一种新型声带生物反应器的构建与鉴定
August 1st, 2014
以下实验的总体目标是使用旨在模拟发声的生物反应器检查振动刺激对间充质干细胞的影响。这是通过创建聚 ε Capralactone 支架来实现的，为类似于声带韧带的细胞培养物提供三维底物。作为第二步，支架被掺入硅膜中，这有助于振荡转导到细胞构建体。
接下来，使用激光多普勒振动来确定每个膜支架组合的振动特性。最终，可以进行 EISA 和定量 R-T-P-C-R 分析，以评估蛋白质和翻译水平的细胞反应。这种方法可以回答喉学领域的关键问题，例如声带如何成熟以及声带滥用的后果。
该技术的意义延伸到声带疾病的治疗，因为现在使用这种方法可以达到细胞控制水平来制造支架，首先将 PCL 颗粒溶解在浓度为 15 重量百分比的氯仿中。然后将所得溶液装入 10 毫升注射器中，注射器盖有 21 号钝头针头。将注射器锁定在可编程注射泵上，并将流速设置为每小时 1 毫升。
然后将一个覆盖铝箔的集电极水平放置在针对面，针尖到集电极的距离约为 18 厘米。接下来，将正鳄鱼夹夹在针的中间，并将夹子接地到收集器上。将高压电源上的电压设置为 15 千伏，注意远离针头。
然后打开注射泵和电源。在稳定的纤维射流和裁缝锥形式之前，使用干纸巾快速去除针尖周围的残留聚合物溶液，让纤维在铝收集器上积累约 7 小时，厚度为 250 至 300 微米，然后将结果储存在真空干燥的支架中一到两天，以去除任何残留的溶剂。PCL 支架将包含微米大小的间质孔和平均直径约为 4.7 微米的随机缠结纤维。
在更高的放大倍率下，在单根纤维上可以看到纳米级的凹槽和孔隙，以组装生物反应器。首先使用 12 毫米直径的活检打孔器从最近纺成的 PCL 垫上切下 8 毫米圆盘的外径。然后使用第二个 8 毫米活检打孔器在手臂要切割的位置划痕。
划线后，用手术刀刀片向外切开臂的边缘，并通过伸出的臂将支架插入硅胶膜的凹槽中。使用平头镊子轻轻按压表面，将插入的脚手架压平，然后将一块 8 毫米 x 2 毫米的薄铝箔连接到 PCL 脚手架上。为了帮助激光反射，请将组装好的硅胶膜 PCL 脚手架固定在振动室中。
然后将硅膜夹在成对的丙烯酸块之间。使用微型扭矩螺丝刀将组件固定为每牛顿米 35 美分的恒定力，从而形成一个 24 毫米宽、18 毫米深的防水振动室。接下来，通过底部亚克力块上的另一组角螺钉，将三英尺长的加长范围迷你 wooer 安装在振动室下方，完成单个振动模块的组装。
复制 7 个额外的振动模块后，将扬声器底座放置在均匀分布的圆孔中，将其中 4 个模块固定在两个固定铝条之一上。切入条形，通过将螺钉穿过铝条的侧面插入每个圆孔来稳定每个扬声器。然后，通过将电线连接到扬声器主体上的正负输入以及选择器上的相应输出，将各个扬声器连接到选择器。
扬声器选择器允许来自函数发生器的信号在通过功率放大器后同时到达所有八个扬声器。然后将两个腔室阵列、扬声器选择器和相关电子元件放入防潮外壳中，将整个组件放入商用细胞培养箱中。将主电缆穿过一根医用级 PVC 管，并通过培养箱背面的过滤器组件连接功率放大器和扬声器选择器。
为了首先表征生物反应器，在振动室中加入 1.5 毫升水，以在振动前水合 PCL 支架。然后使用函数发生器，将振动信号引入夹层亚克力室。准确使用电压表。
测量每个扬声器输入端的电压，然后组装单点激光多普勒振动器。固定光纤激光传感器。将云台放在云台三脚架前，调整传感器头的角度，使其垂直于桌面。
然后通过同轴电缆将传感器头连接到数据采集模块，并通过 USB 端口将模块连接到笔记本电脑。将激光束垂直聚焦在硅胶膜上的各个预定点，然后使用数据采集软件，单击选项菜单中的采集设置。接下来，将测量模式更改为 FFT，然后单击主工具栏中的连续测量工具。
单击以所选频率形成的峰以记录位移，并将法向中膜位移绘制为衬底相对位置的函数。为了建立振动细胞培养物，首先在 T one 50 中传代培养人骨髓来源的间充质干细胞。在实验前一天，将组织培养瓶以 4 至 5 乘以 10 至每平方厘米的第三细胞在维持培养基中放置 7 至 8 天，将 A PCL 支架浸入 70% 乙醇中过夜。
第二天早上，用 Accutane 分离细胞，然后离心细胞，将沉淀重悬于新鲜的维持培养基中，浓度为 4.5 倍 10，至每毫升 6 个细胞。乙醇蒸发后，将脚手架的两侧暴露在杀菌紫外线下 5 到 8 分钟。然后在 1 小时后，将 PCL 支架在 37 摄氏度的 20 μg/mL 纤连蛋白溶液中浸泡。
生物反应器，然后均匀地将 40 μL 细胞悬液分配到固定的支架上。让细胞附着 1 到 1.5 小时，然后向振动室中额外添加 1.5 毫升新鲜培养基。在静态培养载有间充质干细胞的 PCL 支架三天后，刷新培养基，然后将选定的振动机制施加到细胞构建体上。
选择振动频率是为了反映基本的人类说话频率，法向位移和峰值峰值电压之间存在线性关系，范围为 0 至 0.125 伏，对于在给定峰值峰值电压下测试的所有频率，法向位移随着频率从 100 到 300 赫兹的增加而降低。在 mRNA 水平上检查细胞对振动刺激的反应，以检查基本声带的表达。细胞外基质蛋白，如弹性蛋白透明质酸合酶 1、胶原蛋白 3 型 α 1 和基质金属蛋白酶 1，表明相对于静态对照，循环 1 小时关闭振动导致弹性蛋白表达增加 2.3 倍。
在第 7 天，振动刺激也适度增加胶原蛋白的表达。值得注意的是，从第 3 天到第 7 天的振动信号显着增强了主要细胞外基质重塑酶透明质酸合酶 1 和基质金属蛋白酶 1 的表达。动态培养的细胞在振动 7 天后检测到每毫克干支架重量可溶性弹性蛋白，每毫克可溶性弹性蛋白正负 0.1 微克。
而静态对照每毫克弹性蛋白仅累积 2.7 正负 0.2 微克。平均 7 天，相对于透明质酸和 MMP 1 分泌的相应静态控制，1 小时振动 1 小时导致 2.2 倍和 4.7 倍的增加。虽然我们的系统旨在研究 VOCO 形式的生理学，但它也可以应用于许多其他系统。
例如，耳朵和人体真皮组织。感谢观看。祝你的实验好运。
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
概述
本研究利用一种新型仿生反应器来调查振动刺激对间充质干细胞的影响，该反应器旨在模拟发声。反应器集成了聚（ε-己内酯）支架，创造出类似声带的环境，影响细胞行为。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 细胞生物学
- 生物材料
背景
- 振动刺激对声带健康至关重要。
- 间充质干细胞可以分化为各种细胞类型。
- 生物反应器可以模拟细胞培养的生理条件。
- 理解声带成熟对喉科学非常重要。
研究目的
- 考察振动刺激如何影响间充质干细胞。
- 创建一个模拟声带发声条件的生物反应器。
- 评估蛋白质和翻译水平上的细胞反应。
使用的方法
- 开发用于振动刺激的生物反应器。
- 创建用于细胞培养的聚（ε-己内酯）支架。
- 将支架集成到硅胶膜中以实现振动传导。
- 利用激光多普勒振动计分析振动特征。
主要结果
- 生物反应器成功提供了生理学相关的刺激。
- 间充质干细胞在类似声带的环境中表现出调节行为。
- 定量分析显示出显著的细胞反应。
- 该研究提供了关于声带成熟和滥用后果的见解。
结论
- 新型生物反应器对于研究声带动态有效。
- 振动刺激在干细胞行为调节中发挥关键作用。
- 这项研究对理解喉部健康有重要意义。
常见问题
Executive Industry Relevance
This vocal fold bioreactor provides a physiologically relevant in vitro platform for studying vibration-induced mechanotransduction in mesenchymal stem cells, enabling mechanistic de-risking of vocal fold tissue engineering strategies. By delivering controlled vibratory stimulation at phonation frequencies, the system supports target validation and predictive confidence in preclinical models of laryngeal tissue repair. The bioreactor’s ability to modulate extracellular matrix synthesis and degradation offers translational value for identifying mechanosensitive pathways relevant to vocal fold disorders.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of mechanotransduction pathways in mesenchymal stem cells under physiologically relevant vibratory conditions.
- Operational Value: Provides a reproducible system for assessing target engagement of vibration-sensitive signaling cascades.
- Predictive Value: Supports de-risking of vocal fold tissue engineering approaches by linking mechanical input to extracellular matrix output.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantifiable extracellular matrix biomarkers (elastin, collagen, hyaluronan, MMP-1) in response to defined vibration parameters.
- Operational Value: Standardizes vibratory input via laser Doppler vibrometry characterization, enabling assay-to-assay comparability.
- Scalability: Eight parallel vibration chambers allow multiplexed condition testing for lead identification in mechanobiology screening.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Demonstrates dose-responsive extracellular matrix remodeling, supporting predictive modeling of vocal fold tissue maturation.
- Operational Value: Maintains long-term vibratory culture in incubator-compatible anti-humidity enclosure, facilitating extended preclinical studies.
- Translational Continuity: Bridges discovery-stage mechanobiology findings to preclinical validation of vocal fold-relevant tissue constructs.
Pipeline & Workflow Integration
The bioreactor integrates into the discovery continuum by enabling hypothesis testing in early target validation, supporting assay development for mechanosensitive pathways, and providing quantitative phenotypic outputs for lead optimization in tissue engineering pipelines.
- Discovery Biology: Supports mechanistic interrogation of how vibratory stimulation influences stem cell fate and extracellular matrix production.
- Screening: Delivers standardized, reproducible vibratory stimulation with quantifiable displacement metrics for compound or condition screening.
- Analytics: Enables measurement of protein and gene expression readouts (elastin, collagen, hyaluronan synthase, MMP-1) to assess pathway modulation.
- Translational Research: Connects in vitro mechanoresponse data to preclinical tissue maturation and functional tissue engineering outcomes.
- Enterprise Reuse: Designed as a modular, reusable platform for long-term vibratory studies across multiple cell types and tissue models.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity in vibration-induced tissue remodeling by providing quantifiable, dose-responsive extracellular matrix metrics.
- Operational Value: Ensures standardization and reproducibility through non-destructive laser Doppler vibrometry characterization of membrane displacement.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions in vocal fold tissue engineering by predicting biomechanical functionality from molecular signatures.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of mechanotherapeutic candidates based on validated in vitro vibratory response profiles.
Implementation Considerations
- Requires expertise in tissue engineering, vibratory stimulation systems, and laser Doppler vibrometry for setup and characterization.
- Depends on function generator, power amplifier, speaker array, and anti-humidity enclosure for stable long-term operation in cell culture incubators.
- Necessitates cross-team standardization of vibration parameters (frequency, displacement, duration) to ensure data comparability across studies.
- Adaptation to other tissue types requires validation of scaffold-membrane compatibility and vibratory transmission efficiency.
- Practical limitation: Vibratory efficacy depends on proper hydraulic coupling and membrane tension, which must be monitored to maintain consistent stimulation.
