通过电流测量与裂解片段检测相结合展示上皮钠离子通道（ENaC）的蛋白水解激活

以下实验的总体目标是研究蛋白酶对在扎普拉瓦细胞中异源表达的上皮钠离子通道（ENaC）的作用。首先在卵母细胞中测量阿莫瑞特敏感性的全细胞电流，然后让卵母细胞恢复，再将其暴露于蛋白酶，随后再次测量电流。

然后，平行地对卵母细胞进行生物素标记，并进行蛋白质印迹分析，以监测细胞表面γ亚基ENaC裂解片段的出现。实验结果表明，通过结合双电极电压钳技术和生物素标记方法，通道的裂解与通道的激活之间存在因果关系。该技术相较于现有方法（如非计划性测量）的主要优势在于，可在两次测量之间，将细胞暴露于蛋白酶或其他药理学试剂中，在小体积的测试溶液中实现不同持续时间的处理。在按照文本方案分离zap lava细胞并注射CN两天后，使用ND 96溶液填充重力灌流系统的其中一个注射器，使用含有酰胺的ND 96溶液填充第二个注射器。

将注射器安装在浴槽室上方50厘米处后，打开150瓦卤素冷光源，并将其调节至卵母细胞浴槽室上方10厘米处，以便通过双目显微镜清晰观察。开启吸引装置，并将吸引管置于卵母细胞浴槽室内灌流管接头的对侧。接下来，使用静脉输液重力流速控制装置，调节每种溶液的灌流速度至每分钟3至5毫升。然后，使用接头通过微移液器极性拉制玻璃毛细管，将灌流管连接至卵母细胞浴槽室，以获得尖端直径小于1微米的毛细管。

然后使用3摩尔的氯化钾将毛细管填充至约四分之一满。将毛细管插入电流电极和电压电极的电极架中，并利用显微操作器将其置入含有2微摩尔酰胺溶液的ND 96溶液中。为测量对酰胺敏感的全细胞电流，首先调节VM偏移按钮，使电压电极的电极电位归零，再调节VE偏移按钮，使电流电极的电位归零。

将一个尿道上皮（UO）位点放入浴槽室中，并靠近电压感应电极。然后使用两根微电极轻轻刺入该UO位点，将放大器的钳制电位设为-60毫伏，并开启图表记录仪。随后打开含酰胺溶液。

接下来，开始记录，必要时调整增益。当测得的电流达到稳定平台期后，切换至不含酰胺的溶液。一旦电流再次达到平台期，将灌流液换回含酰胺的溶液。随后，当尿道上皮（UO）位点的电流恢复至初始基线水平时，关闭电压钳并轻柔撤出电极，以允许细胞膜在穿刺部位重新封闭。

将Uoc位点放入含有100至150微升无蛋白酶ND 96溶液的96孔板的一个孔中，孵育5分钟，随后将UOC位点转移至含蛋白酶的溶液或不含蛋白酶的对照溶液中。孵育后30分钟内重复电流测量，在体视显微镜下丢弃有缺陷的卵母细胞，并分别制备含适当蛋白酶和不含蛋白酶的抗96溶液。通过标记移液枪头并短暂灼烧其尖端来制备移液枪，以避免损伤卵母细胞。

向六孔板的每个孔中加入 2.5 毫升室温的 ND 96 或含蛋白酶的 ND 96。然后每孔加入 30 个卵母细胞，在室温下孵育 30 分钟。在向新的六孔板各孔中加入 2.5 毫升 ND 96 后，将每组卵母细胞转移至含有 ND 96 的孔中。

将卵母细胞依次移入另外两个含有 ND 96 的孔中，以洗去残留的蛋白酶，并在最后一个孔中孵育 5 分钟。根据文本方案，用生物素洗脱缓冲液配制生物素。将每组卵母细胞放入含有 2.5 毫升生物素洗脱缓冲液的孔中，轻轻振荡孵育 15 分钟。随后，将每组卵母细胞转移至含有 2.5 毫升淬灭缓冲液的孔中，以终止生物素反应，再转移至第二孔淬灭缓冲液中，孵育 5 分钟。

轻柔振荡，将每组卵母细胞转移至1.5毫升微量离心管中，加入1毫升裂解缓冲液（含蛋白酶抑制剂），并通过27号针头反复推注以裂解细胞。将裂解物在1500 × g 条件下离心10分钟。将上清液转移至新的1.5毫升离心管中，管内预先加入TRITON X-100和MP-40，冰上孵育20分钟。每组卵母细胞加入100 µL预平衡的agarose beads，充分涡旋混匀以溶解蛋白质，随后将beads加入蛋白-去垢剂溶液中，4°C条件下旋转孵育过夜。

第二天，将样品在1500 × g 条件下离心3分钟。然后将上清液转移至新的离心管中，用于检测细胞表面的活化裂解片段。通过使用裂解缓冲液洗涤磁珠3次来修复凝胶样品，然后加入2× SDS-PAGE上样缓冲液。将样品在20,000 × g 条件下离心3分钟后，用移液器将上清液转移至新的微量离心管中。

根据文本方案通过蛋白质印迹法分析样品，以研究丝氨酸蛋白酶纤溶酶是否能够激活ENaC介导的电流。在将表达ENaC的细胞分别于无蛋白酶溶液或含纤溶酶溶液中孵育30分钟前后，测定各个细胞的delta IE值。采用此处所示的双电极电压钳技术，结果显示，所有被检测的细胞在暴露于纤溶酶后，delta IE均有所增加。

相比之下，在不含蛋白酶的溶液中孵育则几乎无影响。该图比较了χ-胰蛋白酶对野生型ENaC以及对突变的prostasin和纤溶酶切割位点ENaC的作用。如图所示，该突变通道延迟并减弱了χ-胰蛋白酶介导的ENaC电流激活。

此外，与野生型 ENaC 相比，其切割片段的生成速率降低。观看本视频后，您应能充分理解如何结合使用上述方法，将蛋白酶对细胞内事件的刺激作用与细胞表面切割产物的出现相关联。这一方法可广泛应用于多种研究场景，例如，用于探讨蛋白酶对其他离子通道、转运蛋白或跨膜受体调控的类似问题。