Name: 上皮钠通道（ENaC）的蛋白水解激活通过结合电流测量与检测裂解片段示范 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-07-05T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 56 s
Description: 了解上皮钠通道（ENaC）的蛋白水解激活机制，通过结合双电极电压钳技术与生物素标记法，在非洲爪蟾卵母细胞中检测裂解片段与电流变化的关系，揭示蛋白酶调控离子通道功能的关键作用。

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我们衷心感谢 Céline Grüninger、Christina Lang、Sonja Mayer 和 Ralf Rinke 提供的专业技术支持。感谢 Morag K. Mansley 博士对稿件的仔细审阅。本项目得到了德国研究基金会（Deutsche Forschungsgemeinschaft）的资助（项目号 SFB 423：肾脏损伤：发病机制与再生机制，授予 C. Korbmacher），以及埃尔朗根-纽伦堡大学（Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg）跨学科临床研究中心（Interdisziplinäres Zentrum für Klinische Forschung）（资助对象：S. Haerteis 和 M. Krappitz）、ELAN 项目（资助对象：S. Haerteis）和埃尔朗根-纽伦堡大学图书馆的资助。

1. 分离 非洲爪蟾 卵母细胞与cRNA显微注射
<ol>
	<li>从成年雌性个体中获取卵母细胞 Xenopus laevis用0.2% MS222麻醉动物，通过腹部小切口切除卵巢叶。</li>
	<li>在19 °C下使用600–700 U/ml的2型胶原酶对卵巢叶进行3–4小时的酶消化，以分离卵母细胞 Clostridium histolyticum 溶解于无钙OR2溶液中（配方见 表1).</li>
	<li>用于筛选时，将去滤泡的卵母细胞置于含高钠溶液（ND96：配方见 表1).</li>
	<li>选择V-VI期的卵母细胞，用巴斯德吸管将其转移至另一个培养皿中。注意：将巴斯德吸管尖端在火焰上烧钝，以防止损伤卵母细胞。</li>
	<li>注射卵母细胞以导入cRNA（例如 每αβγENaC亚基0.2 ng。将cRNA溶解于无RNase的水中。注：每个卵母细胞注射的总体积为46 nl。</li>
	<li>将注射后的卵母细胞储存在19 °C的低钠溶液中，以防止卵母细胞钠超载（ND9：配方见 表1加入100 U/ml青霉素钠和100 μg/ml硫酸链霉素以抑制细菌生长。在cRNA注射后的两天内，小心操作卵母细胞，尽量减少损伤或死亡的卵母细胞，并将其分组置于含灌流液的12孔板中，每孔单独培养。</li>
</ol>
<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>OR2</td>
			<td>82.5 mM NaCl, 2 mM KCl, 1 mM MgCl₂, 5 mM HEPES，用 NaOH 调至 pH 7.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ND96</td>
			<td>96 mM NaCl, 2 mM KCl, 1.8 mM CaCl₂, 1 mM MgCl₂, 5 mM HEPES，用 Tris 调至 pH 7.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ND9</td>
			<td>9 mM NaCl, 87 mM NMDG-Cl, 2 mM KCl, 1.8 mM CaCl₂, 1 mM MgCl₂, 5 mM HEPES，用 Tris 调至 pH 7.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>生物素化缓冲液</td>
			<td>10 mM 三乙醇胺, 150 mM NaCl, 2 mM CaCl₂，用 HCl 调至 pH 9.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>淬灭缓冲液</td>
			<td>192 mM 甘氨酸, 25 mM Tris-Cl，用 HCl 调至 pH 7.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>裂解缓冲液</td>
			<td>500 mM NaCl, 5 mM EDTA, 50 mM Tris-Cl，用 HCl 调至 pH 7.4</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1. 溶液
2. 进行双电极电压钳实验
<ol>
	<li>注射后两天测量卵母细胞。</li>
	<li>将重力灌流系统的其中一个注射器装入 ND96 溶液，另一个注射器装入含阿米洛利（2 µM）的 ND96 溶液。将注射器安装在卵母细胞浴槽上方 50 cm 处。注意：上皮钠通道（ENaC）抑制剂阿米洛利的浓度选择为其 IC50（100 nM）的 20 倍。</li>
	<li>打开 150 W 卤素冷光源，并调节至卵母细胞浴槽上方 10 cm 处，以便通过双目显微镜清晰观察。然后开启抽吸装置，并调整卵母细胞浴槽末端的抽吸管，将其置于灌流管接口进入卵母细胞浴槽的对侧位置。注意：抽吸力度必须足以维持溶液对卵母细胞的持续灌流。</li>
	<li>使用 i.v. 重力流速控制装置调节每种溶液的灌流速度至 3–5 ml/min。通过接头将灌流管连接至卵母细胞浴槽。</li>
	<li>使用微电极拉制仪将玻璃毛细管拉制成尖端直径 &#60;1 µm 的电极。然后将毛细管填充约 1/4 体积的 3 M KCl 溶液。注意：确保电极夹持器中银丝的氯化部分完全浸入 KCl 溶液中。检查毛细管尖端是否存在气泡，气泡会因增加电阻和杂散电容而干扰测量。</li>
	<li>将毛细管插入电流电极和电压电极的电极夹持器中，并使用显微操作器将其置于含阿米洛利（2 µM）的 ND96 溶液中。</li>
</ol>
3. 阿米洛利敏感性全细胞电流的测定
<ol>
	<li>将电压电极（V）的电极电位调零m）和电流电极（Ve）通过调节 Vm 和 Ve 偏移量按钮。 注意：电极的电阻应为 1–2 MΩ，以测量 Vm 用于电流注射电极的电阻为0.5-1 MΩ。</li>
	<li>将卵母细胞放入浴槽中，使其靠近电压感应电极。注意：在任何转移步骤中均不得损伤卵母细胞。使用巴斯德移液管转移卵母细胞，为避免损伤卵母细胞，应通过火焰灼烧使移液管口边缘变钝。</li>
	<li>用微电极轻轻刺入卵母细胞。</li>
	<li>将放大器的保持电位设为 -60 mV，并开启图表记录仪。灌注含氨氯吡脒（2 µM）的溶液。注意：电流应约为 0 ± 0.5 µA。若漏电流较大，提示穿刺密封性差，此类卵母细胞应予以弃用。此外，在表达 αβγ-WT ENaC 的卵母细胞与表达 αβγ-突变型 ENaC 的卵母细胞中，加入氨氯吡脒（2 µM）后测得的漏电流应相近，表明突变不影响通道对氨氯吡脒的敏感性。</li>
	<li>开始录制。如有必要，调整增益。</li>
	<li>当测得的电流达到稳定平台期后，更换为无阿米洛利溶液。注：电流轨迹中向下的电流偏转代表内向电流。 即 正电荷（Na⁺）的移动+从细胞外侧进入细胞内部。</li>
	<li>当电流达到平台期（约60秒后），将灌流液切换回含阿米洛利的溶液。待卵母细胞电流恢复至初始基线水平后，关闭电压钳并轻轻撤出电极。</li>
	<li>为使质膜在穿刺部位重新封闭，将卵母细胞放入96孔板的一个孔中，孔内含100–150 µl无蛋白酶的ND96溶液。</li>
	<li>5分钟后，将卵母细胞转移至含蛋白酶的溶液中，或转移至不含蛋白酶的对照溶液中，孵育30分钟。注意：孵育时间取决于所用蛋白酶及研究的通道类型。</li>
	<li>孵育步骤结束后，重复进行电流测量（参见3.2及后续步骤）。注意：可以进行测量 &#62;经蛋白酶溶液孵育后，90%的卵母细胞。</li>
</ol>
4. 生物素标记实验
<ol>
	<li>在双目显微镜下挑选并弃去有缺陷的卵母细胞。注：用于当前测量和生物素化实验的注射卵母细胞应来自同一批次。</li>
	<li>实验前将生物素在室温下放置至少20分钟。</li>
	<li>配制溶液：ND96 及含适当蛋白酶的 ND96。通过标记 Pasteur 吸管并短暂灼烧其尖端以避免损伤卵母细胞。注意：此处使用 ND96 中含 2 µg/ml 胰凝乳蛋白酶（chymotrypsin）的溶液。每组使用单独的吸管，以避免溶液交叉污染。</li>
	<li>向6孔板的每孔中加入2.5 ml对照ND96或含蛋白酶的ND96溶液，于室温孵育。随后每孔加入30个卵母细胞，室温孵育30分钟。注意：后续操作中必须始终将样品置于冰上。所有离心步骤均在4 °C下进行。</li>
	<li>向一个新的6孔板的每孔中加入2.5 ml ND96（每组洗涤步骤需要3个孔），并称取生物素。注意：每孔需加入2.5 mg生物素（1 mg/ml）。将生物素溶解于生物素化缓冲液中即 25 mg 生物素（用于10组）溶于25 ml 生物素标记缓冲液（配方见 表1).</li>
	<li>将每组卵母细胞转移至含有2.5 ml ND96的孔中。依次将卵母细胞转入另外两个含ND96的孔中，以洗去残留的蛋白酶。在ND96中孵育卵母细胞5分钟。</li>
	<li>将卵母细胞转移至含有2.5 ml生物素溶液的孔中，轻轻振荡（“摇床”）孵育15分钟。注意：使用移液器转移时应尽量减少ND96溶液的带入，以避免稀释生物素溶液。</li>
	<li>将每组卵母细胞转移至含有2.5 ml淬灭缓冲液的孔中（配方见 表1）以终止生物素标记反应。随后，将每组卵母细胞转移至另一个同样含有2.5 ml淬灭缓冲液的孔中，在轻微振荡条件下孵育5分钟。</li>
	<li>去除受损或死亡的卵母细胞。注意：后续操作中，每组选择相同数量的卵母细胞。</li>
	<li>将每组卵母细胞转移至一个1.5 ml塑料微量离心管中。注意：尽量减少转移的淬灭缓冲液体积。</li>
	<li>随后，将卵母细胞在1 ml裂解缓冲液中（配方见 表1加入蛋白酶抑制剂。</li>
	<li>将裂解液在1,500 × g离心10分钟。</li>
	<li>吸弃上清液，并将其转移至含有0.5% Triton-X-100和0.5% NP40的1.5 ml微量离心管中。弃去剩余沉淀。注意：上清液中含有生物素标记的质膜蛋白和非生物素化的细胞内蛋白。</li>
	<li>将微量离心管置于冰上孵育20分钟。在此期间反复涡旋振荡各管，以充分溶解NP40和Triton-X-100中的蛋白质。</li>
	<li>将每组卵母细胞的100 µl琼脂糖珠在1,500 x g条件下离心3分钟。离心后，从珠子溶液中移除上清液，并用裂解缓冲液洗涤三次，以使珠子与缓冲液达到平衡。</li>
	<li>将100 µl洗涤后的磁珠移液至每个含有4.13步骤中制备的蛋白-去垢剂溶液的微量离心管中，以使生物素标记的蛋白与磁珠结合。</li>
	<li>将微量离心管置于4 °C，用翻转混合仪孵育过夜。</li>
	<li>将微量离心管在1,500 × g下离心3分钟，然后将上清液转移至新管中。注意：细胞内蛋白未被生物素标记。上清液可于-20 °C保存。切勿吸弃珠粒。</li>
</ol>
5. 通过蛋白质印迹分析检测细胞表面的ENaC裂解片段
<ol>
	<li>用裂解缓冲液洗涤磁珠三次，加入100 µl的2x SDS-PAGE上样缓冲液。注意：样品可在-20 °C保存，或立即用于后续的蛋白质印迹分析。</li>
	<li>在95 °C下煮沸样品5分钟，然后将离心管置于冰上冷却。</li>
	<li>在20,000 x g条件下离心3分钟，用移液器将上清液转移至新的微量离心管中。注意：此上清液含有来自卵母细胞表面的生物素标记的质膜蛋白。</li>
	<li>取30 µl上述上清液进行蛋白质印迹分析，以检测细胞表面的切割片段。</li>
	<li>采用适当浓度的凝胶（根据所检测切割片段的分子量选择8%、10%或12%），通过SDS-PAGE（十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳）分离生物素标记的蛋白质。</li>
	<li>通过半干转印法将蛋白质转移至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上。</li>
	<li>使用针对人γENaC C末端表位的特异性抗体孵育膜（见图3和13）。</li>
	<li>以辣根过氧化物酶标记的羊抗兔抗体作为二抗。</li>
	<li>检测化学发光信号。</li>
</ol>

<ol><li>Kleyman, T. R., Carattino, M. D., Hughey, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ENaC+at+the+cutting+edge%3A+regulation+of+epithelial+sodium+channels+by+proteases%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">ENaC at the cutting edge: regulation of epithelial sodium channels by proteases.</a> The Journal of Biological Chemistry. 284, 20447-20451 (2009).</li>
<li>Rossier, B. C., Stutts, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+the+epithelial+sodium+channel+%28ENaC%29+by+serine+proteases%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Physiol%22%5BJournal%5D)">Activation of the epithelial sodium channel (ENaC) by serine proteases.</a> Annu Rev Physiol. 71, 361-379 (2009).</li>
<li>Poirot, O., Vukicevic, M., Boesch, A., Kellenberger, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+regulation+of+acid-sensing+ion+channel+1+by+serine+proteases%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Selective regulation of acid-sensing ion channel 1 by serine proteases.</a> The Journal of Biological Chemistry. 279, 38448-38457 (2004).</li>
<li>Vukicevic, M., Weder, G., Boillat, A., Boesch, A., Kellenberger, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trypsin+cleaves+acid-sensing+ion+channel+1a+in+a+domain+that+is+critical+for+channel+gating%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Trypsin cleaves acid-sensing ion channel 1a in a domain that is critical for channel gating.</a> The Journal of Biological Chemistry. 281, 714-722 (2006).</li>
<li>Clark, E. B., Jovov, B., Rooj, A. K., Fuller, C. M., Benos, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteolytic+cleavage+of+human+acid-sensing+ion+channel+1+by+the+serine+protease+matriptase%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Proteolytic cleavage of human acid-sensing ion channel 1 by the serine protease matriptase.</a> The Journal of Biological Chemistry. 285, 27130-27143 (2010).</li>
<li>Ossovskaya, V. S., Bunnett, N. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protease-activated+receptors%3A+contribution+to+physiology+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+reviews%22%5BJournal%5D)">Protease-activated receptors: contribution to physiology and disease.</a> Physiological reviews. 84, 579-621 (2004).</li>
<li>Garcia-Caballero, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+the+epithelial+sodium+channel+by+the+metalloprotease+meprin+%CE%B2-subunit%5BTitle%5D)+AND+%22Channels+%28Austin%22%5BJournal%5D)">Activation of the epithelial sodium channel by the metalloprotease meprin β-subunit.</a> Channels (Austin. 5, 14-22 (2011).</li>
<li>Haerteis, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteolytic+activation+of+the+epithelial+sodium+channel+%28ENaC%29+by+the+cysteine+protease+cathepsin-S%5BTitle%5D)+AND+%22Pfl%C3%BCgers+Archiv%3A+European+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Proteolytic activation of the epithelial sodium channel (ENaC) by the cysteine protease cathepsin-S.</a> Pflügers Archiv: European Journal of Physiology. 464, 353-365 (2012).</li>
<li>Harris, M., Firsov, D., Vuagniaux, G., Stutts, M. J., Rossier, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+neutrophil+elastase+inhibitor+prevents+elastase+activation+and+surface+cleavage+of+the+epithelial+sodium+channel+expressed+in+Xenopus+laevis+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">A novel neutrophil elastase inhibitor prevents elastase activation and surface cleavage of the epithelial sodium channel expressed in Xenopus laevis oocytes.</a> The Journal of Biological Chemistry. 282, 58-64 (2007).</li>
<li>Passero, C. J., Mueller, G. M., Rondon-Berrios, H., Tofovic, S. P., Hughey, R. P., Kleyman, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasmin+activates+epithelial+Na%2B+channels+by+cleaving+the+%CE%B3-subunit%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Plasmin activates epithelial Na+ channels by cleaving the γ-subunit.</a> The Journal of Biological Chemistry. 283, 36586-36591 (2008).</li>
<li>Svenningsen, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasmin+in+nephrotic+urine+activates+the+epithelial+sodium+channel%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Society+of+Nephrology+%3A+JASN%22%5BJournal%5D)">Plasmin in nephrotic urine activates the epithelial sodium channel.</a> Journal of the American Society of Nephrology : JASN. 20, 299-310 (2009).</li>
<li>Patel, A. B., Chao, J., Palmer, L. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+kallikrein+activation+of+the+epithelial+Na+channel%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology.+Renal+Physiology%22%5BJournal%5D)">Tissue kallikrein activation of the epithelial Na channel.</a> American Journal of Physiology. Renal Physiology. 303, (2012).</li>
<li>Haerteis, S., Krappitz, M., Diakov, A., Krappitz, A., Rauh, R., Korbmacher, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasmin+and+chymotrypsin+have+distinct+preferences+for+channel+activating+cleavage+sites+in+the+%CE%B3-subunit+of+the+human+epithelial+sodium+channel%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+General+Physiology%22%5BJournal%5D)">Plasmin and chymotrypsin have distinct preferences for channel activating cleavage sites in the γ-subunit of the human epithelial sodium channel.</a> The Journal of General Physiology. 140, 375-389 (2012).</li>
<li>Chraibi, A., Vallet, V., Firsov, D., Hess, S. K., Horisberger, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protease+modulation+of+the+activity+of+the+epithelial+sodium+channel+expressed+in+Xenopus+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+General+Physiology%22%5BJournal%5D)">Protease modulation of the activity of the epithelial sodium channel expressed in Xenopus oocytes.</a> The Journal of General Physiology. 111, 127-138 (1998).</li>
<li>Volk, T., Konstas, A. A., Bassalay, P., Ehmke, H., Korbmacher, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+Na%2B+removal+attenuates+rundown+of+the+epithelial+Na%2B-channel+%28ENaC%29+by+reducing+the+rate+of+channel+retrieval%5BTitle%5D)+AND+%22Pfl%C3%BCgers+Archiv%3A+European+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Extracellular Na+ removal attenuates rundown of the epithelial Na+-channel (ENaC) by reducing the rate of channel retrieval.</a> Pflügers Archiv: European Journal of Physiology. 447, 884-894 (2004).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

本文描述了一种已成功用于研究蛋白酶激活ENaC机制的方法学途径8,13。采用成熟的Xenopus laevis卵母细胞表达系统对ENaC进行功能性表达。通过传统的双电极电压钳技术评估ENaC功能。利用定点诱变技术鉴定具有功能重要性的蛋白酶切割位点。与电生理测量平行进行的生物素标记实验，使得ENaC切割产物在细胞表面的出现与蛋白水解电流激活之间得以关联。电流激活的时间进程与细胞表面蛋白水解切割片段出现之间的相关性，支持了蛋白水解激活通道的概念。
双电极电压钳记录需要将两个微电极插入卵母细胞。该操作通常在单个卵母细胞中仅进行一次。然而，在完成初次全细胞电流记录后，可以移除微电极，且卵母细胞未表现出明显损伤。事实上，穿刺部位的细胞膜在数分钟内即可重新封闭。因此，在完成第一次双电极电压钳测量后，可将卵母细胞从双电极电压钳装置的实验灌流室转移至含有少量测试溶液或对照溶液的微量离心管或96孔板的孔中。随后，可将同一卵母细胞重新转移回灌流室，并再次插入微电极以进行第二次双电极电压钳测量。值得注意的是，当卵母细胞维持在对照溶液中时，第一次与第二次测量所记录的ENaC介导电流变化不大。相反，若在第一次测量后将卵母细胞孵育于含蛋白酶的溶液中，则第二次测量中ENaC介导的电流显著增加（图2）。该结果表明通道发生了蛋白水解激活。
在单个卵母细胞中进行两次独立的电流记录具有以下优势：可在两次记录之间，将卵母细胞置于少量测试溶液中，暴露于蛋白酶或其他药理学试剂一段可变时长的时间。当所用试剂价格昂贵和/或无法大量获得时，这一方法尤为重要。 例如 纯化的蛋白酶制剂。由于所需测试溶液的体积较大——需以每分钟数毫升的流速持续灌流卵母细胞——试剂的供应量有限可能导致其无法（或成本过高）用于连续双电极电压钳记录。此外，连续双电极电压钳测量还受到已知的通道自发衰减现象的限制，该现象在ENaC中已有报道。 15相比之下，将卵母细胞在两次独立测量之间暴露于测试溶液中长达一小时或更长时间，通常不会造成问题（参见 图4A最后，在同一个卵母细胞中进行两次连续测量，可获得配对的药物效应观察结果。这种方法相较于分别在两组卵母细胞（蛋白酶处理组与溶剂对照组）中进行的非配对测量具有优势，因为它减少了卵母细胞之间通常在离子通道表达中观察到的高度变异性问题。通过配对观察并结合将数据归一化至第一次测量值的方法，每个实验组所需的卵母细胞数量更少，即可证明药理学物质的显著效应。数据归一化还便于汇总来自不同批次卵母细胞的实验结果，这些卵母细胞的离子通道表达水平不同，因而基础电流也存在差异。图2D）。显然，该方法需要进行对照实验，以证明在溶剂处理的对照卵母细胞中，从第一次到第二次测量期间，目标离子通道活性保持稳定（参见 图2).
为了证明蛋白酶激活的电流与细胞表面出现ENaC剪切产物相关，可采用Harris et al.9最初描述的生物素标记方法。该方法（如方案部分所述，并见图4）经过调整，可用于证明通道暴露于蛋白酶后ENaC介导电流的激活，伴随着剪切片段随时间依赖性的出现。生物素标记法还可用于分析细胞表面膜蛋白总量的增加或减少。因此，该方法适用于研究蛋白酶及其他药理学试剂对通道插入质膜或从质膜回收的影响。此外，对生物素标记的质膜蛋白进行Western印迹分析，可检测蛋白片段（例如 蛋白酶剪切的ENaC片段）或糖基化模式的变化，这些变化可能具有功能相关性。
总之，用于研究蛋白酶对ENaC介导的全细胞电流刺激作用并证明其与细胞表面ENaC切割产物出现相关性的方法组合，可能适用于广泛的应用场景。特别是，这些方法可能适用于探讨有关其他离子通道、转运蛋白或跨膜受体调控的类似问题（例如 蛋白酶激活受体（PARs）。

蛋白酶是一类参与多种生理反应的酶，其功能范围从消化过程中众所周知的蛋白质蛋白水解降解，到参与复杂调控信号通路的高度精密的蛋白酶级联反应。根据其催化活性位点的不同，蛋白酶可分为七类：天冬氨酸、天冬酰胺、半胱氨酸、谷氨酸、金属、丝氨酸和苏氨酸蛋白酶。不同的蛋白酶靶向特定的切割位点，而这些位点并不总是能够从蛋白质的一级结构中轻易预测出来。MEROPS数据库（<a href="http://merops.sanger.ac.uk/">http://merops.sanger.ac.uk/</a>）提供了关于多种蛋白酶及其偏好切割位点的详细信息。功能相关的切割位点可通过定点诱变技术进行鉴定。
已有充分证据表明，上皮钠通道（ENaC）的蛋白水解加工是该特定离子通道活化的重要机制1,2。有趣的是，有研究显示，相关的酸敏感离子通道1a（ASIC1a）的功能也可能受到蛋白酶的调节3-5。目前尚不清楚蛋白水解性通道切割是否在调控其他离子通道或转运体活性中具有重要的生理作用。然而，已有充分证据表明，蛋白水解切割可激活一类G蛋白偶联受体，即蛋白酶激活受体（PARs）6。多种丝氨酸蛋白酶（例如 通道激活蛋白酶（CAP1-3）、糜蛋白酶、胰蛋白酶、弗林蛋白酶、纤溶酶、中性粒细胞弹性蛋白酶和激肽释放酶）均已被证实可通过对ENaC进行蛋白水解作用而激活该通道2。除丝氨酸蛋白酶外，其他类别的蛋白酶也可能参与ENaC的蛋白水解性激活。事实上，最近的研究数据显示，金属蛋白酶meprin-β7 和半胱氨酸蛋白酶组织蛋白酶-S（cathepsin-S）8 同样能够激活ENaC。然而，ENaC激活过程中具有（病理）生理相关性的蛋白酶仍有待明确，且可能因组织类型不同而存在差异。
已知蛋白酶会优先在氨基酸序列的特定位置进行切割。例如，丝氨酸蛋白酶胰凝乳蛋白酶（chymotrypsin）具有特异性的切割模式，主要在芳香族氨基酸残基苯丙氨酸和酪氨酸之后切割。相比之下，丝氨酸蛋白酶胰蛋白酶（trypsin）则优先在碱性残基赖氨酸或精氨酸之后切割。通过使用定点诱变技术构建的突变型人源γENaC表达质粒，在非洲爪蟾卵母细胞异源表达系统中可鉴定出具有功能意义的ENaC蛋白切割位点8-13。
通过将编码三种ENaC亚基（αβγ）的cRNA注入分离的卵母细胞中，可在这些细胞中功能性表达ENaC，并利用双电极电压钳技术测定细胞膜上通道的活性。使用利尿剂阿米洛利（一种特异性ENaC抑制剂），可测定阿米洛利敏感的ENaC介导的全细胞电流成分（ΔIami）可以从非特异性漏电流或其他离子通道介导的电流中分离出来。因此，ΔIami 数值反映ENaC的总体活性，可通过在无氨氯吡啶条件下记录的全细胞电流减去含氨氯吡啶时测得的相应全细胞电流来确定。为检测某种蛋白酶是否对ENaC具有刺激作用，可计算ΔIami 在同一卵母细胞中测量两次， 即 卵母细胞在含有蛋白酶的溶液中孵育前后的ΔI变化ami 从第一次到第二次测量的变化表明蛋白水解激活了ENaC。已知胰蛋白酶或糜蛋白酶可在卵母细胞表达系统中最大程度地刺激ENaC2,14 并可用于确认在特定批次的卵母细胞中可检测到蛋白水解激活的ENaC。
在进行全细胞电流测量的同时，采用生物素化方法9来研究卵母细胞暴露于蛋白酶后所检测到的ΔIami增加是否与ENaC裂解片段在细胞表面的出现相关。细胞表面的蛋白质可用生物素标记，并通过将生物素化蛋白与Neutravidin标记的琼脂糖珠结合，从而与细胞内蛋白分离。生物素化蛋白可通过Western印迹进行分析。使用针对γENaC C末端表位的特异性抗体，可检测细胞表面的γENaC裂解片段。为了鉴定具有功能相关性的裂解位点，可利用定点突变技术对预测的裂解位点进行突变。野生型和突变型通道在平行实验中使用同一批次的卵母细胞进行比较。
通过该方法学手段，首次证明了ENaC介导的全细胞电流的蛋白水解激活与ENaC裂解片段在细胞表面的时间依赖性出现相关。这些结果提示通道裂解与通道激活之间存在因果关系。此外，结合定点突变假定的裂解位点与双电极电压钳技术，鉴定了纤溶酶、胰凝乳蛋白酶13和组织蛋白酶-S8的功能相关裂解位点。

<table><tbody><tr><td>设备</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>OC-725C-V 浴槽夹具头级</td><td>Warner Instrument Corporation</td><td></td><td></td></tr><tr><td>冷光源 - Schott KL 1500 LCD</td><td>Schott</td><td>#SCOC150200EU</td><td>亮度：4；机械光圈：D；色温：3,000 K</td></tr><tr><td>E 系列电极架（直型，通气，银丝，1.2 mm）</td><td>ADinstruments</td><td>#ESW-F10v</td><td></td></tr><tr><td>左侧显微操作器；MM-33L</td><td>Warner Instrument Corporation</td><td>#64-0055</td><td></td></tr><tr><td>LIH 1600 - 计算机接口</td><td>HEKA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>磁阀系统（ALA BPS-8）与 TIB14 接口（HEKA）组合使用</td><td>ALA Scientific Instruments, HEKA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>用于双电极电压钳记录的 OC-725C 放大器</td><td>Warner Instrument Corporation</td><td></td><td></td></tr><tr><td>P-97 FLAMING/BROWN 微电极拉制仪</td><td>Sutter Instruments</td><td></td><td>加热值 = 550；拉速 = 22；时间 = 200</td></tr><tr><td>右侧显微操作器；MM-33R</td><td>Warner Instrument Corporation</td><td>#64-0056</td><td></td></tr><tr><td>串联电极架（45&amp;deg;，通气，手柄，银丝，1.2 mm）</td><td>ADinstruments</td><td>#E45w-f10vh</td><td></td></tr><tr><td>STAT 2 IV 重力流控制器</td><td>Conmed</td><td>#P-S2V-60</td><td></td></tr><tr><td>真空发生器喷射器 SEG - 用于吸除浴液</td><td>Schmalz</td><td></td><td></td></tr><tr><td>INFUJECT 60 ml 溶液注射泵用注射器</td><td>Braun</td><td>#22050</td><td></td></tr><tr><td>Injekt-F 用于裂解卵母细胞</td><td>Braun</td><td>#9166033V</td><td></td></tr><tr><td>带细丝的标准壁硼硅酸盐毛细管</td><td>Sutter Instruments</td><td>#BF150-86-10</td><td>外径：1.5 mm；内径：0.86 mm；长度：10 cm</td></tr><tr><td>Complete, Mini, 无 EDTA 蛋白酶抑制剂混合片剂</td><td>Roche Applied Science</td><td>#11836170001</td><td></td></tr><tr><td>EZ-Link Sulfo-NHS-Biotin</td><td>Thermo Scientific</td><td>#21217</td><td></td></tr><tr><td>辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔二抗</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>#sc-2004</td><td></td></tr><tr><td>NeutrAvidin 琼脂糖</td><td>Thermo Scientific</td><td>#29200</td><td>Neutravidin 标记的琼脂糖珠</td></tr><tr><td>NP40（Nonidet P-40）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>#I8896</td><td></td></tr><tr><td>Roti-Load 1（2x SDS-PAGE 样品缓冲液）</td><td>Carl Roth</td><td>#K929.2</td><td></td></tr><tr><td>SuperSignal West Femto 化学发光底物，用于检测化学发光信号</td><td>Thermo Scientific</td><td>#34095</td><td></td></tr><tr><td>Triton-X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>#T8787</td><td></td></tr></tbody></table>

通过电流测量与裂解片段检测相结合展示上皮钠离子通道（enac）的蛋白水解激活

Demonstration of Proteolytic Activation of the Epithelial Sodium Channel (ENaC) by Combining Current Measurements with Detection of Cleavage Fragments

所述方法可用于研究蛋白酶对异源表达于Xenopus laevis卵母细胞中的离子通道、受体及其他质膜蛋白的影响。结合定点突变技术，该方法为鉴定具有功能相关性的蛋白酶切位点提供了有力工具。蛋白水解激活是氨氯吡脒敏感性上皮钠通道（ENaC）的一个特征性特征。其最终激活步骤涉及通道γ亚基在关键区域的切割，该区域可能被多种蛋白酶（包括胰凝乳蛋白酶和纤溶酶）靶向。为确定这些丝氨酸蛋白酶对ENaC的刺激作用，采用双电极电压钳技术，在同一卵母细胞中分别于蛋白酶处理前后两次测量氨氯吡脒敏感性全细胞电流（ΔIami）。在进行电生理实验的同时，采用生物素标记方法监测细胞表面γENaC切割片段的出现情况。通过使用所述方法，证明了ENaC介导的全细胞电流的蛋白水解激活过程与细胞表面γENaC切割产物的出现时间相一致。这些结果提示通道切割与通道激活之间存在因果关系。此外，结果也证实了γENaC的切割事件是蛋白水解激活通道所需的最后一步。本文所述方法也可适用于其他类型离子通道或膜蛋白的类似研究问题。

为了研究丝氨酸蛋白酶纤溶酶是否能够激活ENaC介导的电流，采用双电极电压钳技术（见图1），测定表达ENaC的单个卵母细胞在蛋白酶-free溶液（对照组）（图2A）或含纤溶酶溶液（图2B）中孵育30分钟前后的ΔIami。暴露于纤溶酶后，所测定的每一个卵母细胞的ΔIami均增加。相比之下，在对照实验中，将表达ENaC的卵母细胞在无蛋白酶溶液中孵育30分钟几乎无影响（图2 C,D）。因此，利用该方法可检测到纤溶酶对ENaC介导电流的刺激作用。
为了研究突变假定的切割位点对ENaC介导电流激活以及通道切割的影响，将胰凝乳蛋白酶（chymotrypsin）对野生型ENaC（WT-ENaC）的作用与对一种突变型ENaC的作用进行了比较，该突变型ENaC的前列腺素酶（prostasin）和纤溶酶（plasmin）切割位点已被突变（γRKRK178AAAA;K189A）。通过使用不同的蛋白酶孵育时间，研究了胰凝乳蛋白酶激活通道的动力学过程以及细胞表面ENaC切割产物的出现情况（图4A）。结果显示，该突变通道会延迟并减弱胰凝乳蛋白酶对ENaC介导电流的激活作用。这一现象与一个分子量较低的γENaC切割片段（67 kDa）——对应于完全切割的亚基——在细胞表面出现的时间延迟相一致。切割片段的检测使用了针对C末端表位的γENaC抗体（图3）。该方法学结果表明，ENaC介导电流的蛋白水解激活过程的时间进程与细胞表面67 kDa γENaC切割产物的出现具有相关性（图4 B,C）。这支持了蛋白水解性通道切割与通道激活之间存在因果关系的观点13。此外，通过结合电流测量与细胞表面γENaC片段的检测，证明了这些被突变的切割位点在蛋白水解性通道激活过程中具有功能相关性。
<img alt="ENaC卵母细胞ΔI_ami测量流程图；蛋白酶激活通道方法。" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51582/51582fig1highres.jpg" width="500" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图1"> 
图1. 测定蛋白酶对异源表达于非洲爪蟾（Xenopus laevis）卵母细胞中ENaC刺激作用的实验流程。 通过测量阿米洛利敏感的全细胞电流组分ΔIami来评估ENaC活性。
<img alt="电生理实验；对照/纤溶酶条件下电流变化（ΔI_ami）的图示。" fo:content-width="4in" src="/files/ftp_upload/51582/51582fig2highres.jpg" width="400" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 2"> 
图 2. 纤溶酶刺激表达 ENaC 的卵母细胞中由 ENaC 介导的电流。（A-D） 表达人源 ENaC 的卵母细胞在无蛋白酶溶液（对照）或含纤溶酶（10 μg/ml）的溶液中孵育 30 分钟。为测定孵育前（-）和孵育后（+）的 ΔIami，将卵母细胞钳制在 -60 mV 的保持电位。 （A, B） 来自同一批卵母细胞的四个代表性全细胞电流轨迹。如黑色条所示，浴液中存在阿米洛利（ami），以特异性抑制 ENaC。 （C） 来自单个卵母细胞的数据点由连线连接。 （D） 显示与 C 类似实验的汇总结果。柱状图表示对 ΔIami 的相对刺激效应，计算方式为 30 分钟孵育后测得的 ΔIami（ΔIami 30 min）与孵育前测得的初始 ΔIami（ΔIami initial）的比值。柱内数字表示所测量的单个卵母细胞数量。N 表示不同批次卵母细胞的数目。（本图改编自 [Haerteis et al. 2012 J Gen Physiol 140, 375-389, doi:10.1085/jgp.201110763]）
<img alt="γ-ENaC 示意图；纤溶酶、胰凝乳蛋白酶、弗林蛋白酶的蛋白水解切割位点；抗体结合位点。" fo:content-width="4in" src="/files/ftp_upload/51582/51582fig3highres.jpg" width="400" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 3"> 
图 3. γENaC 亚基的示意图，显示蛋白水解激活的切割位点以及所用抗体的结合位点。高尔基体相关转化酶弗林蛋白酶（furin）介导的蛋白水解切割在通道到达质膜之前，对ENaC在生物合成途径中的成熟至关重要。在弗林蛋白酶切割后，可通过生物素化方法及针对γ亚基C末端表位的抗体，在细胞表面检测到一个76 kDa的片段。蛋白水解激活ENaC的关键最后一步可能发生在质膜上，此时γENaC被细胞外蛋白酶（例如纤溶酶或胰凝乳蛋白酶）在远离弗林蛋白酶切割位点的区域切割，产生一个67 kDa的切割片段。（此图改编自[Haerteis et al. 2012 J Gen Physiol 140, 375-389, doi:10.1085/jgp.201110763]）
<img alt="糜蛋白酶消化分析蛋白质；显示76 kDa、67 kDa结果的图表和Western印迹。" fo:content-width="3in" src="/files/ftp_upload/51582/51582fig4highres.jpg" width="300" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图4"> 
图4：同时突变纤溶酶（K189）和丝氨酸蛋白酶prostasin的切割位点（RKRK178）会延迟ENaC介导电流的激活以及通道γ亚基67 kDa切割产物的出现。 表达野生型（空心符号）和γRKRK178AAAA;K189AENaC突变通道（实心符号）的卵母细胞在无蛋白酶溶液中孵育30分钟（对照组），或在含有糜蛋白酶（2 μg/ml）的溶液中分别孵育5、30或60分钟。(A) 为测定孵育前后的ΔIami，将卵母细胞钳制在-60 mV的保持电位。圆圈表示孵育5、30或60分钟后测得的ΔIami（ΔIami min）与孵育前测得的初始ΔIami（ΔIami initial）的比值。每个数据点代表来自四个不同批次共22–24个独立卵母细胞测得的平均ΔIami。(B–D) 在检测ΔIami的同时，通过SDS-PAGE分析细胞表面生物素标记的γENaC的表达。使用针对人γENaC C末端表位的抗体检测γENaC。图中显示了一个批次卵母细胞的代表性Western印迹结果。(C–E) 对与B或D图相似的三个Western印迹进行的密度分析。对每条泳道中76 kDa区域（空心柱）和67 kDa区域（灰色柱）的信号进行定量，并归一化至总信号之和。N 表示不同批次卵母细胞的数量。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51582/51582fig4highres.jpg" target="_blank">点击此处查看高清图像。</a>

通过结合电流测量与生物素标记方法，可检测在Xenopus laevis卵母细胞中异源表达的上皮钠通道（ENaC）在细胞表面出现的离子通道切割产物，从而证明其蛋白水解激活。利用定点突变技术可鉴定具有功能重要性的切割位点。

通过电流测量与裂解片段检测相结合展示上皮钠离子通道（ENaC）的蛋白水解激活

所描述的方法可用于研究蛋白酶对异源表达的离子通道、受体及其他质膜蛋白的作用。

以下实验的总体目标是研究蛋白酶对在扎普拉瓦细胞中异源表达的上皮钠离子通道（ENaC）的作用。首先在卵母细胞中测量阿莫瑞特敏感性的全细胞电流，然后让卵母细胞恢复，再将其暴露于蛋白酶，随后再次测量电流。然后，平行地对卵母细胞进行生物素标记，并进行蛋白质印迹分析，以监测细胞表面γ亚基ENaC裂解片段的出现。实验结果表明，通过结合双电极电压钳技术和生物素标记方法，通道的裂解与通道的激活之间存在因果关系。该技术相较于现有方法（如非计划性测量）的主要优势在于，可在两次测量之间，将细胞暴露于蛋白酶或其他药理学试剂中，在小体积的测试溶液中实现不同持续时间的处理。在按照文本方案分离zap lava细胞并注射CN两天后，使用ND 96溶液填充重力灌流系统的其中一个注射器，使用含有酰胺的ND 96溶液填充第二个注射器。将注射器安装在浴槽室上方50厘米处后，打开150瓦卤素冷光源，并将其调节至卵母细胞浴槽室上方10厘米处，以便通过双目显微镜清晰观察。开启吸引装置，并将吸引管置于卵母细胞浴槽室内灌流管接头的对侧。接下来，使用静脉输液重力流速控制装置，调节每种溶液的灌流速度至每分钟3至5毫升。然后，使用接头通过微移液器极性拉制玻璃毛细管，将灌流管连接至卵母细胞浴槽室，以获得尖端直径小于1微米的毛细管。然后使用3摩尔的氯化钾将毛细管填充至约四分之一满。将毛细管插入电流电极和电压电极的电极架中，并利用显微操作器将其置入含有2微摩尔酰胺溶液的ND 96溶液中。为测量对酰胺敏感的全细胞电流，首先调节VM偏移按钮，使电压电极的电极电位归零，再调节VE偏移按钮，使电流电极的电位归零。将一个尿道上皮（UO）位点放入浴槽室中，并靠近电压感应电极。然后使用两根微电极轻轻刺入该UO位点，将放大器的钳制电位设为-60毫伏，并开启图表记录仪。随后打开含酰胺溶液。接下来，开始记录，必要时调整增益。当测得的电流达到稳定平台期后，切换至不含酰胺的溶液。一旦电流再次达到平台期，将灌流液换回含酰胺的溶液。随后，当尿道上皮（UO）位点的电流恢复至初始基线水平时，关闭电压钳并轻柔撤出电极，以允许细胞膜在穿刺部位重新封闭。将Uoc位点放入含有100至150微升无蛋白酶ND 96溶液的96孔板的一个孔中，孵育5分钟，随后将UOC位点转移至含蛋白酶的溶液或不含蛋白酶的对照溶液中。孵育后30分钟内重复电流测量，在体视显微镜下丢弃有缺陷的卵母细胞，并分别制备含适当蛋白酶和不含蛋白酶的抗96溶液。通过标记移液枪头并短暂灼烧其尖端来制备移液枪，以避免损伤卵母细胞。向六孔板的每个孔中加入 2.5 毫升室温的 ND 96 或含蛋白酶的 ND 96。然后每孔加入 30 个卵母细胞，在室温下孵育 30 分钟。在向新的六孔板各孔中加入 2.5 毫升 ND 96 后，将每组卵母细胞转移至含有 ND 96 的孔中。将卵母细胞依次移入另外两个含有 ND 96 的孔中，以洗去残留的蛋白酶，并在最后一个孔中孵育 5 分钟。根据文本方案，用生物素洗脱缓冲液配制生物素。将每组卵母细胞放入含有 2.5 毫升生物素洗脱缓冲液的孔中，轻轻振荡孵育 15 分钟。随后，将每组卵母细胞转移至含有 2.5 毫升淬灭缓冲液的孔中，以终止生物素反应，再转移至第二孔淬灭缓冲液中，孵育 5 分钟。轻柔振荡，将每组卵母细胞转移至1.5毫升微量离心管中，加入1毫升裂解缓冲液（含蛋白酶抑制剂），并通过27号针头反复推注以裂解细胞。将裂解物在1500 × g 条件下离心10分钟。将上清液转移至新的1.5毫升离心管中，管内预先加入TRITON X-100和MP-40，冰上孵育20分钟。每组卵母细胞加入100 µL预平衡的agarose beads，充分涡旋混匀以溶解蛋白质，随后将beads加入蛋白-去垢剂溶液中，4°C条件下旋转孵育过夜。第二天，将样品在1500 × g 条件下离心3分钟。然后将上清液转移至新的离心管中，用于检测细胞表面的活化裂解片段。通过使用裂解缓冲液洗涤磁珠3次来修复凝胶样品，然后加入2× SDS-PAGE上样缓冲液。将样品在20,000 × g 条件下离心3分钟后，用移液器将上清液转移至新的微量离心管中。根据文本方案通过蛋白质印迹法分析样品，以研究丝氨酸蛋白酶纤溶酶是否能够激活ENaC介导的电流。在将表达ENaC的细胞分别于无蛋白酶溶液或含纤溶酶溶液中孵育30分钟前后，测定各个细胞的delta IE值。采用此处所示的双电极电压钳技术，结果显示，所有被检测的细胞在暴露于纤溶酶后，delta IE均有所增加。相比之下，在不含蛋白酶的溶液中孵育则几乎无影响。该图比较了χ-胰蛋白酶对野生型ENaC以及对突变的prostasin和纤溶酶切割位点ENaC的作用。如图所示，该突变通道延迟并减弱了χ-胰蛋白酶介导的ENaC电流激活。此外，与野生型 ENaC 相比，其切割片段的生成速率降低。观看本视频后，您应能充分理解如何结合使用上述方法，将蛋白酶对细胞内事件的刺激作用与细胞表面切割产物的出现相关联。这一方法可广泛应用于多种研究场景，例如，用于探讨蛋白酶对其他离子通道、转运蛋白或跨膜受体调控的类似问题。

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Biology

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