Name: 原代大鼠乳鼠心肌细胞的活细胞成像继腺病毒和慢病毒转导利用共聚焦旋转盘显微镜 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-06-24T14:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 36 s
Description: 学习利用共聚焦旋转盘显微镜对大鼠原代乳鼠心肌细胞进行腺病毒和慢病毒转导后的活细胞成像技术。该方法可实时观察EGFP标记蛋白在活细胞中的动态分布，为心血管研究提供重要工具。

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我们感谢 Alengo Nyamay'antu 博士和 Ilse Timmerman 博士在慢病毒包装方面的建议。本研究由美国心脏协会科学家发展资助项目（10SDG4170137）提供支持。

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作者无任何利益冲突需要披露。

从新生大鼠分离的原代心肌细胞长期以来被用于研究心肌细胞功能 体外本方案描述了一种采用两步酶消化法从新生大鼠幼崽中分离心肌细胞的方法，首先在4 °C条件下用胰蛋白酶过夜消化，随后使用纯化的胶原酶进行消化。采用纯化胶原酶步骤的一个优势在于，所有分离实验均使用同一级别的酶，从而确保每次实验所获得细胞的质量和数量具有一致性。
鉴于腺病毒具有较高的转导效率，如果特定实验需要对细胞培养物实现高效转导，则最好使用腺病毒。然而，如果不需要高水平的转导，可以使用慢病毒载体。能够选择使用腺病毒或慢病毒载体，有助于针对不同类型的基因实现适当的转导和表达水平。如果在慢病毒转导后，通过共聚焦旋转盘显微镜进行活细胞成像或免疫细胞化学（ICC）检测到的荧光强度非常低，更换为另一种使用不同启动子表达目的基因的慢病毒转移载体可能解决此问题。对于腺病毒载体，如果腺病毒转导后通过蛋白质印迹（WB）检测到的条带较弱，可能表明病毒原液滴度较低。在此情况下，最好在继续实验前通过细胞扩增制备更高滴度的腺病毒溶液。
该技术的一个局限性在于，即使使用纯化的胶...

原代新生大鼠心肌细胞长期以来被用于体外研究心肌细胞功能in vitro1。可通过多种成熟的方法从小鼠幼崽中轻松分离这些细胞2-4。最常用的方法是使用胶原酶或胰蛋白酶在细胞分离前消化心脏的结缔组织。研究人员还开发了从成年啮齿类动物5-8以及新生小鼠9,10中分离心肌细胞的方法。
本方案描述了一种从新生大鼠幼崽中分离心肌细胞的方法，采用两步酶消化法。首先在4 °C条件下使用胰蛋白酶过夜消化，随后在37 °C条件下使用纯化的胶原酶进行消化。与在温热酶溶液中进行连续孵育的方法相比，在4 °C条件下用胰蛋白酶过夜孵育心脏组织&#160;可减少收获细胞所需的步骤2。此外，通过使用纯化的胶原酶而非粗制酶制剂，可消除批间差异，从而提高实验的可重复性。
对特定蛋白质的功能研究通常采用腺病毒11-13和/或慢病毒14-16表达系统。[注意事项] 病毒的制备与操作应遵循美国国立卫生研究院（NIH）的指导原则。
腺病毒不会整合到宿主基因组中。它在大多数细胞类型中都具有很高的转导效率，包括分裂细胞和非分裂细胞，以及原代细胞和已建立的细胞系。这使得腺病毒成为基因表达的可靠载体。在转导后48小时内，腺病毒载体编码的蛋白水平即可达到较高水平，并可持续数周17。然而，使用腺病毒进行蛋白表达的一个缺点是，构建重组腺病毒的过程既复杂又耗时。这一缺点部分解释了为何许多研究人员已转向使用慢病毒进行重组基因表达。与腺病毒载体不同，构建慢病毒载体快速且简便。尽管慢病毒在分裂细胞和非分裂细胞中的转导效率通常低于腺病毒，但它们能够整合到宿主基因组中。因此，慢病毒介导的转导基因表达比腺病毒更稳定。
由于显微技术的进步，现在更容易获取表达重组蛋白的活细胞图像，即使在视频采集速率下也能实现。这使得研究人员能够实时确定目标蛋白的特定改变对细胞功能的影响。共聚焦转盘显微镜具有多个关键特性，使其成为活细胞成像的理想技术18,19。Yokogawa 转盘可实现更快的图像采集速度，同时相比点扫描共聚焦显微镜所需激光功率显著降低。这两种优势均源于转盘结构，该转盘上分布有大量共聚焦小孔，激光可同时穿过这些小孔照射到样品上。在图像采集过程中，转盘本身持续高速旋转18-20。通过使用显微镜的自动对焦系统，可在长时间内保持稳定的焦距，从而使研究人员能够获得清晰对焦的活细胞图像。所采集的图像可回放为视频文件，并利用 ImageJ21,22、FIJI23 或其他商业图像分析软件进行分析。

<table><tbody><tr><td>1 用于断头的剪刀</td><td>WPI</td><td>501749</td><td>使用前请高压灭菌</td></tr><tr><td>1 用于心脏分离和切碎的精细剪刀</td><td>WPI</td><td>14393</td><td>使用前需高压灭菌</td></tr><tr><td>2 把精细镊子（Dumont No. 5）</td><td>Sigma</td><td>F6521</td><td>使用前需高压灭菌</td></tr><tr><td>3 个无菌的 10 cm 塑料培养皿</td><td>Sigma</td><td>CLS430165</td><td>用于心脏分离</td></tr><tr><td>3.5 cm 玻璃底培养皿</td><td>MatTek</td><td>P35G-1.5-20-C</td><td>用于心肌细胞的最终铺板，以便后续活细胞成像。ibidi品牌的Micro-Dishes可作为可接受的替代产品。</td></tr><tr><td>3.5 cm 玻璃底培养皿</td><td>MatTek</td><td>P35G-0.17-14-C</td><td>用于TIRF或高分辨率成像</td></tr><tr><td>70% (v/v) 乙醇水溶液</td><td>Sigma</td><td>E7148</td><td></td></tr><tr><td>2% 明胶</td><td>Sigma</td><td>G1393</td><td></td></tr><tr><td>1 个无菌 10 cm 塑料培养皿</td><td>Sigma</td><td>CLS430165</td><td>用于胰蛋白酶消化</td></tr><tr><td>铝箔</td><td>任何品牌</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Sigma</td><td>P7543</td><td></td></tr><tr><td>两个10 cm塑料细胞培养皿</td><td>Sigma</td><td>CLS430165</td><td>用于筛选</td></tr><tr><td>自动移液器</td><td>Drummond Scientific</td><td>4-000-300</td><td>用于吹打</td></tr><tr><td>细胞计数仪</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cellometer，自动细胞计数仪</td><td>nexcelom</td><td></td><td>检测并计数细胞</td></tr><tr><td>显微镜和血细胞计数板</td><td>任何品牌</td><td></td><td>检测并计数细胞</td></tr><tr><td>0.4% 台盼蓝溶液</td><td>invitrogen</td><td>15250-061</td><td></td></tr><tr><td>CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; 培养箱</td><td>Sanyo</td><td>MCO-19AIC</td><td></td></tr><tr><td>旋转振荡培养箱</td><td>Sigma</td><td>Z673129</td><td>37℃下用胶原酶振荡心脏组织 &amp;deg;170-200 转/分钟，C</td></tr><tr><td>10 mg/ml BrdU 溶液</td><td>BD Pharmingen</td><td>550891</td><td></td></tr><tr><td>DMEM，高糖</td><td>invitrogen</td><td>41965039</td><td>按照方案中指示混合培养基，并在使用前预热</td></tr><tr><td>MEM</td><td>invitrogen</td><td>31095029</td><td>根据方案指示混合培养基，并在使用前预热</td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>invitrogen</td><td>26140079</td><td></td></tr><tr><td>青霉素-链霉素（10,000 U/ml）&amp;nbsp;</td><td>invitrogen</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>第2节 慢病毒转导</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>3 种包装质粒</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>pMDLg/pRRE</td><td>Addgene</td><td>12251</td><td></td></tr><tr><td>pRSV-Rev</td><td>Addgene</td><td>12253</td><td></td></tr><tr><td>pMD2.G</td><td>Addgene</td><td>12259</td><td></td></tr><tr><td>慢病毒转移载体 pLVX-IRES-Puro</td><td>Clontech</td><td>632183</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM（无血清培养基）</td><td>invitrogen</td><td>31985070</td><td></td></tr><tr><td>转染试剂</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>聚乙烯亚胺&amp;ldquo;Max&amp;rdquo;，（分子量 40,000）— 高效线性聚乙烯亚胺（相当于游离碱形式下分子量 25,000）&amp;nbsp;</td><td>Polysciences</td><td>24765-2</td><td>可替换为罗氏的X-tremeGENE 9</td></tr><tr><td>X-tremeGENE 9</td><td>罗氏</td><td>6365779001</td><td>转染试剂中替代PEI的方法</td></tr><tr><td>氯喹</td><td>Sigma</td><td>C6628</td><td>溶于水，配制100 mM储存液。通过10–100 mM处理可抑制内体酸化。 &amp;mu;M 氯喹</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>10 ml 鲁尔锁型注射器，已灭菌</td><td>BD</td><td>309604</td><td></td></tr><tr><td>0.45 &amp;mu;m 滤膜</td><td>Sigma</td><td>F8677</td><td>仅使用醋酸纤维素或聚醚砜（PES）（低蛋白结合）滤膜。请勿使用硝酸纤维素滤膜，因为硝酸纤维素会结合慢病毒包膜表面的蛋白质，从而破坏病毒。</td></tr><tr><td>六亚甲基溴化物</td><td>Sigma</td><td>H9268</td><td>溶于水，配制成8 mg/ml的储备液，然后过滤除菌。</td></tr><tr><td>聚乙二醇 6,000</td><td>Sigma</td><td>81260</td><td></td></tr><tr><td>氯化钠</td><td>Sigma</td><td>S9888</td><td></td></tr><tr><td>氢氧化钠</td><td>Sigma</td><td>S5881</td><td></td></tr><tr><td>第3节 腺病毒转导</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>HEK 293T 细胞</td><td>ATCC</td><td>CRL-11268</td><td></td></tr><tr><td>若干个10 cm细胞培养皿</td><td>Sigma</td><td>CLS430165</td><td></td></tr><tr><td>96孔微孔板，带盖，平底，组织培养用，无菌</td><td>BD Falcon</td><td>353072</td><td>用于滴定</td></tr><tr><td>多通道移液器，10-100 &amp;mu;l，8通道</td><td>Eppendorf</td><td>3122 000.035</td><td></td></tr><tr><td>第4节 活细胞成像</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>转盘共聚焦显微镜</td><td>PerkinElmer</td><td>L7267000</td><td></td></tr><tr><td>一个温度可控的腔室</td><td>任何品牌</td><td></td><td>保持温度在 37 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>一氧化碳&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; 环境系统</td><td>任何品牌</td><td></td><td>可选，用于维持 CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; 浓度最佳</td></tr><tr><td>CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; 不含谷氨酰胺的独立培养基</td><td>invitrogen</td><td>18045-054&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>长时间延时成像</td></tr><tr><td>DMEM，高糖，HEPES，无酚红</td><td>invitrogen</td><td>21063-029</td><td>长时间延时成像</td></tr></tbody></table>

使用共聚焦旋转盘显微镜对腺病毒和慢病毒感染后的大鼠原代新生心肌细胞进行活细胞成像

Live Cell Imaging of Primary Rat Neonatal Cardiomyocytes Following Adenoviral and Lentiviral Transduction Using Confocal Spinning Disk Microscopy

原代新生大鼠心肌细胞在基础研究中具有重要应用价值 体外 心血管研究中，原代新生大鼠心肌细胞因其可在单次操作中大量分离而被广泛应用。随着显微镜技术的进步，研究人员能够以较低光毒性风险实时捕获活细胞图像，便于动态观察细胞事件。本实验方案描述了在利用慢病毒和腺病毒转导以调控细胞特性的基础上，使用共聚焦转盘显微镜对原代新生大鼠心肌细胞进行活细胞延时成像的方法。采用两种不同类型的病毒有助于实现两个不同基因的适宜转导效率与表达水平。借助显微镜的自动对焦系统，可在长时间内维持稳定的焦平面，从而获得清晰聚焦的活细胞图像。应用该方法可分析在培养的原代细胞中外源性表达的工程化蛋白的功能。此外，该系统也可用于通过siRNA或化学调节剂研究基因功能。

为了演示该技术，使用编码EGFP（增强型绿色荧光蛋白）标记的Cx43（连接蛋白43）或突变型Cx4332的慢病毒在细胞中表达EGFP标记的蛋白，同时使用编码FGFR1DN（成纤维细胞生长因子受体1显性负性突变体）的腺病毒来抑制细胞内的FGF信号通路33-35。在心肌细胞分离后的第3天，将分离的心肌细胞用慢病毒感染，以在细胞中表达EGFP标记的蛋白。慢病毒感染3天后，再用编码FGFR1DN的腺病毒进一步感染分离的心肌细胞，以消除细胞内的FGF信号。在给予足够时间使细胞表达被转导的外源基因后，采用共聚焦转盘显微镜采集活细胞图像。所获得的图像以视频文件形式回放，并使用图像分析软件进行分析。更多详细的代表性结果请参见Sakurai et al32。
慢病毒感染后72小时，通过共聚焦转盘显微镜确认了EGFP标记蛋白的表达图1A-B。腺病毒感染24小时后，通过WB和ICC验证了FGFR1DN的表达图1C-D。将腺病毒加入3.5 cm培养皿的时间...

本方案描述了一种利用慢病毒和腺病毒转导后，通过共聚焦转盘显微镜对原代大鼠新生心肌细胞进行活细胞成像的方法。该方法可实现对活体心肌细胞中细胞过程的详细观察。

原代新生大鼠心肌细胞在基础体外心血管研究中具有重要价值，因为可在单次操作中轻松分离获得大量细胞……

本实验的总体目标是利用共聚焦转盘显微镜，获取经慢病毒和腺病毒感染后的大鼠原代新生心肌细胞的延时成像图像。首先从新生大鼠幼崽中分离心肌细胞，并将其接种于玻璃底培养皿中。接下来，使用慢病毒对心肌细胞进行Connexin 43-EGFP标记蛋白的转导，随后使用腺病毒对心肌细胞进行显性负性fgfr1的转导。最后一步是使用共聚焦转盘显微镜采集延时图像。最终，可以通过回放所采集的延时图像获得一段视频，该视频展示了在腺病毒表达的显性负性fgfr1蛋白诱导的细胞条件改变下，慢病毒基因表达的EGFP标记蛋白在活体原代心肌细胞中的分布情况。该技术的主要优势之一在于，可利用旋转盘共聚焦显微镜，在腺病毒介导或随后建立的转染所诱导的基因表达条件下，对活细胞进行延时成像。因此，该方法有助于深入理解右心室新生大鼠心肌细胞的生物学特性。此外，该方法还可应用于其他系统，如原代小鼠、新生心肌细胞、原代右心室小鼠心肌细胞、成年心肌细胞以及其他培养细胞。通常，刚接触显微镜的人员由于载物台随时间发生轻微漂移，难以获得清晰对焦的图像。通过使用仪器的自动对焦功能，可以保持稳定的焦点，从而使研究人员更轻松地获取清晰对焦的图像。本实验所用的新生心肌细胞是从出生后一至两天的大鼠幼崽中分离得到的。使用无菌器械尽快从安乐死的动物体内取出跳动的心脏，并将心脏放入含有30毫升冰预冷的C-M-F-H-B-S-S的50毫升锥形管中。通常为拍摄目的收集总共10个心脏，分装于两个50毫升锥形管中，每管含5个心脏及30毫升冰预冷的C-M-F-H-B-S-S；若仅用于拍摄，可收集2至3个心脏。轻轻涡旋离心管以冲洗心脏。所有操作均应在冰上并在超净工作台中进行。此后，弃去上清液，将心脏转移至冰上一个新的无菌10厘米塑料培养皿中。注意不要用吸管吸取心脏。去除心脏上的大血管和不需要的组织。向培养皿中加入10毫升冰预冷的C-M-F-H-B-S-S溶液以冲洗心脏。接下来，将所有心脏转移至冰上一个新的灭菌10厘米塑料培养皿中。用剪刀将心脏组织剪碎至小于1立方毫米。向剪碎的心脏组织中加入9毫升预冷的C-M-F-H-B-S-S溶液。加入一毫升冰冷的胰蛋白酶。用 C-M-F-H-B-S-S 重悬。用多聚甲醛密封培养皿。用铝箔覆盖，于冷室中过夜。次日，将所有含缓冲液的心脏组织转移至冰上的 50 毫升锥形管中。在 C-M-F-H-B-S-S 中加入 1 毫升胰蛋白酶抑制剂。盖紧 50 毫升锥形管的盖子，以防污染。将试管置于37摄氏度培养箱中孵育约30分钟，使组织和缓冲液温度升至30至37摄氏度。随后，加入5毫升胶原酶溶于Leibovitz L-15培养基中，在37摄氏度下孵育45分钟，并在45分钟后轻轻振荡。使用移液器以每秒3毫升的速度反复吹打组织20次进行组织解离。静置组织残渣三分钟，使残渣沉淀，然后用70微米细胞滤筛过滤上清液。向剩余的组织团块中加

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科研

JoVE Journal

Biology

生物学

原代大鼠乳鼠心肌细胞的活细胞成像继腺病毒和慢病毒转导利用共聚焦旋转盘显微镜

成年心肌细胞是从动物心脏中分离并可培养数天的原代细胞。在此培养期间，可利用腺病毒基因转导表达基因编码的生物传感器（GEBs）或荧光融合蛋白。这两种方法均可通过共聚焦显微镜进行细胞水平的研究。...

成年心肌细胞的分离与遗传操作用于共聚焦成像

在此，我们开发了所需的工具 离体...

ex vivo 活体成像小鼠神经上皮中的单细胞分裂

原代小鼠心肌细胞培养是研究肌原纤维结构与功能的关键工具之一。以下方案描述了从新生小鼠心脏中分离和培养原代心肌细胞的步骤。所获得的心肌细胞培养物可进一步用于多种生物力学、生物化学及细胞生物学检测。...

新生小鼠心肌细胞的分离与培养

新生大鼠心肌细胞的分离是一项耗时且结果难以预测的操作。本研究介绍了一种新生大鼠心肌细胞的冷冻保存与复苏方法，可更高效地利用细胞。复苏后的新生大鼠心肌细胞可用于多种实验，无需每次实验都进行细胞分离。...

新生大鼠心肌细胞的分离与冷冻保存

本方案描述了一种可重复地分离成年小鼠心肌细胞并进行长期培养的逐步操作方法，具有较高的得率、纯度和细胞活性。...

成年小鼠心肌细胞的分离、培养与转导

我们介绍一种用于对完整胚胎期和出生后心脏内部标记有荧光蛋白的细胞进行三维成像的实验方案。通过结合组织透明化方法与整体染色技术，可清晰、准确地成像胚胎期或出生后心脏内部的单个荧光蛋白标记细胞。...

单细胞分辨率下透明化胚胎及出生后心脏的成像

为了区分心肌细胞的细胞分裂与细胞周期变化，我们提供了使用两种转基因小鼠品系的实验方案：Myh6-H2B-mCh 转基因小鼠，用于明确鉴定心肌细胞的细胞核；以及 CAG-eGFP-anillin...

出生后心肌细胞细胞周期变异的可视化及核形成确定

本论文描述了一种利用逆转录病毒介导的Gata4、Hand2、Mef2c和Tbx5递送方法，逐步生成并定量多种重编程心脏亚型的实验方案。...

通过转录因子介导的重编程评估小鼠胚胎成纤维细胞来源的心肌细胞亚型

本文介绍了一种用于成年小鼠和大鼠心肌细胞的分离、转染及长期培养的实验方案。...

成年小鼠和大鼠心肌细胞的分离、转染及长期培养

本文介绍了一种利用延时共聚焦显微镜研究出生后小鼠视网膜外植体中神经突形态发生的方法。我们描述了一种稀疏标记和获取视网膜细胞类型及其细微突起的技术，该技术采用表达膜定位荧光蛋白的重组腺相关病毒载体，并以Cre依赖的方式实现特异性标记。...

利用稀疏腺相关病毒标记遗传靶向的视网膜细胞群体进行神经元分支的延时成像

本文介绍了一组通过检测分离大鼠心肌细胞的肌节长度并结合钙离子（Ca2+）瞬变测量来评估收缩功能的实验方案。同时包含了该方法在心力衰竭动物模型研究中的应用。...

啮齿类动物心肌细胞收缩功能障碍与Ca2+瞬变的分析

学习利用共聚焦旋转盘显微镜对大鼠原代乳鼠心肌细胞进行腺病毒和慢病毒转导后的活细胞成像技术。该方法可实时观察EGFP标记蛋白在活细胞中的动态分布，为心血管研究提供重要工具。

使用共聚焦旋转盘显微镜对腺病毒和慢病毒感染后的大鼠原代新生心肌细胞进行活细胞成像

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