Name: 手术取出，分离和在体外扩展人类前十字韧带衍生细胞组织工程的应用 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-04-30T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 30 s
Description: 学习从人类前十字韧带组织中分离和扩增细胞，用于组织工程修复部分撕裂的ACL。本方法结合PLAGA支架与免疫荧光技术，验证细胞粘附与生物相容性，为骨科再生医学提供创新解决方案。

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作者感谢南伊利诺伊大学医学院的启动资金和外科研究基金，以及纪念医疗基金会的资助。

1. 手术取材
注意：已获得机构审查委员会（IRB）批准，可在前交叉韧带（ACL）重建手术期间采集ACL残端组织。由于所使用的ACL残端通常作为手术废弃物丢弃，因此获得了IRB豁免。共采集了20名患者的ACL残端组织。
<ol>
	<li>根据所在机构的规程，为患者实施全身麻醉并给予术前抗生素。</li>
	<li>应用止血带并充气至高于收缩压 100 mmHg。</li>
	<li>将患者置于仰卧位，在膝关节屈曲 30–45° 时做一水平前外侧切口，建立 5 mm 入路，以 30° 角将关节镜套管和镜头插入髌上囊。</li>
	<li>进行常规诊断性关节镜检查。</li>
	<li>进入髁间窝，清除覆盖于撕裂前交叉韧带（ACL）上的膜状滑膜组织。</li>
	<li>使用 4.5 mm 刨削刀和消融器识别前交叉韧带残端。</li>
	<li>使用直喙钳从残留的前交叉韧带残端多点取样。</li>
	<li>将样本保存在无菌容器内的生理盐水中。</li>
	<li>将样本送至病理科进行解码，并最终递送至实验室设施。</li>
	<li>按机构规程对患者进行复苏及术后护理。</li>
</ol>
2. 组织消化与人前交叉韧带分离
<ol>
	<li>将病理科提供的前交叉韧带组织转移至含有无菌生理盐水/PBS（磷酸盐缓冲液）的培养皿中。</li>
	<li>使用无菌剪刀将组织剪碎成 1–2 mm3 的小块，并用生理盐水至少清洗 3 次。</li>
	<li>用含 10% 胎牛血清（FBS）和 1% 青霉素/链霉素的 DMEM/F-12（50/50，1×）培养基配制的 0.4% 胶原酶，在 37 °C 条件下消化剪碎的组织 4–6 小时。</li>
	<li>在 1,000 × g 条件下离心 5 分钟，然后将细胞重悬于培养基中。</li>
	<li>用培养基清洗细胞 2–3 次，随后接种于 T-25 培养瓶中培养 2–3 天。</li>
</ol>
3. 细胞扩增、冻存与复苏
<ol>
	<li>使用光学显微镜观察在T-25培养瓶中培养2-3天的细胞。</li>
	<li>将细胞维持在37 °C条件下，培养基为添加10%胎牛血清（FBS）和1%青霉素/链霉素（P/S）的DMEM/F-12（50/50，1x）培养液。 
	注意：当细胞出现贴壁现象并呈现标准形态时，需更换培养基。使用光学显微镜观察细胞状态。</li>
	<li>在第7天用PBS洗涤汇合的细胞（约1.3 × 106 个细胞/瓶）。加入胰蛋白酶（0.5 g/L），于37 °C孵育5分钟。向悬浮细胞中加入培养基以中和胰蛋白酶。将细胞-培养基混合液等分为三份，分别接种至三个T-25培养瓶中。</li>
	<li>用PBS洗涤汇合的细胞，加入胰蛋白酶（0.5 g/L），并将细胞重悬于冷冻保存液中，该冷冻液由DMSO、FBS和完全培养基（DMEM/F-12培养基 + 10% FBS + 1% P/S）按1:2:7的比例配制而成。</li>
	<li>若细胞将在一个月内使用，可将冻存管置于-80 °C保存；若需长期储存，则应置于液氮中保存。</li>
	<li>再次使用时，在37 °C水浴中解冻冻存管。 
	注意：通常细胞存活率为90-95%。</li>
</ol>
4. 组织工程二维聚乳酸-羟基乙酸共聚物（PLAGA）支架的制备
<ol>
	<li>在20 ml闪烁瓶中，将1 g PLAGA溶于12 ml二氯甲烷中，并以恒定速度（800 rpm）涡旋搅拌8小时。 
	注意：详见Gupta et al.15</li>
	<li>将溶解后的溶液转移至铺有氟化保护纸的玻璃培养皿中。</li>
	<li>将培养皿置于真空罩下30分钟。随后将培养皿于-20 °C放置过夜，再转移至室温。将培养皿放入冷冻干燥机中，以确保溶剂完全蒸发，从而获得聚合物薄膜。</li>
	<li>将聚合物薄膜置于干燥器中24小时。</li>
	<li>将聚合物薄膜切割成直径为12 mm的圆形片状，储存于干燥器中备用。</li>
</ol>
5. 扫描电子显微镜（SEM）
<ol>
	<li>用 PBS 清洗接种于对照 TCPS 和 PLAGA 支架上的细胞（每片 50,000 个细胞），接种后第 7 天进行。</li>
	<li>使用1.5%戊二醛溶于0.1 M卡考基酸缓冲液固定细胞，以及2.5%四氧化锇4 在0.1 M卡考得缓冲液中进行后固定。</li>
	<li>用0.1 M卡考基酸盐缓冲液洗涤固定后的细胞。使用梯度乙醇脱水（50%、70%、80%、90%和100%）对固定细胞进行脱水处理，每种浓度处理15分钟，随后在六甲基二硅氮烷（HMDS）中过夜进一步干燥。</li>
	<li>使用按钮阀释放SEM溅射镀膜系统的腔室压力，并升起顶板。</li>
	<li>将干燥的样品放入腔室中，降下上部平板。</li>
	<li>将控制旋钮切换至“泵”以开始抽空腔体。</li>
	<li>打开氩气泄漏阀。等待真空度降至0.05 mbar。</li>
	<li>用一层薄金/钯（0.13 nm）镀覆干燥样品。</li>
	<li>将氩气泄漏阀恢复至关闭位置。</li>
	<li>将控制旋钮切换至关闭位置。</li>
	<li>使用按钮阀释放腔室压力，并升起顶板。</li>
	<li>取出样品，置于干燥器中保存24小时。</li>
	<li>在扫描电子显微镜下观察样品。</li>
</ol>
6. 免疫荧光染色
<ol>
	<li>在接种后第7天，用PBS洗涤接种于对照TCPS和PLAGA支架上的细胞（每片50,000个细胞）。</li>
	<li>用70%乙醇（冷）固定细胞，作用10分钟。</li>
	<li>将固定后的细胞在室温下用含0.05% Triton X-100的PBS配制的1%牛血清白蛋白（BSA）溶液孵育20分钟。</li>
	<li>将样品浸入1% Tween溶液中，在室温下孵育20分钟。</li>
	<li>加入单克隆小鼠抗-β-actin抗体（1:400稀释），4 °C下孵育过夜。</li>
	<li>用0.05% Tween洗涤细胞，加入二抗（与荧光探针偶联的山羊抗小鼠IgG F(ab')₂片段，1:400稀释），室温孵育1小时。</li>
	<li>用PBS洗涤细胞，用核染料对细胞染色，并用80%甘油封片。</li>
	<li>在共聚焦显微镜下观察细胞。</li>
</ol>

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</ol>

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

本项hACL/2D支架研究的主要目标是利用获取的细胞制成补片，以增强部分前交叉韧带（ACL）撕裂的原位修复。对于部分ACL撕裂的非手术治疗，可能包括短暂的制动、支具固定、渐进式康复训练以及定期随访评估13,16,17。然而，许多研究表明，运动员采用保守治疗常导致疗效不佳和治疗失败。Buckley et al. 对25例部分ACL撕裂患者进行中期随访评估，发现仅有44%的患者恢复至受伤前的运动水平，72%的患者报告存在与活动相关的症状8。Bak et al. 对56例孤立性部分ACL撕裂患者进行了平均5.3年的随访，仅有30%的患者恢复了受伤前的活动能力10。Fritschy et al. 发现，在43例部分ACL撕裂患者中，有18例在5年随访期间进展为完全断裂11。这些研究结果表明，亟需开发创新技术以治疗和修复部分ACL撕裂。
本研究的目的是建立一种实验方案，以展示一种新技术，即获取人前交叉韧带（hACL）细胞、进行培养，并使其在工程化支架上...

前交叉韧带（ACL）是膝关节内常见的损伤性关节内韧带。在美国，每年约报告20万例前交叉韧带（ACL）损伤。超过75%的前交叉韧带损伤患者选择骨科重建手术1,2,3,4。由于前交叉韧带自身愈合能力较差，通常需要手术干预3。前交叉韧带重建通常采用自体肌腱移植或同种异体肌腱移植。自体移植和同种异体移植被视为重建的金标准，因其成功率高；而另一种治疗选择——原发性缝合修复——失败率高达94%5,6,7。
前交叉韧带（ACL）部分撕裂占所有ACL撕裂的10%至28%8。在一项前瞻性研究中，Noyes 等估计，对于ACL受累超过一半的部分撕裂患者，经非手术治疗后有50%进展为完全性ACL功能不全9。其他研究报道，持续性关节不稳定和功能下降较为常见，仅有不到30%的患者能够恢复至受伤前的活动水平9,10,11,12,13。目前治疗选择有限，包括保守治疗、残余ACL的热收缩处理或ACL重建手术。近年来，增强型原位修复技术受到越来越多关注。这些技术利用生物材料来增强原位缝合修复的效果14。近期研究尝试获取类似间充质干细胞的源自人前交叉韧带（hACL）的干细胞，以克服移植物来源的局限性31,32，但这些细胞的有效性和可靠性仍不明确。在组织工程应用中，理想的细胞来源似乎是源自hACL的非间充质型成纤维细胞。
当前研究的重点是为组织工程支架寻找合适的基质材料和细胞来源。在前交叉韧带（ACL）重建手术中，撕裂的ACL通常作为手术废弃物被丢弃，然而，这种受损韧带可能是获取构建和优化理想组织工程ACL替代物所需细胞的优质来源。本实验室已建立了一套从撕裂的ACL中分离和培养韧带来源细胞的实验方案。 体外 扩增这些收获的源自人前交叉韧带（hACL）的细胞。利用一种负载了源自hACL细胞的工程化二维基质，我们设计了一种补片，有望用于增强部分前交叉韧带修复，并强化撕裂的韧带。

<table><tbody><tr><td>培养皿</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-757-103C</td><td></td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液（PBS）</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP3994</td><td></td></tr><tr><td>胶原酶</td><td>Gibco</td><td>17018-029</td><td>4 &amp;#176;C 保存</td></tr><tr><td>DMEM/F-12</td><td>Cellgro</td><td>10-092-CV</td><td>4 &amp;#176;C 保存。使用前在 37 &amp;#176;C 水浴中预热。</td></tr><tr><td>胎牛血清（FBS）</td><td>Gibco</td><td>10082</td><td>-80 &amp;#176;C 保存</td></tr><tr><td>青霉素/链霉素</td><td>Lonza</td><td>17-602E</td><td>4 &amp;#176;C 保存</td></tr><tr><td>离心管 - 15 ml</td><td>Corning</td><td>430790</td><td></td></tr><tr><td>T-25 培养瓶</td><td>BD Falcon</td><td>3013</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白酶-Versene 混合液</td><td>Lonza</td><td>17-161E</td><td>4 &amp;#176;C 保存。使用前在 37 &amp;#176;C 水浴中预热。</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP231-100</td><td>可燃液体。可引起皮肤、眼睛和呼吸道刺激。</td></tr><tr><td>冻存管</td><td>Corning</td><td>430489</td><td></td></tr><tr><td>PLAGA</td><td>Purac Biomaterials</td><td>Purasorb PLG8523</td><td>-80 &amp;#176;C 保存</td></tr><tr><td>TCPS 圆片</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-545-82</td><td></td></tr><tr><td>二氯甲烷</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC36423-0010</td><td>可能致癌。应存放在干燥、阴凉处。</td></tr><tr><td>Bytac 纸</td><td>Saint gobin performance plastics</td><td>1420652</td><td></td></tr><tr><td>闪烁瓶</td><td>Fisher Scientific</td><td>03-339-21G</td><td></td></tr><tr><td>牛血清白蛋白（BSA）</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A7906</td><td>4 &amp;#176;C 保存</td></tr><tr><td>Tween</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP337-500</td><td></td></tr><tr><td>小鼠抗-&amp;beta;-肌动蛋白抗体（1&amp;#176; Ab）</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A5441</td><td>-20 &amp;#176;C 保存</td></tr><tr><td>山羊抗小鼠抗体（2&amp;#176; Ab）</td><td>Cell Signaling</td><td>4408</td><td>-20 &amp;#176;C 保存</td></tr><tr><td>Hoechst 染料</td><td>Sigma Aldrich</td><td>14530</td><td>-20 &amp;#176;C 保存</td></tr><tr><td>甘油</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP229-1</td><td></td></tr><tr><td>戊二醛</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2547-1</td><td>吸入或吞咽有毒。所有接触途径均可引起灼伤。</td></tr><tr><td>六甲基二硅氮烷</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC43085-1000</td><td>易燃液体和蒸气。所有接触途径均可引起灼伤。</td></tr><tr><td>无菌剪刀</td><td>McKesson</td><td>25-716</td><td></td></tr><tr><td>离心机</td><td>Eppendorf</td><td>5804R</td><td></td></tr><tr><td>光学显微镜</td><td>Olympus</td><td>CK40</td><td></td></tr><tr><td>水浴锅</td><td>Thermo scientific</td><td>2845</td><td></td></tr><tr><td>涡旋振荡器</td><td>Labnet</td><td>VX-200</td><td></td></tr><tr><td>玻璃培养皿</td><td>fisher Scientific</td><td>S31473</td><td></td></tr><tr><td>Acu-Punch</td><td>Acuderm Inc.</td><td>P1225</td><td>Acu-Punch 用于切割 12 mm 圆片</td></tr><tr><td>卡可基酸缓冲液</td><td>Sigma Aldrich</td><td>97068</td><td>易燃液体，致癌物，刺激物。</td></tr><tr><td>四氧化锇</td><td>Sigma Aldrich</td><td>201030</td><td>剧毒</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T8787</td><td>吞咽有害</td></tr><tr><td>乙醇</td><td>Decon Labs</td><td>2705</td><td>远离热源、火花、火焰及其他点火源。</td></tr><tr><td>全身/区域麻醉剂</td><td>Amphastar pharmaceuticals</td><td></td><td>1% 利多卡因，0.25% 布比卡因，用于诱导和维持麻醉的麻醉剂</td></tr><tr><td>抗生素</td><td>Hospira</td><td>0409-0805-01</td><td>Ancef 1 g 静脉注射</td></tr><tr><td>关节镜穿刺器</td><td>Smith and Nephew</td><td></td><td></td></tr><tr><td>关节镜摄像系统</td><td>Smith and Nephew</td><td></td><td></td></tr><tr><td>关节镜抓钳和咬钳</td><td>Arthrex</td><td></td><td></td></tr><tr><td>4.5 mm 刨削器</td><td>Arthrex</td><td></td><td></td></tr><tr><td>干涉螺钉</td><td>Arthrex</td><td></td><td>不锈钢螺钉</td></tr><tr><td>溅射镀膜仪</td><td>Polaron</td><td>E5400</td><td></td></tr></tbody></table>

手术获取、分离与 体外 用于组织工程应用的人前交叉韧带来源细胞的扩增

Surgical Retrieval, Isolation and In vitro Expansion of Human Anterior Cruciate Ligament-derived Cells for Tissue Engineering Applications

前交叉韧带（ACL）损伤是活动人群中常见的问题。即使是这种关节内膝关节韧带的部分撕裂，也会导致生物力学缺陷，影响关节功能和稳定性。目前对于部分ACL撕裂的治疗方案包括从非手术的保守治疗到多种手术方法，例如：热力修复、单束修复、完全重建以及对原有韧带受损部分的重建。然而，几乎没有研究能够证明其中任何一种治疗方法具有持续的优越性，在许多情况下，患者仍表现出持续的不稳定及其他合并症。
本研究的目的是确定一种潜在的细胞来源，用于开发一种组织工程补片，以应用于部分撕裂的前交叉韧带（ACL）修复。我们建立了一种新型方案，用于扩增来自接受ACL重建手术患者的细胞。为分离细胞，将ACL重建过程中获取的人前交叉韧带（hACL）组织切碎后，在胶原酶溶液中进行消化。细胞扩增使用添加了10%胎牛血清（FBS）和1%青霉素/链霉素（P/S）的DMEM/F12培养基进行。扩增后的细胞以含有DMSO、FBS和扩增培养基的冻存液在-80 ºC或液氮中保存。解冻后，将hACL来源的细胞接种至组织工程支架PLAGA（聚乳酸-共-乙醇酸）以及对照组组织培养聚苯乙烯（TCPS）上。培养7天后，通过扫描电子显微镜（SEM）比较细胞在PLAGA与对照组TCPS表面的黏附情况。同时采用免疫荧光染色法评估细胞形态。SEM显微图像显示，细胞在PLAGA和TCPS表面均能生长并牢固黏附，并在第7天时在整个表面达到融合状态。免疫荧光染色结果显示，两种表面上的细胞均呈现正常、无应激的形态特征。该技术在前交叉韧带再生与重建应用中具有良好的前景。

人前交叉韧带（hACL）来源细胞的手术获取、组织消化及分离工作模型见图1。细胞从组织块中迁移并贴附于T-25培养瓶中。这些细胞培养3天后，在光学显微镜下进行观察（图2）。至第7天获得融合的单层细胞。健康且具有活力的细胞的存在表明已成功获取并培养出hACL来源细胞。
通过扫描电镜（SEM）定性评估细胞在PLAGA和TCPS表面的黏附情况。图3展示了来源于人前交叉韧带（hACL）的细胞在每种聚合物表面的黏附与增殖情况。在PLAGA和TCPS表面均观察到细胞融合生长。
通过免疫荧光染色法测定细胞形态和黏附性分析。β-actin 染色显示，来源于人前交叉韧带（hACL）的细胞能够黏附并在 PLAGA 和 TCPS 表面增殖。图4 展示了聚合物上的细胞黏附情况，并突出了 hACL 细胞正常的、无应激状态下的形态特征。

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为将来作为修复前交叉韧带（ACL）部分撕裂的补片应用，从重建手术中获取的组织分离出人源ACL细胞，并进行扩增 体外 并在组织工程支架上培养。随后进行细胞黏附与形态学分析，以确认支架表面的生物相容性。

前交叉韧带损伤是活动人群中常见的问题。即使是这种关节内膝关节韧带的部分撕裂，也会导致生物力学...

本实验的总体目标是为一对部分撕裂的前交叉韧带（ACL）开发一种组织工程前交叉韧带或ACL补片。首先从患者体内获取人前交叉韧带组织并将其保存在生理盐水中以实现该目标。所获得的ACL样本被切碎，并用胶原酶消化，以获得来源于ACL的细胞。分离的细胞随后进行培养和扩增。下一步是制备二维的聚乳酸-羟基乙酸共聚物支架。最后一步是将细胞接种到该聚合物膜上。最终通过扫描电子显微镜和免疫荧光显微镜来展示支架表面的生物相容性。今天我们将演示开发用于部分前交叉韧带（ACL）撕裂修复补片的技术。这项技术的重要性在于前交叉韧带自身无法自行愈合。这是我们开发的一种帮助前交叉韧带（ACL）愈合的创新技术。首先，将病理科收到的人类前交叉韧带组织转移至含有无菌生理盐水和磷酸盐缓冲液（PBS）的培养皿中，使用无菌剪刀将组织剪切成1至2立方毫米大小的组织块，并用生理盐水至少清洗三次。随后，使用0.4%胶原酶在完全补充的ECCO改良鹰氏培养基营养混合物中对组织块进行消化。在37摄氏度下，将细胞在F12培养基中孵育四至六小时。以1000 ×g离心五分钟。用培养基重悬细胞，随后用培养基洗涤细胞两到三次，然后接种于T25培养瓶中，培养两到三天。使用光学显微镜观察在 T25 培养瓶中培养 2 至 3 天的细胞。将细胞维持在 37 °C 的补充型 DMEM 培养基中。当细胞在第 7 天于光学显微镜下显示出贴壁现象及标准形态时，更换培养基。用 PBS 清洗汇合的细胞，加入胰蛋白酶，并在 37 摄氏度孵育 5 分钟。然后向悬浮细胞中加入培养基以中和胰蛋白酶，再将细胞悬液等分为三份，分别接种至三个 T25 培养瓶中。再次用 PBS 清洗汇合的细胞，加入胰蛋白酶，然后将其重悬于含有 DMSO、胎牛血清和完全培养基（体积比为 1:2:7）的冻存液中。将冻存管置于零下80摄氏度保存。如果细胞将在一个月内使用，则可置于液氮中。如果细胞需要长期储存，则在20毫升闪烁瓶中，将一克聚乳酸-羟基乙酸共聚物（P-L-A-G-A）溶解于12毫升二氯甲烷中，并以每分钟800转的恒定速度涡旋振荡八小时。将溶解后的溶液转移至铺有氟化保护纸的玻璃培养皿中。随后将培养皿置于真空罩下30分钟，再于-20摄氏度条件下静置过夜。将培养皿置于室温下，以确保残余溶剂完全挥发，从而获得聚合物薄膜。接下来将聚合物薄膜置于干燥器中放置24小时。将聚合物薄膜切割成直径为12毫米的圆形圆片，并储存在干燥器中直至使用。在细胞接种步骤中，将细胞以每圆片50,000个细胞的密度接种到受控的组织培养聚苯乙烯或TCPS以及P-L-A-G-A支架上。接种后第七天用 PBS 清洗支架。使用 0.1 摩尔碳酸缓冲液中的 1.5% 戊二醛在 4°C 下固定细胞过夜。然后加入 0.1 摩尔碳酸缓冲液中的 2.5% 四氧化锇，室温下后固定 1 小时。用 0.1 摩尔的 caco 稀释

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Research

科研

JoVE Journal

Bioengineering

生物工程

手术取出，分离和<em&gt;在体外</em&gt;扩展人类前十字韧带衍生细胞组织工程的应用

本文介绍了一种用于治疗兔膝关节软骨缺损的实验技术。将自体软骨细胞接种于基质后进行植入，是目前广泛认可的关节软骨损伤修复与重建方法，可获得令人满意的长期疗效。基质辅助的自体软骨细胞移植（MACT）提供了一种标准化且已在临床广泛应用的植入技术。...

基质辅助自体软骨细胞移植用于兔模型中软骨缺损的重塑与修复

介绍了一种用于治疗兔膝关节骨软骨缺损的实验技术。将同种异体间充质干细胞植入骨软骨缺损部位，为组织工程领域提供了有前景的发展方向。体外制备纤维蛋白-细胞凝块为细胞植入提供了一种标准化的方法。...

通过植入含同种异体间充质干细胞的纤维蛋白凝块治疗兔膝关节骨软骨缺损

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压缩胶原中的组织匀浆：一种含细胞的生物移植物用于单阶段重建修复

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利用运动训练后血清处理韧带类组织：一种可转化的组织工程模型

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用于细胞扩增的重组胶原蛋白I肽微载体及其在生物反应器模型中作为细胞递送系统的潜在应用

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利用纤连蛋白黏附与迁移实验分离软骨细胞和软骨祖细胞

本文描述了用于构建人类三维肿瘤组织作为测试系统的方法。这些技术基于脱细胞生物血管化支架（BioVaSc）、原代人类细胞和肿瘤细胞系，可在静态条件下以及流动生物反应器的动态条件下进行培养。...

人类三维组织工程 体外 肿瘤检测系统

我们开发了一种眼刺激性测试方法，该方法采用三维重建的人角膜样上皮（RhCE）组织模型。该测试能够区分具有眼刺激性或腐蚀性的物质（GHS 第1类和第2类合并）与无需标注分类的物质（GHS...

使用重建人角膜样上皮（RhCE）组织模型进行化学品眼刺激性危害识别的刺激性眼试验（EIT）

学习从人类前十字韧带组织中分离和扩增细胞，用于组织工程修复部分撕裂的ACL。本方法结合PLAGA支架与免疫荧光技术，验证细胞粘附与生物相容性，为骨科再生医学提供创新解决方案。

手术获取、分离与体外用于组织工程应用的人前交叉韧带来源细胞的扩增

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