Name: 下腔静脉间置移植物在小鼠模型中植入 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-06-04T14:15:00.000+00:00
Duration: 12 min 39 s
Description: 学习在小鼠模型中植入下腔静脉间置移植物的方法，用于研究组织工程血管移植物中新组织形成和细胞浸润的机制。该技术结合可生物降解支架与骨髓单核细胞，通过免疫组织化学分析细胞外基质沉积，为改进血管移植物设计提供重要见解。

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本工作部分由美国国立卫生研究院（NIH）资助（项目编号：RO1 HL098228），资助对象为 CKB。

注意：所有动物实验程序均经全国儿童医院机构动物护理和使用委员会批准。
1.&#160;移植物制备
<ol>
	<li>在通风橱中，将100 mg P(LA/CL)加入2 ml 二氧六环中，配制ε-己内酯与L-丙交酯共聚物P(LA/CL)溶液。将溶液置于涡旋振荡器上，持续混合1–1.5小时，直至完全溶解。&#160;</li>
	<li>同时，从冰箱中取出一片聚乙醇酸（PGA）毡，裁剪出数个5 × 8 mm的片段。另将一支0.1–10 µl移液枪头在滤膜上方稍作剪切，切去尖端。</li>
	<li>将一支19 G针头（长度1.5）插入移液枪头的远端，并使用显微镊子将PGA毡包裹在针头上。</li>
	<li>在19 G针头插入枪头的同时，用钝头的18 G针头小心地将毡推至移液枪头的远端（该部位内腔比近端更平直）。</li>
	<li>从顶部向移液枪头中加入40 µl P(CL/LA)溶液，使PGA毡充分浸透。然后使用移液器排空气泡。 如有需要，可重复此步骤。</li>
	<li>将移植物放入50 ml离心管中，并置于-80 °C冰箱中冷冻20分钟。确保针头朝下放置。</li>
	<li>将离心管转移至冷冻干燥机中，抽真空干燥24小时。注意打开管盖，以保证空气流通。</li>
	<li>取出移植物，将其从针头上取下。剪去两端，保留约5 mm长的片段，再将其重新套回针头以维持其形状。将移植物保存在干燥器中。</li>
	<li>在接种细胞前，将支架置于生物安全柜中，用紫外光照射过夜。</li>
</ol>
2. 骨髓单个核细胞的采集与分离
<ol>
	<li>使用过量的氯胺酮/赛拉嗪（氯胺酮 200 mg/kg，赛拉嗪 20 mg/kg）对小鼠实施安乐死。</li>
	<li>从 3 只小鼠中取出骨骼（股骨和胫骨）用于 10 次移植物植入，并将其置于含有 10 cc RPMI 的培养皿中。剪除骨骼两端，使用配备 25 G 针头的注射器将骨髓冲洗至另一含有 3 cc RPMI 的新培养皿中。收集骨髓与 RPMI 溶液至 15 cc 离心管中，并用额外的 2 cc RPMI 冲洗培养皿以收集残留的骨髓。</li>
	<li>取样（5–10 µl），使用自动细胞计数仪或血细胞计数板进行细胞计数。记录结果。</li>
	<li>在 15 cc 离心管中加入 5 cc Ficoll，然后缓慢加入骨髓与 RPMI 溶液，注意轻柔操作以避免与 Ficoll 混合。</li>
	<li>在 24 °C 条件下以 528 × g 离心 30 分钟，&#34;不启用刹车&#34;。</li>
	<li>移除上层粉红色液体，收集中间透明层 图 1（即单个核细胞层），并以 1:1 比例用 PBS 稀释。</li>
	<li>将稀释后的单个核细胞溶液在 24 °C 条件下以 528 × g 离心 10 分钟。</li>
	<li>弃去上清液，将沉淀物用 5 ml PBS 重悬。</li>
	<li>将重悬的沉淀物溶液在 24 °C 条件下以 528 × g 离心 10 分钟。</li>
	<li>弃去上清液，用适当体积的 RPMI（约 200 µl）重悬沉淀物。</li>
	<li>取 5–10 µl 样品，使用自动细胞计数仪或血细胞计数板进行细胞计数。记录结果，并重复计数一次，计算平均细胞数。</li>
	<li>用 RPMI 将细胞浓度调整至 1,000,000 个细胞/10 µl。</li>
</ol>
3.&#160;细胞接种
<ol>
	<li>向支架管腔内加入 5 µl RPMI，润湿 5 分钟，然后移除 RPMI。</li>
	<li>将步骤 2.12&#160;中获得的 10 µl RPMI 悬浮骨髓来源单核细胞加入支架管腔，静置 10 分钟&#160;，使细胞贴附于支架表面。</li>
	<li>将一根 19 G 针头截成 1 cm 长，插入支架管腔以维持支架形状。将样品置于 24 孔板中。</li>
	<li>每孔加入 1,000 µl RPMI，于培养箱中过夜培养。</li>
</ol>
4.&#160;移植物植入
<ol>
	<li>手术前对所有手术器械进行高压灭菌：精细剪刀1把，显微镊子3把，显微血管夹2个，持夹钳1把，显微持针器1把，弹簧剪1把，拉钩1个。</li>
	<li>选用6至8周龄的雌性C57BL/6小鼠作为组织工程血管移植物受体。将小鼠从笼中取出并称重，随后在腹部右下象限进行腹腔注射氯胺酮/赛拉嗪混合物（氯胺酮100 mg/kg，赛拉嗪10 mg/kg）以实施麻醉。术前使用酮洛芬（5&#160;mg/kg，腹腔注射）作为镇痛剂。</li>
	<li>通过尾部夹捏法检查镇静程度，然后剪除腹部毛发。用无菌眼科软膏润滑眼睛，将小鼠仰卧位固定于垫子上。使用聚维酮碘和酒精棉片对腹部进行消毒，用无菌洞巾覆盖小鼠，仅暴露切口区域。</li>
	<li>从剑突下方至耻骨上区做正中腹腔切口，插入自持式拉钩。将肠管用生理盐水浸湿的纱布包裹。钝性分离腹主动脉和下腔静脉，明确其位置。</li>
	<li>在腹主动脉和下腔静脉的近端和远端分别放置显微血管夹，钝性分离腹主动脉与下腔静脉，横断下腔静脉。如有必要，使用带锥形针的10-0单股缝线结扎腹主动脉分支。</li>
	<li>使用无菌10-0缝线，将下腔静脉间置移植物以端对端方式吻合于近端和远端。根据小鼠解剖结构修剪移植物，通常长度为1–2 mm。在移植物近端和远端各用一针固定，然后从移植物另一侧开始连续缝合4–5针。完成前壁缝合后，翻转血管夹和移植物，缝合后壁。植入过程中需频繁用肝素溶液冲洗移植物，以防急性血栓形成。</li>
	<li>先移除近端血管夹，使用局部可吸收无菌止血剂控制出血。待出血完全停止后，移除远端血管夹，并以相同方式控制出血。确保血液顺利通过移植物。</li>
	<li>使用带针6-0黑色单股聚酰胺缝线分两层缝合腹壁肌肉和皮肤。</li>
	<li>皮下注射0.5 ml生理盐水，将小鼠置于带加热垫的恢复笼中，直至其完全恢复活动能力。苏醒后，将小鼠转移至铺有纸垫的新笼中，并在饮水中给予镇痛药物（布洛芬，30 mg/kg）持续48小时。</li>
</ol>

<ol><li>Heart Association, A. merican <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heart+Disease+and+Stroke+Statistics%E2%80%942012+Update%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Heart Disease and Stroke Statistics—2012 Update.</a> Circulation. 125, (2012).</li>
<li>Shinoka, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Creation+Of+Viable+Pulmonary+Artery+Autografts+Through+Tissue+Engineering%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Thoracic+and+Cardiovascular+Surgery%22%5BJournal%5D)">Creation Of Viable Pulmonary Artery Autografts Through Tissue Engineering.</a> The Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 115, 536-546 (1998).</li>
<li>Hibino, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Late-term+results+of+tissue-engineered+vascular+grafts+in+humans%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Thoracic+and+Cardiovascular+Surgery%22%5BJournal%5D)">Late-term results of tissue-engineered vascular grafts in humans.</a> The Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 139, 431-436 (2010).</li>
<li>Shin'oka, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Midterm+clinical+result+of+tissue-engineered+vascular+autografts+seeded+with+autologous+bone+marrow+cells%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Thoracic+and+Cardiovascular+Surgery%22%5BJournal%5D)">Midterm clinical result of tissue-engineered vascular autografts seeded with autologous bone marrow cells.</a> The Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 129, 1330-1338 (2005).</li>
<li>Brennan, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue-engineered+vascular+grafts+demonstrate+evidence+of+growth+and+development+when+implanted+in+a+juvenile+animal+model%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Surg%22%5BJournal%5D)">Tissue-engineered vascular grafts demonstrate evidence of growth and development when implanted in a juvenile animal model.</a> Ann Surg. 248, 370-377 (2008).</li>
<li>Roh, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Construction+of+an+autologous+tissue-engineered+venous+conduit+from+bone+marrow-derived+vascular+cells%3A+optimization+of+cell+harvest+and+seeding+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pediatric+Surgery%22%5BJournal%5D)">Construction of an autologous tissue-engineered venous conduit from bone marrow-derived vascular cells: optimization of cell harvest and seeding techniques.</a> Journal of Pediatric Surgery. 42, 198-202 (2007).</li>
<li>Hibino, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue-engineered+vascular+grafts+form+neovessels+that+arise+from+regeneration+of+the+adjacent+blood+vessel%5BTitle%5D)+AND+%22The+FASEB+Journal%22%5BJournal%5D)">Tissue-engineered vascular grafts form neovessels that arise from regeneration of the adjacent blood vessel.</a> The FASEB Journal. 25, 2731-2739 (2011).</li>
<li>Hibino, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+critical+role+for+macrophages+in+neovessel+formation+and+the+development+of+stenosis+in+tissue-engineered+vascular+grafts%5BTitle%5D)+AND+%22The+FASEB+Journal%22%5BJournal%5D)">A critical role for macrophages in neovessel formation and the development of stenosis in tissue-engineered vascular grafts.</a> The FASEB Journal. 25, 4253-4263 (2011).</li>
<li>Naito, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+the+Natural+History+of+Extracellular+Matrix+Production+in+Tissue-Engineered+Vascular+Grafts+during+Neovessel+Formation%5BTitle%5D)+AND+%22Cells+Tissues+Organs%22%5BJournal%5D)">Characterization of the Natural History of Extracellular Matrix Production in Tissue-Engineered Vascular Grafts during Neovessel Formation.</a> Cells Tissues Organs. 195, 60-72 (2012).</li>
<li>Naito, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beyond+Burst+Pressure%3A+Initial+Evaluation+of+the+Natural+History+of+the+Biaxial+Mechanical+Properties+of+Tissue+Engineered+Vascular+Grafts+in+the+Venous+Circulation+Using+a+Murine+Model%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng.+Part+A%22%5BJournal%5D)">Beyond Burst Pressure: Initial Evaluation of the Natural History of the Biaxial Mechanical Properties of Tissue Engineered Vascular Grafts in the Venous Circulation Using a Murine Model.</a> Tissue Eng. Part A. 20, (2013).</li>
<li>Mirensky, T. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue-engineered+vascular+grafts%3A+does+cell+seeding+matter%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pediatric+Surgery%22%5BJournal%5D)">Tissue-engineered vascular grafts: does cell seeding matter.</a> Journal of Pediatric Surgery. 45, 1299-1305 (2010).</li>
<li>Roh, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue-engineered+vascular+grafts+transform+into+mature+blood+vessels+via+an+inflammation-mediated+process+of+vascular+remodeling%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Tissue-engineered vascular grafts transform into mature blood vessels via an inflammation-mediated process of vascular remodeling.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 107, 4669-4674 (2010).</li>
<li>Mirensky, T. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue-engineered+arterial+grafts%3A+long-term+results+after+implantation+in+a+small+animal+model%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pediatric+Surgery%22%5BJournal%5D)">Tissue-engineered arterial grafts: long-term results after implantation in a small animal model.</a> Journal of Pediatric Surgery. 44, 1127-1133 (2009).</li>
<li>Lee, Y. U., Naito, Y., Kurobe, H., Breuer, C. K., Humphrey, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biaxial+mechanical+properties+of+the+inferior+vena+cava+in+C57BL%2F6+and+CB-17+SCID%2Fbg+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomechanics%22%5BJournal%5D)">Biaxial mechanical properties of the inferior vena cava in C57BL/6 and CB-17 SCID/bg mice.</a> Journal of Biomechanics. 46, 2277-2282 (2013).</li>
</ol>

&#160;作者&#160;无任何利益冲突需要披露。

TEVG 的小鼠模型是研究新生组织形成及狭窄发生过程中细胞与分子机制的有力工具。组织学和扫描电镜图像均显示，骨髓单个核细胞（BM-MNC）已成功接种于移植物表面11。此外，通过DNA检测也证实了细胞接种效率7。利用该模型系统，我们发现细胞接种可降低TEVG狭窄的发生率，而狭窄正是我们在前期人体临床试验中观察到的主要失败模式3。接种的细胞在TEVG中迅速消失，提示其作用可能通过旁分泌机制实现8,12。研究还表明，新生血管的形成为一种免疫介导的再生过程，新生血管由邻近血管壁的血管细胞（内皮细胞EC和血管平滑肌细胞SMC）沿支架腔面内向生长而形成。此外，正常程度的巨噬细胞浸润对血管新生组织的形成至关重要，但若该过程过度，则会导致TEVG狭窄的发生7,8。这些结果表明，该小鼠模型与人类疾病具有高度相关性。该显微外科技术还可推广应用于其他血管场景，包括动脉移植物13以及动静脉瘘的建立。
我们每年进行超过1,000例下腔静脉搭桥移植手术，死亡率低于1%。为了成功实...

先天性心脏病是严重影响美国近8%活产婴儿的严重疾病。大约25%的先天性心脏病患儿（即每1,000例活产婴儿中有2.4例）在出生后第一年内需要接受侵入性治疗1。目前治疗先天性心脏病最有效的方法是重建手术。然而，由于现有血管通路装置使用过程中引发的并发症，是导致术后发病率和死亡率的最主要原因。
为解决这一问题，我们开发了首个用于临床的组织工程血管移植物（TEVGs）2。TEVGs由可生物降解的聚酯管支架接种自体骨髓来源的单个核细胞（BM-MNCs）构建而成，并作为静脉通路应用于先天性心脏病手术中。随访1至3年的结果显示通畅率良好，但狭窄的发生率仍较显著3,4。显然，迫切需要更深入地理解血管新生组织的形成过程以及TEVG狭窄发生的机制。为了进一步阐明TEVG的发展过程及其狭窄形成的机制，研究人员建立了绵羊模型5,6。在该模型中，TEVG成功转化为具有活性的血管，其形态和功能均与天然静脉相似。这种大动物模型的使用为TEVG的临床应用提供了重要的临床前信息，是迈向实际应用的良好第一步。然而，由于缺乏针对该物种的特异性分子工具，利用大动物模型对TEVG中血管新生组织形成的细胞与分子机制进行全面研究仍受到限制。为克服这些局限性，研究人员开发了小鼠TEVG模型，得益于小鼠遗传学的快速发展、丰富的分子表征手段以及更短的实验周期等优势。
小鼠下腔静脉移植模型真实再现了在大型动物和人类中发生的新血管形成过程，但所需时间显著缩短6-9。本文详细描述了使用可生物降解支架进行小规模移植物制备、骨髓单个核细胞（BM-MNC）的获取与分离、BM-MNC在支架上的接种，以及在小鼠模型中移植移植物的完整实验方案。

<table><tbody><tr><td>聚乙醇酸（PGA）毛毡</td><td>Biomedical Structures</td><td></td><td>定制订购</td></tr><tr><td>移液器吸头，0.1–10 &amp;mu;l&amp;nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-707-456</td><td></td></tr><tr><td>冷冻干燥机&amp;nbsp;</td><td>Labconco</td><td>7070020</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 培养基</td><td>Gibco</td><td>11875-093</td><td></td></tr><tr><td>培养皿</td><td>BD</td><td>353003</td><td></td></tr><tr><td>24 孔板</td><td>Corning</td><td>3526</td><td></td></tr><tr><td>15 cc 离心管&amp;nbsp;</td><td>BD</td><td>352096</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll</td><td>Sigma</td><td>10831-100ml</td><td>又称“Histopaque”</td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Gibco</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>Littauer 骨剪，4.5&quot; 直型</td><td>Roboz</td><td>RS-8480</td><td>用于骨髓采集</td></tr><tr><td>镊子，4.5&quot;</td><td>Roboz</td><td>RS-8120</td><td>用于骨髓采集</td></tr><tr><td>剪刀，4.5&quot;</td><td>Roboz</td><td>RS-5912</td><td>用于骨髓采集</td></tr><tr><td>显微镜</td><td>Leica</td><td>M80</td><td></td></tr><tr><td>C57BL/6J (H-2b)，雌性</td><td>Jackson Laboratories</td><td>664</td><td>8–12 周龄</td></tr><tr><td>盐酸氯胺酮注射液</td><td>Hospira Inc.</td><td>NDC 0409-2053</td><td></td></tr><tr><td>无菌赛拉嗪溶液</td><td>Akorn Inc.</td><td>NADA# 139-236</td><td></td></tr><tr><td>酮洛芬</td><td>Fort Dodge Animal Health</td><td>NDC 0856-4396-01</td><td></td></tr><tr><td>布洛芬</td><td>PrecisionDose</td><td>NDC 68094-494-59</td><td></td></tr><tr><td>肝素钠</td><td>Sagent Pharmaceuticals</td><td>NDC 25021-400</td><td></td></tr><tr><td>生理盐水溶液（无菌 0.9% 氯化钠）</td><td>Hospira Inc.</td><td>NDC 0409-0138-22</td><td></td></tr><tr><td>0.9% 氯化钠注射液</td><td>Hospira Inc.</td><td>NDC 0409-4888-10</td><td></td></tr><tr><td>凡士林眼膏</td><td>Dechra Veterinary Products</td><td>NDC 17033-211-38</td><td></td></tr><tr><td>碘伏消毒片</td><td>Triad Disposables, Inc.</td><td>NDC 50730-3201-1</td><td></td></tr><tr><td>酒精消毒片</td><td>McKesson Corp.</td><td>NDC 68599-5805-1</td><td></td></tr><tr><td>棉签</td><td>Fisher Scientific</td><td>23-400-118</td><td></td></tr><tr><td>精细剪刀</td><td>FST</td><td>14028-10</td><td></td></tr><tr><td>微型 Adson 镊</td><td>FST</td><td>11018-12</td><td></td></tr><tr><td>持夹镊</td><td>FST</td><td>00072-14</td><td></td></tr><tr><td>S&amp;amp;T 血管夹</td><td>FST</td><td>00396-01</td><td></td></tr><tr><td>弹簧剪刀</td><td>FST</td><td>15008-08</td><td></td></tr><tr><td>Colibri 牵开器</td><td>FST</td><td>17000-04</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 镊子</td><td>FST</td><td>11251-20</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #7 — 精细镊</td><td>FST</td><td>11274-20</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5/45 镊子</td><td>FST</td><td>11251-35</td><td></td></tr><tr><td>Tish 缝合针持/镊子</td><td>Micrins</td><td>MI1540</td><td></td></tr><tr><td>黑色聚酰胺单丝缝线，10-0</td><td>AROSurgical Instruments Corporation</td><td>TI638402</td><td>用于移植物缝合</td></tr><tr><td>黑色聚酰胺单丝缝线，6-0</td><td>AROSurgical Instruments</td><td>SN-1956</td><td>用于肌肉和皮肤闭合</td></tr><tr><td>无纺布海绵</td><td>McKesson Corp.</td><td>94442000</td><td></td></tr><tr><td>可吸收止血剂</td><td>Ethicon</td><td>1961</td><td></td></tr><tr><td>1 ml 注射器</td><td>BD</td><td>309659</td><td></td></tr><tr><td>3 ml 注射器</td><td>BD</td><td>309657</td><td></td></tr><tr><td>10 ml 注射器</td><td>BD</td><td>309604</td><td></td></tr><tr><td>18 G 1.5 英寸针头</td><td>BD</td><td>305190</td><td></td></tr><tr><td>25 G 1 英寸针头</td><td>BD</td><td>305125</td><td></td></tr><tr><td>30 G 1 英寸针头</td><td>BD</td><td>305106</td><td></td></tr><tr><td>循环温水仪</td><td>Gaymar</td><td>TP-700</td><td></td></tr><tr><td>加热垫</td><td>Gaymar</td><td>TP-22G</td><td></td></tr><tr><td>修剪器</td><td>Wahl</td><td>9854-500</td><td></td></tr></tbody></table>

小鼠模型中下腔静脉移植旁路移植物的植入

Implantation of Inferior Vena Cava Interposition Graft in Mouse Model

接种骨髓单个核细胞（BMCs）的可生物降解支架常用于重建手术，以治疗先天性心脏畸形。长期临床结果显示通畅率良好，但仍有显著的狭窄发生率。为了研究组织工程血管移植物（TEVGs）中新生组织形成的细胞与分子机制，并预防狭窄的发生，我们建立了一种内径约为1 mm的小鼠移植物模型。首先，TEVGs由可生物降解的管状支架组装而成，该支架由聚乙醇酸无纺毡网制成，并涂覆ε-己内酯与L-丙交酯共聚物。将支架置于冷冻干燥机中，真空处理24小时，随后储存在干燥器中，直至接种细胞。其次，从小鼠供体中采集骨髓，并通过密度梯度离心法分离单个核细胞。第三步，将约一百万个细胞接种于支架上，并过夜孵育。最后，将接种细胞的支架作为肾下腔静脉移植段植入C57BL/6小鼠体内。植入的移植物表现出极佳的通畅性（&#62;90%），未见血栓栓塞并发症或动脉瘤形成的证据。该小鼠模型将有助于我们理解并量化TEVG中新生组织形成的细胞与分子机制。

TEVG移植的示意图见图1。从供体小鼠中采集骨髓，通过密度梯度离心法分离单个核细胞，并将其接种至可生物降解的支架上。接种后的支架在O/N条件下孵育，随后作为下腔静脉置换移植物植入受体小鼠体内。
图2展示了PGA-P(CL/LA)支架的扫描电子显微镜图像。其内径约为1 mm，壁厚约为0.17 mm。总孔隙率为78.5%，平均孔径为45.4 ± 17.6 µm。
C57BL/6 小鼠下腔静脉中植入的组织工程血管移植物的大体图像如图所示 图3植入后立即（A）以及植入后2周（B). (C显示了原生下腔静脉的大体图像作为对比。显然，移植物已被新生组织填充，但仍保持了原始移植物的形态。我们之前的结果表明，移植物完全降解需要长达12周的时间10. 
植入2周后组织...

为了增进对细胞和分子水平新生组织形成机制的理解，近期开发了一种小鼠组织工程血管（TEVG）模型。该移植物被植入C57BL/6小鼠的肾下腔静脉作为置换移植物。此模型所获得的结果与临床研究中的结果相似，但所需时间显著缩短。

接种骨髓单个核细胞（BMCs）的可生物降解支架常用于重建手术，以治疗先天性心脏畸形。

本实验的总体目标是研究组织工程血管移植物中新生组织形成及狭窄发展的细胞与分子机制。首先，通过将聚乙醇酸无纺毡网与ε-己内酯和L-丙交酯共聚物包被，制备可生物降解的管状支架。接下来的步骤是采集骨髓，并通过密度梯度离心法分离单个核细胞。然后将约100万个细胞接种于支架上，并过夜培养。最后一步是将接种细胞的支架作为下腔静脉置换移植物进行植入。最终，可通过免疫组织化学检测显示组织工程血管移植物中的细胞浸润和细胞外基质沉积。该技术的意义在于更好地理解导致狭窄以及组织工程血管移植物形成的原因，然后利用这些信息设计出更优的组织工程血管移植物。在我们的临床研究中发现，接受组织工程导管的患者中近四分之一出现了管腔狭窄。我们的目标是消除这一问题。尽管该方法可应用于先天性心脏病，也可应用于结肠旁路手术或用于改变静脉特征的导管。通常，由于静脉渗透过程中需要精细的显微外科技术，初学者在使用该方法时会遇到困难。当我们寻求更优方法以表征组织工程血管移植物中新生组织的形成，并探索预防狭窄发生的方法时，首次提出了该技术思路，这些移植物被用于我们的人体临床试验。首先开始混合己内酯和L-丙交酯共聚物。完全溶解需要60至90分钟。在此期间，从冰箱中取出一片聚乙醇酸，从中裁剪出数个5毫米×8毫米的片段。接下来，将10微升移液器吸头的滤芯剪下，并在其远端插入一根19号针头。使用镊子将一块聚乙醇酸毡包裹在针头周围，然后用钝化的18号针头小心地将毡推入移液器吸头的远端，使其围绕在19号针头周围。当共聚物溶液准备好后，取40微升加入移液枪头顶部，使聚乙醇酸毡充分浸透溶液。用移液器将气泡推出，直至所有气泡完全排除。将所有制备好的移植物转移至50毫升离心管中，针头朝下放置，于-80摄氏度冷冻20分钟。然后在真空条件下将移植物冻干24小时。第二天打开管盖后，将移植物从针上分离。剪去移植物两端，获得一段完整的4至5毫米的移植物。然后将这些移植物重新套回针头，以保持其形状。在接种细胞的前一晚，将移植物存放在干燥器中。将其置于生物安全柜内的紫外光下，该移植物来自安乐死的小鼠。将所有股骨和胫骨收集到一个培养皿中，加入10毫升RPMI，剪去每根骨的两端。在第二个培养皿中，使用25号针头向所有骨中注射RPMI，以冲洗出骨髓。总共使用3毫升RPMI。将RPMI中的所有骨髓收集到一个15毫升离心管中，并用额外的2毫升RPMI冲洗培养皿，使总体积达到5毫升。计数此收集物中的细胞。接下来，取5毫升Ficoll加入一个15毫升离心管中，然后缓慢加入5毫升骨髓。加入RPMI后，将离心管在24摄氏度下以528 ×g离心30分钟，离心时关闭刹车。收集管中的中间层，其中含有单个核细胞。用PBS将该层液体按1:1比例稀释。将细胞悬液离心，沉淀用5毫升PBS重悬，再次离心。将细胞沉淀重悬于约200微升RPMI培养基中，重复计数两次。使用平均值将细

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