Name: 一种新型声带生物反应器的构建与鉴定 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-08-01T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 11 s
Description: 了解利用新型生物反应器模拟声带振动环境，研究振动刺激对间充质干细胞行为的影响。该方法结合聚己内酯支架与激光多普勒测振技术，为喉科学中声带发育与疾病治疗提供重要研究工具。

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我们感谢 Jeffrey Caplan 博士在共聚焦成像方面的培训与指导。同时感谢 Keck 电子显微镜实验室及 Chaoying Ni 博士在扫描电镜方面的协助。本研究由美国国立卫生研究院（NIDCD，R01DC008965 和 R01DC011377）资助。ABZ 感谢美国国家科学基金会整合型研究生教育 &amp;#38; 研究培训计划（IGERT）项目提供的资助。

1. 生物反应器组装（视频 1）
<ol>
	<li>使用预先确定内径和外径的铝制模具（圆形冲模 + 间隔销）（图&#160;1）。</li>
	<li>利用步骤1.1中的模具，使用市售硅胶弹性体试剂盒制备一片硅胶膜（直径：42 mm，厚度：1.5 mm，图&#160;1），膜中央带有一个嵌入式套管（直径：12 mm，厚度约0.25 mm，由图1中的间隔销成型）。</li>
	<li>制作一对丙烯酸块（图&#160;2（4, 5）），中间设有圆形开口（直径：24 mm），并在顶部块体（厚1.8 cm）和底部块体（厚0.9 cm）上雕刻相互匹配的凸脊与凹槽。10</li>
	<li>将硅胶膜夹在成对的丙烯酸块之间，使用设定为恒定扭矩（35 cN·m）的微型扭矩螺丝刀通过四个角上的螺丝固定组件。由此形成一个密封的振动腔，宽度为24 mm，深度为18 mm（图&#160;2C）。</li>
	<li>通过底部丙烯酸块上的另一组角螺丝，将一个3” 扩展范围迷你低音扬声器（图&#160;2D，8 Ω/20 W）安装在振动腔下方。至此，单个振动模块组装完成。</li>
	<li>再复制七个相同的振动模块。将其中四个模块固定在两条固定的铝条（40 cm × 10 cm × 2.5 cm）之一上，方法是将扬声器底座插入铝条上等距分布的圆形孔（直径：7 cm，厚度：2 cm）中。通过从铝条侧面插入螺丝进入每个圆形孔，以固定每个扬声器。</li>
	<li>通过扬声器选择器独立控制各个扬声器。将各扬声器的正负输入端通过导线连接至选择器对应的输出端。扬声器选择器可将信号发生器输出的信号经功率放大器放大后，同时传输至全部八个扬声器（图&#160;2E）。</li>
	<li>将两个腔体阵列、扬声器选择器及相关电子元件置于防潮外壳中，并将整个装置放置于商用细胞培养孵育箱内。</li>
	<li>将连接功率放大器与扬声器选择器的主电缆通过医用级PVC管，穿过孵育箱后部的过滤组件引入箱内。</li>
</ol>
2. 支架的制备与表征
<ol>
	<li>将PCL颗粒溶解于氯仿中，配制成15 wt%的溶液。将该溶液装入一个带有21 G钝头针头的10 ml注射器中。</li>
	<li>将注射器固定在可编程的注射泵上，并将流速设定为1 ml/hr。</li>
	<li>将覆盖有铝箔的收集器水平放置于针头正对面，针尖与收集器之间的距离约为18 cm。</li>
	<li>将正极鳄鱼夹夹在针头中部，接地鳄鱼夹夹在铝制收集器上，然后将高压电源的电压设定为15 kV。注意：高压危险，请勿靠近针头。</li>
	<li>依次开启注射泵和电源；在稳定纤维射流和泰勒锥19形成之前，迅速用干燥的纸巾清洁或去除针尖周围的残留聚合物溶液。</li>
	<li>使纤维在铝制收集器上积累至厚度约为250–300 µm（在当前纺丝条件下约需7小时）。将所得支架置于真空干燥器中保存1–2天，以去除任何残留溶剂。</li>
	<li>对经溅射镀金处理的支架进行扫描电子显微镜成像，以显示一致的纤维形貌。10</li>
</ol>
3. 生物反应器组装与表征
<ol>
	<li>从制备好的PCL膜上冲压出一个带四个臂的圆柱形圆盘（直径：8 mm，臂长：2 mm）图&#160;2A) 首先使用直径为12 mm的活检打孔器切割圆盘的外缘。然后使用第二个8 mm的活检打孔器，在圆形刀片周围均匀制作四个长度为2 mm的切口，以标记出臂部将要切割的位置。用8 mm打孔器刻痕后，使用手术刀片将臂部边缘向外切割。将支架插入硅胶膜的凹槽中 通过 伸展手臂（视频1）。使用平头镊子轻轻按压表面，将植入的支架压平。</li>
	<li>将一小片薄铝箔（8 mm × 2 mm，正交形状） 图&#160;2B) 涂覆于PCL支架上以辅助激光反射。</li>
	<li>将组装好的硅胶膜/PCL支架（详见步骤1.4）固定在振动室中。向振动室内加入1.5 ml水，以在振动前充分润湿PCL支架。</li>
	<li>使用函数发生器引入振动信号（例如， 将峰峰值电压（Vpp）为 0.1 V 的 200 Hz 正弦波施加到夹层丙烯酸腔室。使用电压表精确测量每个扬声器输入端的电压。注意：函数发生器显示的 Vpp 读数将不同于实际输送至扬声器的电压。</li>
	<li>组装单点激光多普勒测振仪，并将光纤激光传感器探头固定在云台三脚架上。调整传感器探头角度，使其垂直指向桌面。通过同轴电缆将激光多普勒测振仪传感器探头连接至数据采集模块，再通过USB线将模块连接至笔记本电脑。</li>
	<li>将激光束垂直聚焦于硅胶膜上各个预设的位置图&#160;2B 和 图&#160;3).</li>
	<li>使用数据采集软件记录膜中心位移。从“选项”菜单中点击“采集设置”，然后将测量模式更改为“FFT”。接着，点击主工具栏中的“连续测量”，然后点击在选定频率处形成的峰值图&#160;6D以记录位移。</li>
	<li>绘制正常中膜位移（w0) 作为基底上相对位置的函数。使用 Origin 8.5 数据分析软件构建表面振动特性的三维色谱图。</li>
</ol>
4. 振动式细胞培养
<ol>
	<li>在T150组织培养瓶中传代培养人骨髓来源的MSCs，初始接种密度为4,000–5,000个细胞/cm²2 在MSC维持培养基中。</li>
	<li>细胞培养 7-8 天后（至约 85% 汇合度），使用细胞解离试剂（如 accutase）对细胞进行消化，用血细胞计数板计数，离心（440 × g，5 分钟），并将细胞沉淀重悬于新鲜的 MSC 维持培养基中，细胞浓度为 4.5 × 10⁴6 cells/ml</li>
	<li>将PCL支架浸入70%乙醇中过夜。待溶剂挥发后，将支架两侧暴露于杀菌紫外光（254 nm）下照射5–8分钟。</li>
	<li>将PCL支架浸泡于20 µg/ml的纤连蛋白溶液中，37 °C孵育1小时。将涂覆纤连蛋白的支架插入硅胶膜中。按照步骤1所述组装生物反应器。</li>
	<li>将40 µl细胞悬液均匀分布在固定的PCL支架上。在振动室中加入额外的1.5 ml新鲜培养基之前，让细胞贴壁1-1.5小时。</li>
	<li>将负载MSC的PCL支架进行静态培养3天，静态培养结束后更换培养基。</li>
	<li>对细胞构建物施加选定的振动模式。注意：例如，细胞在200 Hz频率下接受1小时开启、1小时关闭（OF）的振动，振幅为w0 每天振动刺激约40 μm，持续12小时，最多7天。接受振动刺激的样品标记为Vib组，而在相同振动室中静态培养的样品作为静态对照组（Stat）。</li>
</ol>
5. 生物学评价
<ol>
	<li>每隔一天（第1、3、5和7天）从每个培养室收集200 µl细胞培养基，并将同一样本的各次收集液合并（每份共800 µl）。</li>
	<li>分别使用MMP1 ELISA开发试剂盒和透明质酸竞争性ELISA试剂盒，按照制造商提供的操作步骤定量检测基质金属蛋白酶-1（MMP1）和透明质酸（HA）的细胞生成量。同时，根据先前报道的ELISA方法检测可溶性弹性蛋白前体的生成量。8</li>
	<li>在第7天完成最后一次振动循环后，立即使用尖头镊子将细胞构建物从振动室中取出，并用预冷的磷酸盐缓冲液（PBS，4 °C）短暂冲洗。</li>
	<li>进行活/死细胞染色时，将构建物在室温下同时与碘化丙啶（1:2,000 PBS稀释）和Syto-13（1:1,000 PBS稀释）孵育5分钟。使用多光子共聚焦显微镜对染色后的构建物进行成像。</li>
	<li>另取经PBS冲洗的细胞构建物，迅速在干冰上冷冻，随后按照先前报道的方法提取总细胞RNA用于基因分析。9</li>
	<li>使用紫外-可见分光光度计检测所提取RNA的浓度和纯度。选择A260/A280和A260/A230比值在1.8–2.2之间的RNA样本用于后续qPCR分析。</li>
	<li>使用市售的逆转录试剂盒将RNA（500 ng/样本）逆转录为cDNA。</li>
	<li>采用市售的PCR预混液，在实时荧光定量检测系统上进行PCR反应，操作步骤依据先前详细描述的方法进行。8</li>
	<li>使用商业化的qPCR数据分析软件分析结果。为确保数据分析的可靠性，选用多个参考基因（YWHAZ、TBP、PPIA）作为内参对照，并考虑特异性引物扩增效率的差异。8</li>
</ol>

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</ol>

不存在竞争性财务利益。

成功构建功能性声带组织 体外 需要重建类似声带的微环境，以调控多能细胞的行为。通常认为，组织或器官的结构反映了其所需执行的功能。22 对于声带组织，发声过程中产生的高频振动被认为对组织成熟具有重要作用。在本研究中，采用聚己内酯（PCL）支架以提供类似韧带的结构支撑，同时设计声带生物反应器，用于向培养的间充质干细胞（MSCs）施加生理相关的机械信号。本文所述的生物反应器（J2）通过独立的扬声器以电磁方式产生振动，并通过空气动力学方式将能量传递至培养的细胞。与我们之前的设计相比，18 当前系统将振动刺激源直接移至每个样品孔下方，从而实现了更高效的能量转换。因此，使用当前系统可获得显著更大的法向位移和更高的加速度。模块化设计还最大限度地减少了不同振动腔室之间的系统差异和机械干扰。
我们的设计依赖于硅胶膜来传递振动信号，因此保持膜的完整性和均匀性至关重要。将前驱体溶液倒入铝制模具后，可通过移动玻璃片刮过模具表面，以去除多余的液体。通过降低固化温度并延长固化时间，可制备出无夹杂气泡的一致性膜。此外，可使用70%乙...

人类声带由上皮层、固有层（LP）和声带肌组成，是一种特殊的软组织，可将来自肺部的气流转化为声波以产生声音。1 在正常发声过程中，声带会规律性地振动，其应变可达30%，基频范围为100–300 Hz。2 成人声带固有层为一种梯度结构，由浅层（SLP）、中层（ILP）和深层（DLP）组成。进一步的分类将上皮层和浅层固有层归为黏膜层，而将中层与深层固有层合并为声带韧带。3 浅层固有层主要包含无定形基质及稀疏分布的胶原纤维，而声带韧带则富含成熟的胶原纤维和弹性纤维，以提供足够的强度。4 新生儿声带的结构与力学特性与其成熟状态存在显著差异。尽管调控声带发育与成熟的具体机制尚未完全阐明，但实验证据已表明发声所引起的机械应力在其中起着决定性作用。
多种医学状况，包括发声滥用、感染、化学刺激物以及外科手术，均可能损伤声带。据估计，声带疾病影响了美国3%至9%的人口。目前对声带疾病的治疗方法有限5，而基于干细胞的组织工程技术已成为恢复声带功能的一种有前景的策略。间充质干细胞（MSCs）是声带组织工程中替代原代声带成纤维细胞的合适选择6-9。干细胞命运的决定及其后续的组织发育受到其所处特定微环境的调控，其中力学条件是一个关键因素10。机械力是组织形态发生和稳态的重要调节因子，尤其对于经常承受机械负荷的组织而言更是如此11。从组织工程的角度来看，已有研究表明，暴露于生理相关的机械刺激可促进干细胞分化及组织特异性基质重塑12-15。
组织培养生物反应器旨在模拟细胞或组织体外生长所需的生理环境。in vitro。在声带组织工程中，尤其关键的是重建发声时声带的力学环境。理想的声带生物反应器应能有效向培养细胞传递振动刺激，并便于精确控制振动的频率、振幅和持续时间。Titze 及其同事设计了一种声带生物反应器（T1 生物反应器）16，该装置结合静态拉伸与高频（20–200 Hz）振荡，以促进细胞合成基质蛋白。利用该生物反应器，Webb 及其同事17研究了在透明质酸（HA）水凝胶中培养的真皮成纤维细胞在连续10天、100 Hz振动下的反应。与静态对照组相比，接受振动刺激的构建物表现出更高的透明质酸合成酶-2（HAS2）、decorin、fibromodulin 和基质金属蛋白酶-1（MMP1）的表达水平。这些促进效应具有时间依赖性。最近，我们课题组18构建了一种声带生物反应器（J1 生物反应器），该系统由功率放大器、信号发生器、封闭式扬声器以及一个环向固定的硅胶膜组成，通过振荡气流将机械振动传递至附着其上的细胞。在J1生物反应器中培养的新生儿包皮成纤维细胞分别接受了60 Hz、110 Hz或300 Hz频率、持续1小时的振动刺激，平面应变最高达0.05%。qPCR结果表明，不同振动频率和振幅可适度调节部分细胞外基质（ECM）基因的表达水平。
这些生物反应器设计虽然引人关注，但仍存在若干局限性。例如，T1 系统需要大量连接件和机械耦合杆，限制了可达到的最高频率。此外，细胞可能受到不必要的机械搅动和流体扰动，从而增加数据解读的复杂性。而 J1 生物反应器的能量转换效率相对较低，且操作不够便捷。另外，振动常常会导致负载细胞的构建物从底层硅胶膜上脱落。本文报道的 J2 声带生物反应器基于与 J1 相同的设计原理，但在一致性和可重复性方面进行了优化。模拟发声的振动通过空气动力学方式在独立适配的振动腔室内产生，其中负载间充质干细胞（MSC）的纤维状聚（ε-己内酯）（PCL）支架被有效固定。激光多普勒测振仪（LDV）可让用户验证膜/支架组件的振动特性。在本研究的示例中，MSCs 每日接受 200 Hz 正弦振动，采用 1 小时开启、1 小时关闭（OF）的模式，累计振动 12 小时，持续 7 天。对细胞响应所施加振动信号的情况进行了系统性研究。总体而言，J2 声带生物反应器具备最优良的用户友好特性，可实现高通量、可重复的动态细胞培养研究。

<table><tbody><tr><td>硅胶弹性体试剂盒</td><td>Dow Corning</td><td>Sylgard 184</td><td>在 100 &amp;#176;C 下固化膜 2 小时</td></tr><tr><td>PCL</td><td>Sigma Aldrich</td><td>440744-500G</td><td>Mn ~80 kDa，过夜溶解</td></tr><tr><td>氯仿</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C7559-5VL</td><td></td></tr><tr><td>人骨髓来源间充质干细胞（MSCs）</td><td>Lonza</td><td>PT-2501</td><td>第 2 代传代后接收</td></tr><tr><td>MSC 维持培养基</td><td>Lonza</td><td>PT-3001</td><td>基础培养基中含 10% FBS，并补充&lt;br/&gt; L-谷氨酰胺、庆大霉素和两性霉素</td></tr><tr><td>细胞解离试剂 Accutase</td><td>Life Technologies</td><td>A11105-01</td><td></td></tr><tr><td>乙醇</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E7023-500ML</td><td></td></tr><tr><td>纤维连接蛋白</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F2006-1MG</td><td></td></tr><tr><td>MMP1 DuoSet ELISA 试剂盒</td><td>R&amp;D systems</td><td>DY901</td><td></td></tr><tr><td>透明质酸（HA）ELISA 试剂盒</td><td>Echelon Biosciences</td><td>&amp;nbsp;K-1200&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Life Technologies</td><td>14190-136</td><td></td></tr><tr><td>碘化丙啶&amp;nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>P1304MP</td><td></td></tr><tr><td>Syto-13&amp;nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>S7575</td><td></td></tr><tr><td>QuantiTect 反转录试剂盒&amp;nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>205311</td><td></td></tr><tr><td>SYBR Green PCR 主混合液</td><td>Life Technologies</td><td>4309155</td><td></td></tr><tr><td>替换扬声器</td><td>DAYTON audio&lt;br/&gt;（通过 Parts Express）</td><td>DS90-8</td><td>纸锥，全频段（80–13,000 Hz），85 dB</td></tr><tr><td>Ergo 微扭矩螺丝刀</td><td>Mountz</td><td># 020377</td><td>扭矩范围：20–120 cN&amp;#183;m</td></tr><tr><td>立体声扬声器选择器</td><td>RadioShack</td><td>40-244</td><td>最大功率承载 50 W</td></tr><tr><td>函数发生器&amp;nbsp;</td><td>Agilent&amp;nbsp;</td><td>33220A</td><td>频率范围：1 &amp;micro;Hz–20 MHz</td></tr><tr><td>功率放大器&amp;nbsp;</td><td>PYLE audio</td><td>PylePro PT2400</td><td>频率响应：10 Hz–50 kHz，双扬声器&lt;br/&gt;通道</td></tr><tr><td>细胞培养箱&amp;nbsp;</td><td>Thermo Fisher&amp;nbsp;</td><td>Steri-Cult 3307</td><td></td></tr><tr><td>注射泵&amp;nbsp;</td><td>New Era Pump Systems</td><td>NE-300</td><td></td></tr><tr><td>高压电源</td><td>Spellman</td><td>CZE 1000R</td><td>输出电压：0–30 kV</td></tr><tr><td>扫描电子显微镜&amp;nbsp;</td><td>JEOL-USA</td><td>JSM-7400F</td><td></td></tr><tr><td>台式金溅射镀膜仪</td><td>Denton Vacuum</td><td>DSK00V-0013</td><td></td></tr><tr><td>多普勒激光测振仪&amp;nbsp;</td><td>Polytec</td><td>PDV-100</td><td>非接触式速度测量（0–22 kHz）</td></tr><tr><td>PCR 序列检测系统&amp;nbsp;</td><td>Applied Biosystems</td><td>ABI7300</td><td></td></tr><tr><td>多光子共聚焦显微镜</td><td>Zeiss</td><td>Zeiss 510Meta NLO</td><td></td></tr><tr><td>紫外-可见分光光度计&amp;nbsp;</td><td>NanoDrop Products&lt;br/&gt; 通过 Thermo Scientific</td><td>ND-2000</td><td></td></tr><tr><td>VibSoft 数据采集软件</td><td>Polytec</td><td></td><td>采集带宽最高达 40 MHz</td></tr><tr><td>Origin 8.5 数据分析软件&amp;nbsp;</td><td>OriginLab</td><td></td><td></td></tr><tr><td>qbasePlus qPCR 数据分析软件&amp;nbsp;</td><td>Biogazelle</td><td>V2.3</td><td></td></tr><tr><td>铝合金&amp;nbsp;</td><td>McMaster-Carr</td><td>Alloy 6061</td><td></td></tr><tr><td>丙烯酸块</td><td>McMaster-Carr</td><td></td><td></td></tr><tr><td>聚碳酸酯防潮培养室</td><td>McMaster-Carr</td><td></td><td>抗冲击&amp;nbsp;聚碳酸酯</td></tr><tr><td>螺丝&amp;nbsp;</td><td>McMaster-Carr</td><td></td><td></td></tr><tr><td>电子电缆/导线</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>医用级 PVC 管</td><td>US Plastic Corp.</td><td>Tygon S-50-HL</td><td>透明，生物相容性</td></tr><tr><td>10 ml 注射器&amp;nbsp;</td><td>Becton Dickinson</td><td>309604</td><td></td></tr><tr><td>21 G 钝头针</td><td>Small Parts</td><td>NE-213PL-25</td><td>1-1/2&quot; 长度</td></tr><tr><td>鳄鱼夹适配器&amp;nbsp;</td><td>RadioShack</td><td>270-354</td><td>完全绝缘</td></tr><tr><td>8 mm 活检打孔器</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.sklarcorp.com/ProductListUS.aspx?DepartmentID=10&amp;CategoryID=96">Sklar&amp;nbsp;外科器械&lt;/a&gt;</td><td>96-1152</td><td>无菌，一次性使用</td></tr><tr><td>12 mm 活检打孔器</td><td>Acuderm（通过 Fisher Scientific）</td><td>NC9998681</td><td></td></tr><tr><td>组织培养瓶</td><td>Corning</td><td></td><td>细胞培养处理</td></tr></tbody></table>

新型声带生物反应器的构建与表征

Construction and Characterization of a Novel Vocal Fold Bioreactor

体外 构建力学活性组织需要向培养细胞提供符合生理条件的力学环境。为模拟声带的动态环境，本研究设计并表征了一种新型声带生物反应器，该装置能够产生基频发声频率范围内的振动刺激。该设备由信号发生器、功率放大器、扬声器选择器以及多个并联的振动腔室组成。每个振动腔室通过将定制的硅胶膜夹在一对丙烯酸块之间而构成。该硅胶膜不仅作为腔室的底部，还提供了固定细胞接种支架的机制。安装在底部丙烯酸块下方的扬声器产生的振动信号，通过振荡气流以空气动力学方式传递至膜结构。八个相同的振动模块固定在两根静止的金属杆上，并置于防潮密闭箱内，以确保在细胞培养孵育箱中长期稳定运行。采用激光多普勒测振仪（LDV）对声带生物反应器的振动特性进行无损分析。通过在200 Hz正弦振动、膜中心位移为40 µm的条件下培养细胞构建物，验证了该动态培养装置的功能。间充质干细胞在生物反应器中对振动信号产生响应，改变与声带相关的细胞外基质成分的合成与降解。本文所介绍的新型生物反应器系统提供了一个优异的 体外 用于研究振动诱导的机械转导以及功能性声带组织工程的平台。

通过静电纺丝制备的PCL支架含有微米级的间隙孔，纤维随机缠结，平均直径为4.7 µm（图4A）。在更高放大倍数下，可在单根纤维上观察到纳米级的沟槽和孔隙（图4B）。用纤连蛋白包被支架可提高其亲水性，并促进细胞在PCL支架上的初始黏附与铺展（未发表观察结果）。
具有所需频率的正弦波形（f, 100-300 Hz）和电压（Vpp：0-0.125 V）施加到每个振动腔下方的扬声器，驱动硅胶膜底部与微型低音扬声器纸盆之间的封闭空气产生振荡。该空气振荡传递至含或不含细胞的PCL支架。采用LDV分析支架在特定条件下的振动特性 f 并考虑水的折射率（1.33）对Vpp的影响。20 图 5 显示法向位移（w0) 作为 Vpp 的函数，在 PCL 支架中心处 和 f振动频率的选择旨在反映人类语音的基本频率。21 w 之间存在线性关系0 且...

一种新型声带生物反应器被构建并表征，该反应器能够向培养细胞施加生理相关的振动刺激。该动态培养装置与纤维状聚（ε-己内酯）支架构建出一种模拟声带的微环境，可调控间充质干细胞的行为。

体外构建具有机械活性的组织需要为培养的细胞提供符合生理条件的力学环境。为了……

以下实验的总体目标是利用一种模拟发声的生物反应器，研究振动刺激对间充质干细胞的影响。首先制备聚ε-己内酯支架，为细胞培养提供类似于声带韧带的三维基质。第二步，将支架嵌入硅胶膜中，以促进振荡传递至细胞构建物。接下来利用激光多普勒振动仪测定每种膜支架组合的振动特性。最终可进行EISA和定量R-T-P-C-R分析，以评估细胞在蛋白和转录水平的反应。该方法可解答喉科学领域的一些关键问题，例如声带如何成熟以及发声滥用的后果。该技术的应用前景涉及声带疾病的治疗，因为利用此方法制备支架可实现对细胞水平的精确控制。首先，将PCL颗粒溶解于氯仿中，浓度为15 wt%。然后将所得溶液装入带有21号钝头针头的10毫升注射器中。将注射器固定在可编程注射泵上，并将流速设定为1毫升/小时。然后将一个覆盖铝箔的收集器水平放置在针头对面，针尖到收集器的距离约为18厘米。接着，用一个正极鳄鱼夹夹住针的中部，并将该夹子接地至收集器。将高压电源的电压设置为15千伏，操作时注意远离针头。然后打开注射泵和电源。在针尖处形成稳定的纤维射流和泰勒锥之前，使用干燥的纸巾迅速擦去针尖周围残留的聚合物溶液，使纤维在铝制收集器上积累约七小时，厚度达到250至300微米。随后将所得支架置于真空干燥器中保存一至两天，以去除任何残留溶剂。PCL支架将含有微米级的间隙孔隙，以及平均直径约为4.7微米的随机缠结纤维。在更高倍数下，可观察到单根纤维上存在纳米级的沟槽和孔隙，这些结构用于组装生物反应器。首先使用直径为12毫米的活检打孔器，从新制备的PCL膜上切取一个外径为8毫米的圆形片状样品，然后使用第二个直径为8毫米的活检打孔器标记出需要切割臂状结构的位置。评分后，使用手术刀片将分支末端向外切割，并通过延伸的分支将支架插入硅胶膜的凹槽中。用平头镊子轻轻按压支架表面，使其平整，然后将一块8毫米×2毫米的薄铝箔贴附在PCL支架上。为增强激光反射效果，将组装好的硅胶膜-PCL支架固定于振动室中。然后将硅胶膜夹在成对的丙烯酸块之间。使用微型扭矩螺丝刀将四个角上的螺丝固定，螺丝刀设定为恒定的35厘牛·米扭矩，从而形成一个密封的、宽24毫米、深18毫米的振动腔室。接下来，通过底部丙烯酸块上的另一组角螺丝，将一个三脚支架的长行程微型低音扬声器安装在振动腔室下方，完成单个振动模块的组装。复制出另外七个振动模块后，将其中四个模块固定在两根固定的铝条之一上，方法是将扬声器底座放入铝条上等距分布的圆形孔中。在铝条上开孔后，通过从铝条侧面将螺丝插入每个圆形孔以固定每个扬声器。然后，将各个扬声器连接到选择器，方法是将导线连接到扬声器本体的正负输入端，并连接到选择器上对应的输出端。 通过功率放大器后的函数发生器信号可经由扬声器选择器同时传输至全部八个扬声器。随后将两个腔室阵列、扬声器选择器及相关电子设备放入防潮 enclosure 中，并将整个组件置于商用细胞培养孵育箱内。将主电缆穿过一段医用级PVC管，并通过孵育箱后部的滤波组件连接功率放大器和扬声器选择器。为了首先表征生物反应器，先向振动室中加入 1.5 毫升水，以在振动前润湿 PCL 支架。然后使用函数发生器，向夹心式丙烯酸室引入振动信号。请准确使用电压表。测量每个扬声器输入端的电压，然后组装单点激光多普勒振动仪。固定光纤激光传感器。将传感器安装在云台三脚架上，并调整传感器头部角度，使其垂直于桌面。然后通过同轴电缆将传感器探头连接到数据采集模块，并通过USB端口将模块连接到笔记本电脑。将激光束垂直聚焦于硅胶膜上的各个预定点，然后使用数据采集软件，在选项菜单中点击“采集设置”。接着，将测量模式更改为FFT，然后在主工具栏中点击连续测量工具。单击在选定频率下形成的峰值，以记录位移，并绘制相对于基底位置的正常中膜位移曲线。为建立振动细胞培养系统，首先在维持培养基中对人骨髓来源的间充质干细胞进行传代培养，接种于T150组织培养瓶中，初始接种密度为每平方厘米4至5×10³个细胞，培养7至8天。在实验前一天，将聚己内酯（PCL）支架浸入70%乙醇中过夜。次日早晨，使用Accutane消化细胞，随后离心收集细胞，并将沉淀重悬于新鲜维持培养基中，细胞浓度为每毫升4.5 × 10⁶个细胞。乙醇挥发后，将支架两侧暴露于杀菌紫外线下照射5至8分钟。然后将PCL支架浸泡于20 µg/mL的纤连蛋白溶液中，37 °C孵育1小时。如上所述操作生物反应器，然后将40微升细胞悬液均匀分配到固定好的支架上。让细胞贴附1至1.5小时，随后向振动室中加入额外的1.5毫升新鲜培养基。在静态培养负载间充质干细胞的PCL支架三天后，更换培养基，然后对细胞构建物施加选定的振动方案。振动频率的选择旨在反映人类语音的基本频率。在0至0.125伏特的范围内，所有测试频率下，法向位移与峰值电压之间均呈线性关系；在给定峰值电压时，当频率从100赫兹增加至300赫兹，法向位移随之减小。通过mRNA水平检测细胞对振动刺激的反应，评估其对声带关键细胞外基质蛋白的表达影响，这些蛋白包括弹性蛋白、透明质酸合成酶1、III型胶原蛋白α1链以及基质金属蛋白酶1。结果表明，采用每小时循环一次（开启1小时、关闭1小时）的振动刺激，弹性蛋白的表达量相较于静态对照组显著增加2.3倍。在第七天，振动刺激也能适度增加胶原蛋白的表达。值得注意的是，从第三天到第七天，振动信号显著增强了主要细胞外基质重塑酶——透明质酸合成酶1和基质金属蛋白酶1的表达。经过七天的振动刺激后，动态培养的细胞产生的可溶性弹性蛋白达到4.2 ± 0.1 µg/mg干支架重量，该结果通过ELISA检测得出。而静态对照组仅积累 2.7 ± 0.2 微克/毫克弹性蛋白。平均而言，七天内每振动一小时、静置一小时的处理，相对于静态对照组，透明质酸和 MMP-1 分泌分别增加了 2.2 倍和 4.7 倍。尽管我们的系统旨在研究 VOCO 形态的生理学特性，但它也可应用于许多其他系统。例如，耳部和人类皮肤组织。感谢观看。祝您的实验顺利。

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