Name: 衰老小鼠前庭系统的行为评估 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-07-11T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 30 s
Description: 学习利用旋转刺激和平衡木实验评估衰老小鼠的平衡能力与运动协调功能。这种非侵入性方法可量化年龄相关的运动控制衰退，为神经科学和衰老研究提供可靠数据。

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作者谨此致谢 Garnett Passe 和 Rodney Williams 纪念基金会以及博世研究所动物行为设施。

1. 动物
<ol>
	<li>从动物资源中心（澳大利亚珀斯）获取 1 个月、9 个月和 13 个月大的小鼠（C57/BL6）。这些小鼠饲养于悉尼大学博世啮齿动物设施的标准鼠笼中，采用 12/12 小时明暗循环光照周期，并可自由获取食物和饮水。ad libitum。以下所述实验程序已获得悉尼大学动物伦理委员会批准。</li>
	<li>每次测试前 10 分钟，将小鼠笼移入测试房间，使小鼠适应测试环境。</li>
</ol>
2. 旋转杆实验
<ol>
	<li>设置转棒仪装置（图1A）：
	<ol>
		<li>在转棒仪每个通道中安装圆柱杆。 
		注意：此处使用大鼠用圆柱杆（直径70 mm），而非小鼠用圆柱杆（直径32 mm），以防止小鼠抓握圆柱杆并进行“被动旋转”10。</li>
		<li>将磁性着陆平台放置在转棒仪每个通道底部的金属丝上，确保平台不倾斜触碰转棒仪底面，并尽可能靠近每个通道的磁性右侧壁，但不得接触。 
		注意：在转棒仪测试过程中，小鼠需向前行走以保持在旋转并加速的圆柱杆上。当小鼠无法继续停留在圆柱杆上时，会掉落并撞击着陆平台，从而触发磁性传感器。每只小鼠从旋转圆柱杆上掉落所用的时间、掉落时的圆柱杆转速（rpm）以及行走距离将被自动计算，并记录在转棒仪前方的显示屏上。</li>
		<li>将两块透明塑料板插入每个转棒仪通道的前方，较短的塑料板置于底部，较长的塑料板置于上方。</li>
		<li>使用转棒仪前方的键盘输入测试参数。进行加速转棒测试时，请按照步骤2.1.4.1至2.1.4.6设置参数；进行固定速度转棒测试时，请按照步骤2.1.4.7至2.1.4.12设置参数。
		<ol>
			<li>将测试最长时间设为60秒。</li>
			<li>设置要使用的通道数量（或待测小鼠数量）。</li>
			<li>将测试起始速度设为5 rpm。</li>
			<li>将测试最高速度设为44 rpm。</li>
			<li>将测试加速度时间（ramp speed）设为60秒。</li>
			<li>设置所选圆柱杆的尺寸及旋转方向为“大鼠用圆柱杆，正向旋转”。</li>
			<li>将测试最长时间设为240秒。</li>
			<li>将使用的通道数量设为1，因小鼠需单独测试。</li>
			<li>将测试起始速度设为15 rpm。</li>
			<li>将测试最高速度设为15 rpm。</li>
			<li>将测试加速度时间（ramp speed）设为0秒。</li>
			<li>设置所选圆柱杆的尺寸及旋转方向为“大鼠用圆柱杆，正向旋转”。 
			注意：上述参数可根据不同实验需求进行调整。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>在固定速度转棒测试中，于转棒仪前方放置一台摄像机，以便记录小鼠在试验过程中的行为，并利用视频进行后续分析，以确定小鼠在转棒上停留的时间。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>进行加速转棒测试时，请执行步骤2.2.1至2.2.4：
	<ol>
		<li>将每只小鼠放置在静止的圆柱杆上5分钟，使其适应转棒仪环境。</li>
		<li>轻轻推动小鼠使其面朝转棒仪后方，当所有小鼠均朝此方向时，启动转棒测试（见图1B）。</li>
		<li>当小鼠从旋转的圆柱杆上掉落时，将其放回笼中，并静置休息10分钟，期间提供食物和饮水。</li>
		<li>重复步骤2.2.1至2.2.3，共完成8次试验。每次试验之间需用清水清洁圆柱杆、通道和着陆平台上的尿液和粪便，并将着陆平台复位至初始位置。 
		注意：前3至5次试验作为训练试验，使小鼠熟悉任务。从后续试验开始，记录每次试验中小鼠掉落时间、行走距离及掉落时圆柱杆的最终转速（rpm），用于后续分析（图2）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>进行固定速度转棒测试时，请执行步骤2.3.1至2.3.8：
	<ol>
		<li>将一只小鼠放置在圆柱杆上5分钟，使其适应转棒仪环境，随后将其放回笼中。</li>
		<li>启动摄像机开始录像，同时按下转棒仪的“开始”按钮，然后将小鼠放置在旋转的圆柱杆上，确保其面朝转棒仪后方。</li>
		<li>当小鼠从旋转圆柱杆上掉落时，停止摄像机录像，并将小鼠放回笼中休息10分钟，期间提供食物和饮水。</li>
		<li>重复步骤2.3.2和2.3.3，直至完成总共8次试验。每次试验之间需清洁圆柱杆、通道和着陆平台上的粪便和尿液，并将着陆平台复位至初始位置。</li>
		<li>开启自制旋转装置，设置频率为3 Hz，持续20秒，使小鼠熟悉声音。20秒后关闭电钻停止旋转，并用手扶住跑轮两侧，防止其继续转动超过初始20秒。 
		注意：该旋转装置由一个固定在电钻上的啮齿类动物跑轮构成（图3A）。跑轮中心设有一个带网状盖的小型舱室，用于放置小鼠（图3B）。装置围绕垂直轴逆时针旋转。刺激强度与先前研究一致，已有研究表明，0.2至3 Hz范围内的旋转刺激足以诱发前庭眼反射（VOR）和前庭脊髓反射（VCR）反应4,11,12。</li>
		<li>将小鼠放入旋转装置中心的舱室内，并盖好盖子。</li>
		<li>将旋转装置以最低档3 Hz启动，持续20秒。在此期间启动转棒仪并开始摄像机录像，为即将进行的试验做准备。20秒结束后关闭电钻，并用手扶住跑轮两侧以停止其旋转。随后立即将小鼠迅速转移至旋转的圆柱杆上，进行转棒测试。</li>
		<li>当小鼠从圆柱杆上掉落时，停止摄像机录像，并将小鼠放回笼中。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>所有小鼠测试完成后，使用温和的洗涤剂/水混合液清洁透明塑料板，并使用70%乙醇清洁转棒仪的圆柱杆、通道和金属着陆平台。</li>
</ol>
3. 带前庭挑战的平衡木实验
<ol>
	<li>如图4A所示设置平衡梁装置。 
	注意：平衡梁装置改编自Carter 等（2001）13描述的装置。在此测试中，小鼠从距地面52.5 cm的梁低端出发，走向位于距地面60 cm处的暗箱（目标箱，13 × 22 cm，带有一个5 × 6 cm的入口）（图4A）。小鼠天生倾向于进入暗箱以寻求黑暗和庇护，而非停留在暴露的梁上；此外，梁具有轻微上坡，可利用小鼠向上逃离的本能，进一步促使它们穿越梁14。梁本身长1 m，横截面为圆形，直径为14 mm。可根据需要使用一系列不同直径的梁，以便实验者调节测试的敏感度或适应体型更大的实验对象。在平衡梁的低端处标有一条白线作为起始线。在梁的高端距起始线60 cm处另画一条线作为终点线（图4A）。
	<ol>
		<li>在平衡梁低端的两侧各放置一台摄像机（图4B）。 
		注意：摄像机应调整角度，以完整捕捉平衡梁的全长，并确保梁上标记的起始线和终点线清晰可见。这些摄像机将用于记录小鼠穿越平衡梁时的行为，所得视频将用于后续分析。</li>
		<li>在目标箱底部铺上纸巾，以便在每只小鼠测试后易于清理尿液和粪便，并将小鼠所在饲养笼的盖罩放入目标箱内。</li>
		<li>在抬高的梁下方放置足够的泡沫或其他缓冲材料，以保护可能从装置上跌落的小鼠。若小鼠跌落，实验者应立即将其拾起并放入目标箱中休息。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将一只小鼠放入目标箱中2分钟，使其熟悉该环境。若小鼠在此期间试图走上梁，可用戴手套的手遮盖目标箱入口5秒，以抑制该行为。</li>
	<li>通过将小鼠放置在目标箱入口外的梁上，使其自行走入目标箱，以此训练小鼠。逐步将小鼠放置在离目标箱更远的位置进行训练，直至小鼠能够从起始线自主行走至目标箱，无需辅助且犹豫极少。每次运行后让小鼠在目标箱中休息1分钟。</li>
	<li>训练完成后开始测试小鼠。&#160;
	<ol>
		<li>启动摄像机开始录像。</li>
		<li>将小鼠放置在梁的起始线上，等待其向目标箱方向穿越梁。</li>
		<li>当小鼠到达目标箱时，停止摄像机录像。</li>
		<li>让小鼠在目标箱中休息1分钟。等待期间清理试验过程中可能留下的尿液或粪便。</li>
		<li>重复步骤3.4.1至3.4.4，直至完成总共5次试验。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将自制旋转器以3 Hz频率开启20秒（类似于固定速度转棒试验），使小鼠熟悉其声音。20秒后关闭钻机，并用手从转轮两侧将其固定，防止继续旋转。</li>
	<li>将小鼠放入旋转器中心的腔室内，并盖上盖子。</li>
	<li>将旋转器以最低转速3 Hz开启20秒。在此期间启动摄像机录像，为即将开始的试验做准备。20秒结束后关闭钻机，并用手从转轮两侧将其固定，防止其继续旋转。尽快将小鼠转移至平衡梁的起始位置，等待其穿越梁走向目标箱。</li>
	<li>当小鼠到达目标箱时停止摄像机录像，并将小鼠送回其饲养笼。</li>
	<li>每只小鼠测试结束后，用70%乙醇清洁平衡梁装置，并更换目标箱内的纸巾。</li>
</ol>

<ol><li>Agrawal, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disorders+of+balance+and+vestibular+function+in+US+adults%3A+data+from+the+National+Health+and+Nutrition+Examination+Survey%2C+2001-2004%5BTitle%5D)+AND+%22Arch.+Intern.+Med%22%5BJournal%5D)">Disorders of balance and vestibular function in US adults: data from the National Health and Nutrition Examination Survey, 2001-2004.</a> Arch. Intern. Med. 169, 938-944 (2009).</li>
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</ol>

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

方案中的关键步骤
先前的研究表明，小鼠在转棒和平衡木装置上的训练很容易过度，因此准确获取测量数据具有挑战性。15例如，在转棒实验中过度训练可能导致小鼠在适应期和试验期间故意从转棒上跳下，而在平衡木实验中过度训练则可能导致小鼠更频繁地停顿（探索行为）以及反向移动（即 向起点方向15最终，过度训练可能导致对实际运动能力的低估。因此，在分析之前评估训练曲线至关重要。
在转棒实验方案中另一个关键步骤是，确保每次试验开始前小鼠朝向正确的方向（与旋转方向相反）。当圆棒开始旋转时，若小鼠朝向错误的方向，将难以在圆棒上保持平衡，从而过早掉落，可能导致高估测试的影响。此外，在平衡木实验中，应尽快将小鼠从转棒装置转移至平衡木，因为前庭系统受到的刺激后恢复过程会立即开始。这可能导致由转棒引起的平衡障碍及其对后续表现的负面影响被低估。
修改与故障排除
可以通过修改转棒仪和平衡木实验来调整测试...

平衡感或许是即使在行走和转身等最基本运动活动中也最易被忽视却至关重要的组成部分。平衡受到多种因素影响，包括肌肉力量、运动协调性以及前庭功能；只有在出现前庭神经病变或正常衰老过程中，一个功能健全的平衡系统的重要性才被人们所认识。前庭系统功能障碍常伴随眩晕、头晕及失衡感，导致跌倒风险增加以及继发性损伤1。这种情况在老年人群中尤为严重，跌倒已成为导致伤害的主要原因之一2。
前庭功能测试通常基于前庭反射，特别是前庭-眼反射（VOR）或前庭-颈反射（VCR）。VOR 和 VCR 分别在头部和身体运动过程中对视网膜上图像的稳定和头部位置的维持至关重要。通常，VOR 的测量需要通过植入搜索线圈来记录眼动，或采用视频追踪眼动3。由于小鼠眼睛体积小，且瞳孔在视频分析中难以识别，这种方法在小鼠中实施具有挑战性3。作为替代方法，VCR 已被用于测量小鼠在身体运动时头部的稳定性，且无需进行侵入性手术4。尽管如此，目前仍鲜有研究专门关注前庭系统整体功能的表现，以及更为重要的是其在衰老过程中的变化。 
为了简单且无创地评估整体平衡能力，我们改进了两种常用的行为学测试方法。转棒实验和倾斜平衡木实验可评估啮齿类动物运动功能的不同方面，在以往的研究中，这些实验常组合成测试套餐，以全面获取运动能力的完整特征。这种能力可能受到疾病或基因修饰的影响，同时也对正常发育和衰老相关过程敏感5-7。早期利用转棒实验的研究表明，小鼠的运动协调能力在出生3个月后开始下降8。此外，大鼠在平衡木实验中表现出随年龄增长而明显的平衡功能缺陷9。
本文描述了使用转棒仪和平衡梁测试，结合前庭刺激，以挑战前庭系统并表征年轻和老年小鼠平衡功能的后续影响。尽管所述方法简单且无创，不能作为外周前庭功能的独立评估指标，但它们提供了一种有用且简便的行为学测量手段，可用于比较小鼠正常衰老过程中前庭信息处理多个阶段的细胞及亚细胞水平变化。

<table><tbody><tr><td>转棒仪</td><td>IITC Life Science Inc.</td><td>#755</td><td>&quot;大鼠转棒&quot; = 70 mm 直径。禁止乙醇接触有机玻璃。</td></tr><tr><td>iPhone</td><td>Apple</td><td></td><td>可使用任意类型的相机。背面用魔术贴固定，以便连接至三维可调臂。</td></tr><tr><td>三维可调臂</td><td>Fisso/Baitella</td><td>Classic 3300-28</td><td>任何类型的稳定垂直支架均可。在臂的顶端用魔术贴固定 iPhone。</td></tr><tr><td>木质行走横梁：长 1 m、横截面为圆形、直径 14 mm 的光滑木条</td><td></td><td></td><td>可根据实验参数选用不同直径和横截面形状</td></tr><tr><td>木质目标箱（130 x 140 x 220 mm），由 11 mm 厚木板制成</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>支架由 41 x 41 mm 木梁构成：起始端和目标端的垂直梁分别距地面 525 mm 和 590 mm；一根 803 mm 的水平梁沿地面铺设，位于行走横梁正下方；两端各有两个 20 mm 长的梁作为&quot;支脚&quot;，连接水平梁与垂直梁；在&quot;起始&quot;垂直梁顶端设有一个 21 x 21 x 36 mm 的木块；该木块中心开有 13 x 13 mm 的孔洞，形成一个垂直于行走横梁的通道。</td><td></td><td></td><td>所有连接处均需用小型钢制角码加固。</td></tr><tr><td>黑色涂料（水性）</td><td>Handycan</td><td>Acrylic Matt Black</td><td>平衡横梁装置的所有木质表面需涂 2–3 层</td></tr><tr><td>透明涂层</td><td>Wattle Estapol</td><td>Polyurethane Matt</td><td>所有横梁涂一层；平衡横梁装置其余表面涂两层</td></tr><tr><td>泡沫包装材料</td><td></td><td></td><td>用于缓冲动物从平衡横梁跌落的冲击</td></tr><tr><td>70% 乙醇、纸巾</td><td></td><td></td><td>每只动物测试后清洁横梁和目标箱</td></tr><tr><td>纱布垫/纸巾</td><td></td><td></td><td>用于铺垫目标箱底部</td></tr><tr><td>小鼠笼盒（来自饲养笼）</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

衰老小鼠前庭系统的行为学评估

Behavioral Assessment of the Aging Mouse Vestibular System

与年龄相关的平衡能力下降与肌肉力量减弱、运动协调性减退以及前庭功能退化密切相关。尽管已有许多研究报道了啮齿类动物在衰老过程中平衡表型的变化，但极少有研究专门分离出在正常条件或衰老状态下前庭系统对平衡的贡献。我们采用两种标准的行为学测试方法，在小鼠生命周期的特定年龄点对其平衡能力进行表征：转棒实验和倾斜平衡木实验。尤为重要的是，我们还使用一种自行设计的旋转装置来刺激小鼠的前庭系统（且不引发明显的运动病症状）。这两种测试方法已被用于证明，在小鼠整个生命周期中，前庭介导的平衡能力存在显著变化。初步结果显示，转棒实验和改良的平衡木实验均可作为识别衰老过程中平衡功能变化的有效手段，从而替代诸如前庭-眼反射（VOR）测量等更具难度和侵入性的技术方法。

转棒实验
小鼠的运动表现通过每只小鼠在8次试验中记录的跌落时间（Time To Fall, TTF）来描述。利用这些TTF测量值，可以绘制每只小鼠的训练曲线。图2展示了1月龄和9月龄小鼠在8次试验过程中的运动表现示例。这些训练曲线显示，在前3至5次试验中TTF逐渐增加，随后进入平台期。在达到平台期之前的TTF测量值被视为训练阶段数据（图2），而构成平台期的TTF测量值则被记录下来用于数据分析（图5）。
图5显示，小鼠在转棒仪上的运动表现随年龄增长而下降。与9月龄小鼠（n = 8）相比，1月龄小鼠（n = 6）在转棒仪上停留的时间显著更长（18.38 ± 4.66 vs. 14.13 ± 2.53 秒；p &lt; 0.05，Student’s t-test）。这表明所使用的转棒仪及测试参数对年龄相关的运动功能变化具有敏感性。
平衡木...

已知运动控制和平衡能力会随着年龄增长而下降。本文介绍了一系列标准的无创行为学测试，并加入一种简单的旋转刺激以挑战前庭系统，从而在衰老小鼠模型中展示平衡能力的变化。

与年龄相关的平衡能力下降与肌肉力量减弱、运动协调性降低以及前庭功能退化密切相关。尽管已有多种……

以下实验的总体目标是识别在衰老小鼠模型中平衡能力的变化。首先让小鼠在装置上进行训练，使其适应该装置，并在第二步中学习任务。随后通过在该装置上测试小鼠，以评估其运动协调性和平衡能力。然后对小鼠施加前庭刺激，并在仪器上重新进行测试。同样，根据转杆仪和平衡木的数据，结果将显示随着年龄增长平衡能力的变化。该技术相较于现有方法（如追踪眼球运动的前庭眼反射测试）的主要优势在于，这是一种简单且非侵入性的平衡功能评估方法。尽管该方法可为小鼠平衡功能随年龄变化的研究提供见解，也可应用于其他系统，如红细胞及神经肌肉疾病。实验操作将由本实验室的博士候选人 Victoria Tongue 演示，同时由实验室研究助理 Edward Dabney 以及悉尼大学博世研究所动物行为设施经理 Thomas Burton 共同参与。在转棒实验中，小鼠必须在旋转并加速的圆杆上行走。当它们失去平衡时，会触发磁性传感器。转棒仪会记录所评估的各项参数。首先将圆柱销安装到转子的每个通道中。提供了适用于小鼠和大鼠的不同尺寸的圆柱销。然而，对小鼠使用大鼠用的圆柱销效果良好，可防止小鼠抓住圆柱销而不下落。接下来，将磁性着陆平台放置在转子杆每个通道下方的导线上。确保平台没有倾斜至接触地面，并尽可能靠近右侧磁壁但不要接触。最后，滑动两个。在转子杆每个通道前方安装透明塑料挡板。较短的挡板置于下方，较长的挡板置于上方。在开始试验前10分钟将小鼠笼具移入测试室，使小鼠适应环境。输入加速旋转杆实验的测试参数。首先，将测试的最大持续时间设置为60秒。然后，设置要使用的通道数量或待测小鼠的数量。然后设置转速。将测试起始转速设为 5 RPM，最高转速设为 44 RPM，并在 60 秒内使转速线性上升。最后，设置用于大鼠的转杆参数，使其以正向旋转。当小鼠准备就绪后，将第一组待测小鼠放置在静止的转杆上适应五分钟。随后轻轻推动小鼠使其面向转杆的后方，当所有小鼠均朝向正确方向时，开始测试。小鼠跌落后，立即将其放回笼中休息，在两次试验之间给予10分钟的自由饮水和进食时间，同时清理横杆跑道和着陆平台上的动物排泄物，并为下一次测试重置着陆平台。每只小鼠重复此过程，共进行八次试验。前3至5次试验作为训练试验。完成全部8次试验后，使用70%乙醇彻底清洁转杆仪的圆柱轨道和着陆平台，并用温和的洗涤剂清洁透明塑料板。在此试验中，小鼠沿一根1米长、直径14毫米的暴露横梁，以轻微倾斜的角度走向目标。一个暗室，内含受试对象的栖息圆顶。两台摄像机分别置于平衡梁的两侧，各自以一定角度放置，以捕捉平衡梁的整个长度。视频记录了平衡梁下方的实验过程。地面铺有缓冲材料。掉落的小鼠必须立即拾起，并放入目标箱中恢复。目标箱内部铺有纸巾，以便在测试间隙轻松清除动物排泄物。该盒子足够大，可将一个 housing dome 置于其中。在对小鼠进行测试前，先将其放入目标箱中停留两分钟。若小鼠试图离开目标箱，可用戴手套的手将通向光束的开口覆盖五秒钟，以阻止其再次离开。接下来，必须对小鼠进行任务训练。将其放置在目标箱外侧的横梁上，使其自行走上目标箱。然后让其休息一分钟，再将其放置在横梁更远的位置，让其再次走上横梁。每次训练试验之间，始终让小鼠在目标箱中休息一分钟。逐渐将小鼠放置在离起点更远的横杆位置，直至它能够无需辅助地从起始线自行走上横杆。现在进行测试时，先开始记录，然后将小鼠放置在起始线上。当小鼠到达目标箱或在试验间期从横梁上掉落时，停止录像。让小鼠在目标箱中休息1分钟，同时清理横梁及下方泡沫垫上的尿液或粪便。每只小鼠应以这种方式测试五次。为了向该测试增加额外的前庭挑战，首先使用旋转装置，让小鼠适应旋转装置以 3 赫兹发出的声音，持续运行 20 秒。然后将小鼠转移至位于旋转装置上的实验舱内。如果难以将小鼠放入舱室内，可先让小鼠抓住一个物体，再将小鼠和物体一同缓慢放入舱室内。小鼠进入舱室后，移除该物体，盖上盖子，启动旋转器运行20秒。当旋转频率为3赫兹时，开始视频记录。20 秒后，关闭旋转装置，并尽快手动使转轮停止转动。然后立即将小鼠移至起始线，使其完成试验。通常情况下，可在小鼠不再配合之前重复进行 1 到 3 次该测试。切勿忘记在每次使用转棒仪测试小鼠后清洁天平臂并更换纸巾。对其中一只小鼠测试其跌落时间。一只1月龄和一只9月龄的小鼠在第1至第5次试验中的表现持续改善，因此被视为训练试验。用于数据分析的是由虚线所示得分趋于稳定阶段的数据。一个月大的小鼠在旋转杆上的停留时间显著长于九个月大的小鼠。小样本量的数据以均值加减一个标准差表示。前庭刺激对平衡表现的影响也随年龄增长而更为显著。在试验前以3赫兹进行第22次旋转，会延长9月龄和13月龄小鼠通过平衡木（从起点线到终点线）所需的时间，但在年轻小鼠中则无此效应。采用重复测量方差分析（repeated measures ANOVA）并结合TUI事后检验进行显著性评估。进行此项操作时，重要的是需尽快将动物从前庭刺激环境转移至实验装置中，以最大限度地减少动物在完成任务前从刺激中恢复的可能性。此外，还可采用其他技术，如PCR、钙成像和膜片钳电生理记录，以探讨运动与平衡功能的改变是否与前庭毛细胞功能的变化相关。

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行为

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向小鼠海马CA1区立体定位注射表达microRNA的慢病毒及其行为学结果评估

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