可视化观察。

例如，在此图像中，可见从一头小牛采集的肺泡巨噬细胞内存在沙眼衣原体包涵体。支气管内接种沙眼衣原体9天后，可观察到衣原体包涵体（CTAC）。支气管肺泡灌洗细胞可通过细胞学染色进行鉴别。

肺泡巨噬细胞是灌洗液中的主要细胞类型。然而，当存在炎症过程时，中性粒细胞的数量会增加。一旦掌握操作技巧，接种可在10至15分钟内完成，正确操作时取样可在20至30分钟内完成。

观看本视频后，您应能够充分掌握如何在犊牛中进行支气管内接种，以及如何在麻醉动物中采集支气管肺泡灌洗液、支气管刷检样本和经支气管肺活检组织。