Name: 从人多能神经嵴前体细胞的无饲养推导干细胞 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-05-22T14:45:00.000+00:00
Duration: 10 min 33 s
Description: 了解如何利用小分子信号通路调控，在18天内从无饲养层的人多能干细胞高效诱导分化出神经嵴前体细胞，并通过荧光激活细胞分选进行纯化。该方法为神经嵴相关疾病研究及细胞替代治疗提供了可重复、易规模化的技术平台。

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本工作得到了瑞士国家科学基金会高级研究员奖学金以及NYSTEM（C026446；C026447）和三机构干细胞计划（Starr基金会）资助项目的支持。

1. 培养基制备、包被培养皿及人多能干细胞的维持
1.1 培养基制备
注意：所有培养基均需过滤除菌，并在避光条件下于 4 °C 保存，最多可保存 2 周。试剂名称、公司及目录编号详见材料&#160;表。
<ol>
	<li>DMEM/10%FBS：将885 ml DMEM、100 ml FBS、10 ml 青霉素-链霉素溶液和5 ml L-谷氨酰胺混合。</li>
	<li>HES培养基：将800 ml DMEM/F12、200 ml KSR、5 ml L-谷氨酰胺、5 ml 青霉素-链霉素溶液（Pen/Strep）、10 ml MEM必需氨基酸溶液和1 ml β-巯基乙醇混合。过滤培养基后，加入10 ng/ml FGF-2。 
	警告：β-巯基乙醇有毒，避免吸入、摄入和皮肤接触。</li>
	<li>KSR-分化培养基：将820 ml Knockout DMEM、150 ml KSR、10 ml L-谷氨酰胺、10 ml 青霉素-链霉素溶液（Pen/Strep）、10 ml MEM必需氨基酸溶液和1 ml β-巯基乙醇混合。</li>
	<li>N2分化培养基：将12 g DMEM/F12粉末溶解于980 ml dH₂O中2O，加入1.55 g葡萄糖、2 g碳酸氢钠和100 mg APO人转铁蛋白。混合2 ml dH2加入25 mg人胰岛素和40 μl 1 N NaOH，将溶解后的溶液加入培养基中。添加100 mM 二盐酸腐胺、0.5 mM 硒酸钠、1 mM 孕酮，并用dH2O定容至1 L。</li>
</ol>
1.2 培养皿包被
<ol>
	<li>Matrigel 包被：用移液管将 19 ml DMEM/F12 加入 1 ml 冻存的 Matrigel 分装物中，使其溶解。通过 40 μm 细胞筛过滤以去除团块，并将 8 ml 包被液加入 10 cm 培养皿中。室温孵育 1 小时。在接种细胞前立即吸除 Matrigel 溶液。 
	注意：操作 Matrigel 时应迅速，因其在高于 4 °C 的温度下易形成团块。</li>
	<li>PO/Lam/FN 包被：向 10 cm 培养皿中加入 10 ml 含 15 μg/ml 多聚-L-鸟氨酸氢溴化物的 1× PBS。37 °C 过夜孵育。用 1× PBS 洗涤一次，然后每 10 cm 培养皿中加入 10 ml 含 2 μg/ml 小鼠层粘连蛋白-I 和 2 μg/ml 纤连蛋白的 1× PBS。37 °C 过夜孵育。接种细胞前，彻底吸除溶液，并将培养皿无盖直立置于超净台壁上，在室温下充分干燥 15–20 分钟。&#160; 
	注意：当肉眼可见表面出现晶体结构时，表明培养皿已完全干燥，可进行细胞接种。干燥后的培养皿可在室温下放置数小时。PO/Lam/FN 包被的培养皿需提前两天制备。紧急情况下，Lam/FN 孵育时间可缩短至 2–4 小时&#160;，但可能导致分化或存活效果不理想。</li>
</ol>
1.3 人多能干细胞的维持
注意：hPSCs 在添加了 10 ng/ml FGF-2 的 HES 培养基中培养，基质为 0.1% 明胶包被且经有丝分裂失活的小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs），培养条件如先前所述10,12。细胞应每 6–8 天传代一次。
<ol>
	<li>在室温下，用 8 ml 0.1% 明胶（溶于不含镁和钙的 1× PBS 中）包被一个 10 cm 培养皿，孵育 5 分钟。</li>
	<li>将冻存的 MEFs 在 37 °C 水浴中快速解冻。将 100 万个 MEFs 加入 10 ml DMEM/10% FBS 中。</li>
	<li>吸除明胶溶液，并接种细胞。在 37 °C 下孵育至少 6 小时。</li>
	<li>从已准备好的 MEF 培养板中吸除 DMEM/10% FBS，用 1× PBS 洗涤一次，然后加入 10 ml 添加了 10 μM Y-27632 二盐酸盐的 HES 培养基。将培养基在 37 °C 预热 20 分钟。&#160; 
	注意：对于 hPSCs 的手动传代，需使用配备内置显微镜的超净工作台。然而，细胞也可通过适当的替代方法进行传代。</li>
	<li>在配备内置显微镜的超净工作台中，使用细胞刮刀分离单个克隆，并使其悬浮。</li>
	<li>使用 1 ml 注射器吸取悬浮的克隆，并将其转移至新鲜且预热的 MEF 培养板上。将约四分之一的细胞转移至新的培养皿中。在 37 °C 下孵育。</li>
	<li>每天用新鲜的 HES 培养基更换培养液。</li>
</ol>
2. 用于分化的 hPSCs 接种
注意：当hPSC集落较大，边缘仍清晰，且集落边缘尽可能少出现分化细胞时，应进行传代或接种以诱导分化（见图1B）。若采用手动传代方式维持细胞，集落应足够大，以便肉眼可轻易观察。为准确掌握这一时间节点，可单独培养一皿hPSC，两周内不进行传代，观察细胞达到并超过传代/分化最佳时机的过程。
<ol>
	<li>在开始分化前1小时，用基质胶（Matrigel）包被10 cm培养皿。&#160;可在4倍显微镜下观察，以确认基质胶包被是否成功。&#160;</li>
	<li>当hPSCs准备传代时，吸除培养基，并向细胞中加入4 ml 0.05%胰蛋白酶-EDTA。</li>
	<li>水平剧烈震荡培养皿2分钟，直至在显微镜下可见MEF细胞以单细胞形式从培养皿表面脱离，而hPSC克隆仍保持克隆状态附着。</li>
	<li>立即彻底吸除胰蛋白酶，并将培养皿在室温下静置2–4分钟。</li>
	<li>向培养皿中加入2 ml HES培养基，并使用P1000移液器吹打使细胞脱落。 
	注意：如果细胞难以从表面脱离，可将培养皿在室温下空置孵育额外2–3分钟。</li>
	<li>将细胞转移至含8 ml HES培养基的离心管中，培养基中需添加10 μM Y-27632二盐酸盐。</li>
	<li>吸除预先准备好的10 cm培养皿中的基质胶，按1:1或1:2的比例（例如：将一个10 cm培养皿中的细胞分到两个10 cm培养皿中）将细胞接种至包被基质胶的培养皿中。在37 °C孵育过夜。 
	注意：该接种密度应达到约100,000个细胞/cm2。</li>
</ol>
3. 诱导神经分化
注意：当细胞融合度达到90-100%时（通常为次日），即可开始诱导分化（第0天）（见图1C）。如果尚未达到准确的融合度，可每天用HES培养基喂养细胞，直至其适合进行分化。或者，也可增加初始接种的细胞数量。
<ol>
	<li>在第0至3天，每天使用含有0.1 μM LDN193189和10 μM SB431542的10 ml/10 cm培养皿KSR分化培养基喂养细胞。</li>
	<li>在第4和5天，使用含有LDN193189和SB431542的75% KSR分化培养基和25% N2分化培养基喂养细胞。</li>
	<li>在第6和7天，使用含有LDN193189和SB431542的50% KSR分化培养基和50% N2分化培养基喂养细胞。</li>
	<li>在第8和9天，使用含有LDN193189和SB431542的25% KSR分化培养基和75% N2分化培养基喂养细胞。</li>
	<li>在第9和10天，按照1.2.2节所述准备PO/Lam/FN培养皿，用于第11天的细胞传代。</li>
	<li>在第10天，使用含有LDN193189和SB431542的N2分化培养基喂养细胞。</li>
</ol>
4. 用于神经嵴细胞分化的再铺板成滴
<ol>
	<li>第11天，吸除先前准备好的培养板中的Lam/FN，并在室温下完全干燥20-30分钟，具体操作如1.2.2所述。</li>
	<li>移除正在分化的细胞中的培养基，用1×PBS洗涤细胞一次，每10 cm培养皿加入8 ml的accutase，于37 °C孵育20分钟。</li>
	<li>使用细胞刮刀将细胞刮下，并用5 ml移液器在accutase中重悬细胞，将细胞悬液转移至15 ml离心管中。</li>
	<li>加入5 ml 1×PBS，以114 × g离心5分钟。</li>
	<li>将细胞重悬于10 ml 1×PBS中。为确保获得单细胞悬液，通过40 μm细胞筛过滤，并使用血细胞计数板或等效方法进行细胞计数。</li>
	<li>离心后弃上清，将细胞重悬于N2分化培养基中，培养基中含200 μM抗坏血酸（AA）、20 ng/ml BDNF、100 ng/ml FGF8、20 ng/ml SHH、10 μM Y-27632二盐酸盐，细胞浓度为100,000–150,000个细胞/10 μl。</li>
	<li>使用多通道移液器，在已干燥的PO/Lam/FN 15 cm培养皿上，将10 μl液滴紧密点样但互不接触。 
	注意：一个10 cm培养皿的分化细胞通常可获得约2–3&#160;个15 cm培养皿的细胞，或每个15 cm培养皿约100个10 μl液滴。</li>
	<li>将液滴在室温下静置20–30分钟，然后非常小心地（避免扰动液滴）每皿加入30 ml N2/AA/BDNF/FGF8/SHH/Y培养基，并于37 °C孵育。</li>
	<li>第12天，小心地向每个15 cm培养皿加入20 ml N2/AA/BDNF/FGF8/SHH培养基进行换液。</li>
	<li>从第14天至第17天，每隔两天或三天使用N2/AA/BDNF/FGF8培养基对细胞进行换液。</li>
	<li>第16天和第17天，准备PO/Lam/FN培养板，用于FACS分选后的神经嵴细胞重新接种。</li>
</ol>
5. 神经嵴细胞的荧光激活细胞分选（FACS）
注意：FACS 细胞准备大约需要 2 小时。
<ol>
	<li>第18天，移除培养基，用1× PBS在培养皿中清洗细胞一次，加入12 ml的accutase。于37 °C孵育20分钟。</li>
	<li>使用细胞刮刀将细胞从培养皿表面刮下，使其悬浮。用5 ml移液器吹打细胞使其成为单细胞悬液，转移至50 ml离心管中，并加入30 ml 1× PBS。在114 × g条件下离心5分钟。</li>
	<li>使用P1000移液器将细胞重悬于1 ml 2% FBS/HBSS中（HBSS中含有15 mM HEPES）。再加入19 ml 2% FBS/HBSS，并通过40 μm细胞滤网过滤，以确保获得单细胞悬液。将细胞置于冰上孵育15分钟以进行抗体封闭，随后使用血细胞计数板对细胞进行计数。</li>
	<li>离心细胞，然后将其重悬于2% FBS/HBSS中，调整细胞浓度至每毫升含1000万个细胞。</li>
	<li>分别预留100万个细胞作为未染色对照、单染色对照（仅HNK-1、仅p75）以及仅二抗染色对照（仅APC、仅488）用于FACS分析。</li>
	<li>在1 ml细胞悬液中，每1000万个细胞加入5 μl HNK-1和5 μl p75一抗，加入至相应样品中，于冰上孵育20分钟。</li>
	<li>用10 ml 1× PBS洗涤细胞（114 × g离心5分钟），将细胞重悬于1 ml 2% FBS/HBSS中。在1 ml悬液中，每1000万个细胞加入2 μl APC和1 μl 488二抗，加入至相应样品中，于冰上避光孵育20分钟。 
	注意：APC和488分别为本实验中用于检测HNK-1和p75的一抗对应的二抗。</li>
	<li>用10 ml 1× PBS洗涤细胞两次，将1000万个细胞重悬于500 μl含DAPI（终浓度0.5 ng/μl）或其他合适的活细胞染料的2% FBS/HBSS中，以在FACS分析中排除死细胞。&#160;</li>
	<li>将样品转移至相应的FACS管中。</li>
	<li>准备含有0.5 ml 2% FBS/HBSS的FACS管用于细胞收集。 
	注意：在分选期间，细胞和收集管需始终置于冰上并避光保存。</li>
	<li>使用配备可检测DAPI、APC和488荧光信号激光器的细胞分选仪，分选DAPI阴性、HNK-1阳性、p75阳性（DAPI⁻/HNK-1⁺/P75⁺）的双阳性细胞。 
	注意：细胞的准备时间和操作过程会导致少量细胞死亡，DAPI仅对死细胞染色，因此可将死细胞从分选群体中排除。任何其他可用的活/死细胞染色试剂在此目的下均具有同等效果。DAPI本身不会对活细胞群体产生细胞毒性。</li>
</ol>
6. 分选细胞的重铺板、神经嵴细胞的维持与扩增
注意：FACS 分选的细胞应小心处理，以确保最佳存活率。在重新接种前应始终置于冰上。切勿涡旋或用力移液。可通过轻弹试管使细胞重新悬浮。
<ol>
	<li>流式细胞术分选后，计数神经嵴细胞（NC细胞），离心收集细胞，并用含10 ng/ml FGF2、20 ng/ml EGF和10 μM Y-27632二盐酸盐的N2分化培养基重悬，调整体积以使细胞密度适合接种为每10 μl液滴含30,000个细胞。</li>
	<li>将预先制备的PO/Lam/FN培养板彻底干燥，每10 cm培养皿接种约50–70个液滴。室温静置20–30&#160;分钟。</li>
	<li>小心地向每10 cm培养皿中加入20 ml N2/FGF2/EGF/Y-27632培养基，避免扰动液滴。将细胞置于37 °C培养箱中孵育。</li>
	<li>每2–3天使用N2/FGF2/EGF培养基更换培养液。 
	注意：神经嵴细胞大约每4–5天扩增或传代一次，或当其在液滴内开始堆积时进行传代。</li>
	<li>传代神经嵴细胞时，吸除培养基，用1× PBS洗涤细胞一次，每10 cm培养皿加入8 ml Accutase酶溶液。在37 °C孵育20分钟。</li>
	<li>用5 ml移液管将细胞从培养板上吹打下来，转移至15 ml离心管中，并加入6 ml 1× PBS。</li>
	<li>以114 × g离心5分钟。</li>
	<li>将细胞重悬于含10 ng/ml FGF2、20 ng/ml EGF和10 μM Y-27632二盐酸盐的N2分化培养基中，调整细胞密度至每10 μl液滴含20,000个细胞。</li>
	<li>将细胞以每10 μl液滴的形式重新接种至干燥的PO/Lam/FN培养板上。室温静置20–30分钟。</li>
	<li>小心地向每10 cm培养皿中加入20 ml N2/FGF2/EGF/Y-27632培养基。在37 °C孵育。 
	注意：神经嵴细胞可作为相对均一的前体细胞群体维持或扩增长达2周；更长时间的培养可能导致其分化为多种子代细胞类型。</li>
</ol>

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

为了成功地将人胚胎干细胞（hESC）或人诱导多能干细胞（hiPSCs）分化为R-NC细胞，需注意以下事项。必须始终在无菌培养条件下操作。尤其重要的是应定期检测hPSC培养物是否受到支原体污染，因为此类污染会阻碍有效分化，但在hPSC培养物中难以通过肉眼直接识别。R-NC分化应在细胞密度达到90–100%时启动；较低的细胞密度会影响细胞存活率及R-NC分化的效率。某些试剂（特别是支持高效神经嵴分化的KSR）的最佳浓度和批号需通过实验经验性验证。在第11天将细胞以液滴形式重新接种时，10 µl液滴内的细胞密度应较高，其最佳值需通过实验经验确定。适当的玫瑰花环结构（rosette）和神经嵴（NC）形成依赖于液滴内合适的细胞密度。我们通过实验观察发现，在使用accutase处理后至少清洗细胞两次，可提高细胞存活率。为通过FACS成功分离R-NC细胞，必须设置适当的实验对照，如未染色对照、单抗体染色对照以及仅二抗染色对照。死细胞可通过DAPI、7-AAD或碘化丙啶（Propidium Iodide）染色排除。此外，每一批次的特异性抗体都应通过实验经验确定其稀释比例。使用HNK-1和p75进行双染色对FACS纯化R-NC细胞至关重要，因为单染色可能...

人类胚胎干细胞（hESC）和人类诱导多能干细胞（hiPSC）已展现出巨大的潜力，尤其适用于那些缺乏良好动物模型或原代组织的人类疾病的研究及未来治疗。hESC/hiPSC 技术的应用实例包括：可由 hESC/hiPSC 无限量地生成特定研究所需的细胞类型，用于再生医学1. 可从携带特定疾病的患者体内获取细胞，并用于建立 体外 疾病模型2,3此类疾病模型随后可用于大规模药物筛选，以寻找新的药物化合物。4 以及对现有药物的有效性和毒性的测试5. 体外 疾病模型有助于发现新的疾病机制。在应用hESC/iPSC技术的所有研究中，使用与目标疾病相关的特定且定义明确的细胞类型至关重要。因此，建立稳定且可重复的 体外 分化方案对于hESC/hiPSC技术的所有应用都至关重要。理想的方案应具有最小的变异性、时间消耗、操作难度和成本，并在不同hESC/hiPSC细胞系及不同研究人员之间实现最大程度的可重复性。
神经嵴（NC）细胞在脊椎动物神经管形成期间出现于表皮与神经上皮之间。这些细胞在发育中的胚胎内广泛增殖并迁移，可分化为多种多样的子代细胞类型，包括骨/软骨、颅面骨骼、感觉神经、许旺细胞、黑色素细胞、平滑肌细胞、肠神经元、自主神经元、嗜铬细胞、心脏间隔细胞、牙齿以及肾上腺/甲状腺腺体细胞。6因此，神经嵴细胞是干细胞领域中一种极具吸引力的细胞类型，对于多种疾病（如先天性巨结肠症）的建模具有重要意义。7家族性自主神经功能异常8 以及神经母细胞瘤等癌症9此外，它们还提供了研究人类胚胎发育某些方面的可能性 体外.
目前可获得且广泛应用的 体外 从人胚胎干细胞诱导神经嵴细胞的分化方案10,11 需要长达35天的分化过程，且该过程依赖于基质饲养层细胞（如MS5细胞）进行神经诱导，因此是在定义不明确的条件下进行的。尽管该方法可放大以生成大量神经嵴细胞，例如用于高通量药物筛选所需的情况4，这一过程耗费人力且成本较高。此外，该方法涉及神经玫瑰花结的手动传代，操作难以重复，因而整体变异性较大，尤其在应用于多种hESC或hiPSC细胞系时更为明显。本文展示了一种无需饲养层细胞、历时18天的分步诱导神经嵴（NC）细胞的方法。该方法比现有方案更短且体系更明确。更重要的是，该方法在不同hiPSC细胞系中均能稳定高效地生成NC细胞。重要的是，两种方案所产生的NC细胞均出现在神经玫瑰花结的边缘区域（下文简称玫瑰花结来源的NC细胞或R-NC）。两种方法获得的细胞在形态上完全相同，表达相同的NC标志物，并在微阵列分析中聚类在一起。采用新方案获得的NC细胞（R-NC）具有功能活性，与采用传统方案获得的NC细胞（MS5-R-NC）相似，能够迁移并进一步分化为神经元。因此，R-NC细胞可与MS5-R-NC细胞并行使用。该R-NC细胞诱导方案在从hESC/iPSC分化获得NC细胞的所有应用中均具有广泛用途。

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>Gibco-Life Technologies</td><td>11965-092</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清（FBS）</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>S11150</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Gibco-Life Technologies</td><td>11330-032</td><td></td></tr><tr><td>无血清替代物（Knockout Serum Replacement）</td><td>Gibco-Life Technologies</td><td>10828-028</td><td>应测试批次</td></tr><tr><td>L-谷氨酰胺</td><td>Gibco-Life Technologies</td><td>25030-081</td><td></td></tr><tr><td>青霉素/链霉素</td><td>Gibco-Life Technologies</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>MEM最低必需氨基酸溶液&amp;nbsp;</td><td>Gibco-Life Technologies</td><td>11140-050</td><td></td></tr><tr><td>&amp;beta;-巯基乙醇&amp;nbsp;</td><td>Gibco-Life Technologies</td><td>21985-023</td><td>有毒</td></tr><tr><td>重组人碱性成纤维细胞生长因子（FGF2）</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>233-FB-001MG/CF</td><td></td></tr><tr><td>无血清DMEM</td><td>Gibco-Life Technologies</td><td>10829-018</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12 粉末&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>12500-096</td><td></td></tr><tr><td>葡萄糖</td><td>Sigma</td><td>G7021</td><td></td></tr><tr><td>碳酸氢钠&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>APO人转铁蛋白</td><td>Sigma</td><td>T1147</td><td></td></tr><tr><td>人胰岛素&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>I2643</td><td></td></tr><tr><td>亚精胺二盐酸盐</td><td>Sigma</td><td>P5780</td><td></td></tr><tr><td>亚硒酸盐</td><td>Sigma</td><td>S5261</td><td></td></tr><tr><td>孕酮</td><td>Sigma</td><td>P8783</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel 基质</td><td>BD Biosciences</td><td>354234</td><td></td></tr><tr><td>聚-L-鸟氨酸氢溴酸盐</td><td>Sigma</td><td>P3655</td><td></td></tr><tr><td>小鼠层粘连蛋白-I</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>3400-010-01</td><td></td></tr><tr><td>纤维连接蛋白</td><td>BD Biosciences</td><td>356008</td><td></td></tr><tr><td>Dispase（在Hank's平衡盐溶液中，5 U/ml）</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>7013</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白酶-EDTA&amp;nbsp;</td><td>Gibco-Life Technologies</td><td>25300-054</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632 二盐酸盐</td><td>Tocris-R&amp;amp;D Systems</td><td>1254</td><td></td></tr><tr><td>LDN193189</td><td>Stemgent</td><td>04-0074</td><td></td></tr><tr><td>SB431542</td><td>Tocris-R&amp;amp;D Systems</td><td>1614</td><td></td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Innovative Cell Technologies</td><td>AT104</td><td></td></tr><tr><td>抗坏血酸&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>A4034</td><td></td></tr><tr><td>BDNF</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>248-BD</td><td></td></tr><tr><td>FGF8</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>423-F8</td><td></td></tr><tr><td>小鼠重组音猬因子（SHH）</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>464SH</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Gibco-Life Technologies</td><td>14170-112</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Gibco-Life Technologies</td><td>1563-080</td><td></td></tr><tr><td>人重组EGF</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>236EG</td><td></td></tr><tr><td>明胶（无Mg/Ca的PBS）</td><td>本实验室制备</td><td></td><td></td></tr><tr><td>抗体：</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>抗HNK-1/N-Cam（CD57）mIgM</td><td>Sigma</td><td>C6680-100TST</td><td>应测试批次</td></tr><tr><td>抗p75 mIgG1（神经营养因子受体）</td><td>Advanced Targeting Systems</td><td>AB-N07</td><td>应测试批次</td></tr><tr><td>APC标记的抗大鼠mIgM</td><td>BD Parmingen</td><td>550676</td><td>应测试批次</td></tr><tr><td>AlexaFluor 488 标记的山羊抗小鼠IgG1&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>A21121</td><td>应测试批次</td></tr><tr><td>抗Oct4 mIgG2b（使用稀释比例1:200）</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-5279</td><td>应测试批次</td></tr><tr><td>材料/设备：</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>小鼠胚胎成纤维细胞（700万个细胞/管）</td><td>GlobalStem</td><td>GSC-6105M</td><td></td></tr><tr><td>细胞培养皿：10 cm 和 15 cm 培养板、离心管、FACS管、&amp;nbsp;移液器、移液器吸头</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>玻璃血细胞计数板</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>细胞培养用离心机</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>细胞培养用孵育箱（CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;、湿度和温度可控）</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>带内置显微镜的细胞培养超净工作台</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>细胞培养用生物安全柜</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>细胞分选仪，&lt;i&gt;i.e.&lt;/i&gt; MoFlo</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>倒置显微镜</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1 ml TB 注射器 27Gx1/2</td><td>BD Biosciences</td><td>309623</td><td></td></tr><tr><td>聚乙烯细胞刮刀</td><td>Corning Incorporated</td><td>3008</td><td></td></tr></tbody></table>

无需饲养层的人多能干细胞来源的神经嵴前体细胞的分离培养

Feeder-free Derivation of Neural Crest Progenitor Cells from Human Pluripotent Stem Cells

人类多能干细胞（hPSCs）在研究人类胚胎发育、体外模拟人类疾病以及作为疾病或创伤后再生治疗所需的可移植细胞来源方面具有巨大潜力。神经嵴（NC）细胞是多种成体体细胞的前体细胞，例如周围神经系统和胶质细胞、黑色素细胞以及间充质细胞。它们是研究人类胚胎发育过程诸多方面的宝贵细胞来源，包括细胞命运决定和迁移。将神经嵴前体细胞进一步分化为终末分化细胞类型，为人类疾病建模提供了可能 体外，研究疾病机制并为再生医学生成细胞。本文介绍了对现有的一种常用方法的改进 体外 从人多能干细胞（hPSCs）诱导神经嵴细胞的分化方案。该新方案需18天分化时间，无需饲养层，易于扩增，且在人胚胎干细胞（hESC）系及人诱导多能干细胞（hiPSC）系中均具有高度可重复性。新旧两种方案所获得的神经嵴细胞具有相同的细胞身份。

相较于MS5-R-NC方案11，R-NC方案的两项最重要改进在于采用无饲养层的明确分化条件，以及整体缩短了实验所需时间。MS5饲养细胞13是来源于小鼠骨髓的基质细胞，已被证实可支持人胚胎干细胞（hESCs）向神经方向分化14。在低密度条件下将hESCs培养于MS5饲养细胞上时，细胞会形成上皮样结构及神经玫瑰花环结构15，神经嵴（NC）细胞即出现在这些结构的边缘区域10，从而模拟了人类早期神经发育过程。然而，目前尚不清楚MS5饲养细胞释放了哪些信号分子和生长因子，因此其分化条件缺乏明确定义，导致在重复实验及不同人多能干细胞（hPSC）系之间难以重现结果。为实现有效的神经诱导，hESCs必须以低密度、小克隆形式接种于MS5饲养层上，这限制了实验的扩增能力，也难以获得高产量的分化细胞。2009年，研究人员开发出一种高效诱导hPSC神经分化的方案12。该方法将hPSC以高密度单层形式接种，无需MS5饲养细胞，可在10天内实现高效的神经诱导。我们借鉴了该方案的设计思路，对MS5-R-NC分化方案进行了优化（<stro...

源自人多能干细胞（hPSC）的神经嵴（NC）细胞在模拟人类发育与疾病以及细胞替代治疗方面具有巨大潜力。本文介绍了一种目前广泛使用的无饲养层改良方法in vitro介绍了从人多能干细胞（hPSCs）诱导神经嵴细胞（NC细胞）的分化方案。

人类多能干细胞（hPSCs）在研究人类胚胎发育、体外模拟人类疾病以及作为……方面具有巨大潜力

本实验的总体目标是通过一种简短、可重复且成分明确的方案，将人多能干细胞诱导生成神经嵴前体细胞。这些细胞可用于体外研究与神经嵴相关的疾病，或进一步分化为下游子代细胞。该过程首先将高密度的人多能干细胞以单层形式接种在Matrigel基质上。第二步是使用特定序列和组合的小分子诱导细胞分化为神经上皮细胞，这些小分子可影响关键的信号通路。接下来，将神经上皮细胞重新接种，并进一步分化为神经嵴前体细胞。最后一步是通过荧光激活细胞分选技术分离神经嵴细胞。最终，通过免疫荧光和功能检测（例如细胞迁移能力）来证明已成功生成正常的神经嵴细胞。该技术相较于现有的从人多能干细胞诱导神经嵴细胞的方案，其主要优势在于耗时更短，仅需18天。由于无需使用MS5饲养细胞，该方法具有更高的可重复性。该体系易于放大，且在不同的人多能干细胞系之间具有高度可重复性。该技术的应用前景包括神经谱系相关人类疾病机制的研究，并有望提升这些疾病体外建模和药物筛选的精细程度。开始本方案之前，需确保人多能干细胞的集落足够大，肉眼可见，且边缘清晰，集落边界仅有少量分化细胞。当人多能干细胞准备传代时，吸除培养基，用5毫升1×PBS洗涤一次，然后向细胞中加入4毫升含EDTA的0.05%胰蛋白酶。接下来，将培养皿水平剧烈振摇2分钟，直至在显微镜下观察到小鼠胚胎成纤维细胞以单细胞形式从培养皿表面脱落。人多能干细胞（HPSC）集落将作为集落保留在培养皿上，立即彻底吸除胰蛋白酶，并将培养板置于室温下孵育两到四分钟。向培养板中加入两毫升 HES 培养基，使用 P1000 移液器吹打使细胞脱落。如果细胞不易脱离，可再额外孵育两到三分钟。在室温下，将细胞悬液转移至含有 8 毫升 HES 培养基的 15 毫升锥形管中，HES 培养基中添加有 10 微摩尔的 Y 2 7 6 3 2 二盐酸盐。然后吸出先前处理过的 10 厘米培养皿中的基质胶，并以 1:1 或 1:2 的比例将细胞接种到经基质胶处理的培养板中。将细胞置于 37 摄氏度、5% 二氧化碳培养箱中过夜培养。每天用 HES 培养基喂养细胞，直至准备进行分化。当细胞融合度达到 90% 至 100% 时，开始神经分化。此日记为第 0 天。从第0天到第3天，每天用含有0.1 µM LDN-193189和10 µM SB-431542的10毫升KSR分化培养基对细胞进行换液。然后在第4天和第5天，用含有75% KSR分化培养基、25% AND2分化培养基、0.1 µM LDN-193189以及10 µM SB-431542的10毫升培养基喂养细胞。在第6天和第7天，使用调整为含50% KSR分化培养基和50% AND2分化培养基的培养液喂养细胞，并额外添加0.1 µM LDN-193189和10 µM SB-431542。在第8至第9天，用25%KSR分化培养基与75%and two分化培养基喂养细胞，两种培养基均含有0.1 µM LDN 19318和10 µM SB 4352。随后在第9天和第10天，按照文本方案中的描述，用多聚-L-鸟氨酸、层粘连蛋白1和纤维连接蛋白包被培养皿，用于第11天的细胞传代。在第10天至第11天，吸去预先包被的培养皿中的层粘连蛋白1和纤维连接蛋白溶液，并在组织培养罩内室温下干燥20至30分钟。接着，移除分化细胞中的培养基，用一倍体积的磷酸盐缓冲液（XPBS）洗涤细胞一次。然后每10厘米培养皿中加入8毫升解离液（acuate），在37摄氏度下孵育20分钟。孵育结束后，使用细胞刮刀将细胞刮下，并将细胞重新悬浮于Accutane溶液中。用5毫升移液管将细胞悬液转移至15毫升锥形管中。接着向管中加入5毫升1×PBS，以115 ×g离心5分钟。弃去上清液，将细胞沉淀重悬于10毫升1×PBS中。然后通过40微米细胞筛过滤细胞悬液，以确保获得单细胞悬液。使用血细胞计数板对细胞进行计数。以115 × g离心5分钟，再次沉淀细胞，并将细胞重悬于补充型N2分化培养基中，调整细胞浓度至每10微升含100,000至150,000个细胞。使用重复移液器将10微升细胞悬液滴加至已用多聚-L-鸟氨酸预处理的15厘米培养皿中。层粘连蛋白1和纤连蛋白。将液滴在室温下静置15至20分钟。然后非常小心地向培养板中加入30毫升补充的N2分化培养基，注意不要扰动液滴。将细胞置于含5%二氧化碳的培养箱中，在37摄氏度下孵育过夜。第12天，每15厘米培养皿中加入20毫升含200 µM抗坏血酸、20 ng/mL脑源性神经营养因子、100 ng/mL成纤维细胞生长因子8以及20 ng/mL sonic hedgehog的N2分化培养基，小心喂养细胞。然后从第14天到第17天，每隔两到三天使用仅含200 µM抗坏血酸、20 ng/mL脑源性神经营养因子和100 ng/mL成纤维细胞生长因子8的N2分化培养基对细胞进行换液。在第16天和第17天准备包被有多聚-L-鸟氨酸、层粘连蛋白1和纤连蛋白的培养板，用于神经嵴细胞的传代培养。在第18天进行传真分析后，通过荧光激活细胞分选法对细胞进行分选，计数神经嵴细胞，然后以115 ×g离心5分钟。将细胞沉淀重悬于N2分化培养基中，该培养基添加了10纳克/毫升的补充物。FGF-2 20 纳克/毫升，EGF 和 10 微摩尔/升 Y-27632 二盐酸盐，细胞浓度为每 10 微升 30,000 个细胞。将先前用多聚-L-鸟氨酸、层粘连蛋白-1 和纤连蛋白处理过的培养皿彻底干燥。然后每 10 厘米培养皿接种约 50 至 70 滴细胞悬液。将细胞在室温下孵育15至20分钟，每10厘米培养皿中加入20毫升N₂。分化培养基中添加10纳克/毫升FGF₂、20纳克/毫升EGF以及10微摩尔Y-27632二盐酸盐，操作时避免扰动液滴。然后将细胞在37摄氏度、5%二氧化碳培养箱中孵育过夜。孵育结束后，按照随附的文字方案进行神经嵴细胞的维持和传代。神经嵴细胞在18天内由人多能干细胞分化获得，该过程采用了一种新的无饲养层体外分化方案。第18天的流式分析鉴定出同时表达HNK-1和P75的细胞，证实了神经嵴细胞的存在。在无饲养层分化方案和依赖饲养层细胞的分化方案中，神经嵴细胞均经历了神经玫瑰花结阶段。此外，分选后的细胞具有相同的形态，并表达神经嵴标志物HNK-1和P75；对这两种分化方案所获得的神经嵴细胞进行全基因表达谱比较发现，这两组细胞在聚类分析中紧密聚集在一起。采用无饲养层方案衍生的神经嵴细胞迁移能力分析显示，这些细胞在48小时后成功迁移至划痕区域。此外，经过额外四天的分化，这些细胞表现出向自主神经系统细胞分化的潜能，这通过mash1和tuJ1的阳性染色结果得到证实。观看本视频后，您应能充分理解如何在体外将人多能干细胞神经化并诱导生成神经嵴前体细胞。

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从人多能神经嵴前体细胞的无饲养推导干细胞

体外培养神经嵴干细胞（NCSC）需要使用特殊的培养基（NCSCM）。NCSCM的关键成分是鸡胚提取物（CEE）。本文详细描述了制备最大产量的高纯度、高质量CEE的准确技术，包括分离、匀浆、离心和过滤等步骤的具体操作细节。...

制备鸡胚提取物以培养小鼠神经嵴干细胞

我们已建立一种在特定条件下利用小分子直接从多能性人胚胎干细胞诱导生成神经母细胞的方案，该方法能够大量获得发育中中枢神经系统所需的神经前体细胞和神经元细胞类型，用于神经修复。...

利用小分子诱导高效地从多能性人胚胎干细胞分化获得人神经前体细胞与神经元

从神经管中分离胚胎神经嵴有助于利用 体外...

从小鼠胚胎神经管中分离和培养神经嵴细胞

多能性人类干细胞（hPSCs）的神经元分化方案通常耗时较长，且需要较高的细胞培养技术。本文中，我们改进了一种基于小分子的分化方法，将其应用于多孔板体系，从而能够以简单、快速且高效的方式在受控条件下生成人类神经元。...

在多孔板格式中快速高效地从人类多能干细胞生成神经元

多能干细胞，包括胚胎干细胞或诱导性多能干细胞（iPS细胞），是获取人类分化细胞（包括心肌细胞）的重要来源。本文将重点介绍iPS细胞向心脏细胞的诱导分化，展示如何通过基于拟胚体的方案获得功能性人类心肌细胞。...

人类心肌细胞的生成：从无饲养层人诱导性多能干细胞分化的心肌细胞制备方案

诱导多能干细胞的生成为自体移植的获取提供了广阔的前景。然而，经历多能性状态以及繁琐的再分化过程仍然阻碍着其临床转化。本文描述了成人人类成纤维细胞的获取及其直接转化为诱导性神经前体细胞，并进一步分化为神经谱系细胞的方法。...

成年成人成纤维细胞的分离及其直接转化为可扩增的神经前体细胞

无饲养层条件下由人多能干细胞分化获得黑色素细胞

本文介绍了一种在无饲养层且无异源成分的条件下，由人多能干细胞精确诱导生成生血性内皮细胞的实验方案。该方法在疾病建模及治疗性化合物筛选方面具有广泛的应用前景。...

无饲养层和无异种成分的确定性条件下人多能干细胞向造血内皮细胞的分化

在本实验方案中，我们描述了一种稳定且高效的分化策略，可用于由人类多能干细胞生成节后交感神经元。该模型将为多种自主神经系统疾病的研究所需的神经元提供来源。...

在无饲养层且化学成分明确的培养条件下利用人多能干细胞高效分化出节后交感神经元

我们介绍一种三维（3D） 体外...

颅神经嵴细胞三维培养 体外 多重检测的分化方案

了解如何利用小分子信号通路调控，在18天内从无饲养层的人多能干细胞高效诱导分化出神经嵴前体细胞，并通过荧光激活细胞分选进行纯化。该方法为神经嵴相关疾病研究及细胞替代治疗提供了可重复、易规模化的技术平台。

无需饲养层的人多能干细胞来源的神经嵴前体细胞的分离培养

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