Name: 肺动脉瓣使用异位心脏移植小鼠模型移植 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-07-23T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 56 s
Description: 了解利用小鼠异位心脏移植模型研究组织工程心脏瓣膜的新组织形成与狭窄机制。该方法通过高频超声监测血流，为心血管生物学和瓣膜工程研究提供重要分子机制见解。

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本研究部分由美国国立卫生研究院（NIH）资助（项目编号：RO1 HL098228），资助对象为 CKB。

注意：所有动物实验程序均已通过 Nationwide Children’s Hospital 机构动物护理与使用委员会的批准。
1. 从小鼠心脏瓣膜供体中获取肺动脉瓣
<ol>
	<li>手术前对所有手术器械进行高压灭菌：精细剪刀1把、显微镊子3把、显微血管夹2个、持夹钳1把、显微持针器1把、弹簧剪刀1把、牵开器1把。</li>
	<li>采用6至8周龄雌性C57BL/6小鼠作为肺动脉瓣供体。将小鼠从笼中取出并称重，随后通过腹腔注射过量的氯胺酮/赛拉嗪混合物（氯胺酮200 mg/kg，赛拉嗪20 mg/kg）实施安乐死。</li>
	<li>剪除胸部毛发，将小鼠仰卧位固定于垫上，随后进行开胸手术。暴露心脏，在右心房做一小切口，并用冰冻生理盐水灌注左心室。</li>
	<li>钝性分离肺动脉（PA）与升主动脉。连同2 mm肺动脉袖段一并切除肺动脉瓣（PV）。其余心脏组织弃去。</li>
	<li>将肺动脉瓣置于含肝素的冷生理盐水溶液（100 单位/ml）中保存。注意：肺动脉瓣可在移植前在此溶液中保存最多两小时。</li>
</ol>
2. 供体心脏的制备
<ol>
	<li>选用一只6-8周龄的雌性C57BL/6小鼠作为心脏供体。将小鼠从笼中取出并称重，随后通过腹腔注射过量的氯胺酮/赛拉嗪混合物（氯胺酮200 mg/kg，赛拉嗪20 mg/kg）实施安乐死。此为终末性操作。&#160;</li>
	<li>剪除胸部毛发，将小鼠仰卧位固定于垫上，随后进行开胸术。钝性分离心脏、下腔静脉（IVC）、上腔静脉（SVC）、升主动脉、肺动脉（PA）和肺静脉。用冰冻无菌生理盐水经下腔静脉灌注心脏。</li>
	<li>使用6-0丝线结扎下腔静脉、上腔静脉和肺静脉，然后在结扎线近心端剪断。</li>
	<li>连同2 mm袖状组织一并剪下主动脉和肺动脉。</li>
	<li>切除肺静脉组织并妥善弃置。</li>
</ol>
3. 心脏瓣膜移植到供体心脏上
<ol>
	<li>在步骤 2.5 结束后，立即将步骤 1.5 中的心脏瓣膜&#160;放入供体心脏中，并调整瓣膜的方向。</li>
	<li>使用带锥形针的 10-0 单丝缝线，在瓣膜右侧对肺动脉瓣（PV）进行一针固定，然后从 PV 的另一侧开始连续缝合，缝合 5-6 针。</li>
	<li>完成前侧缝合后，将心脏水平旋转，开始将 PV 的后侧缝合至供体心脏。</li>
	<li>将心脏保存在冷的无菌&#160;肝素/生理盐水溶液中。注意：供体心脏在植入受体小鼠前可在该溶液中保存两小时。</li>
</ol>
4. 小鼠异位心脏移植
<ol>
	<li>选用一只6-8周龄的雌性C57BL/6小鼠作为受体。将小鼠从笼中取出并称重，随后使用氯胺酮/赛拉嗪混合物进行麻醉（氯胺酮100 mg/kg，赛拉嗪10 mg/kg）。术前使用酮洛芬（5 mg/kg）作为镇痛剂。</li>
	<li>通过夹捏尾部检查镇静程度后，剪除腹部和胸部的毛发。用无菌眼科软膏润滑眼睛，将小鼠仰卧位固定于垫子上。使用聚维酮碘和酒精棉片对腹部进行消毒，然后用无菌手术巾覆盖小鼠，仅暴露切口区域。</li>
	<li>从剑突下方至耻骨上区做正中腹切口，插入自持式牵开器。将肠管用生理盐水浸湿的纱布包裹。钝性分离腹主动脉和下腔静脉，使其清晰可见。</li>
	<li>在主动脉和下腔静脉（IVC）的近端和远端各放置两根6-0丝线缝合线，以阻断血流。</li>
	<li>将供体心脏置于腹主动脉右侧，并用无菌纱布覆盖。用生理盐水保持湿润。</li>
	<li>使用30 G针头在腹主动脉上做主动脉切开，再用剪刀将切口扩大至与供体主动脉大小相匹配。</li>
	<li>使用带锥形针头的无菌10-0单丝缝线进行端侧吻合。先在腹主动脉切口的近端用一针固定供体主动脉，然后从腹主动脉切口的远端开始连续缝合4-5针。</li>
	<li>将心脏翻转至左侧，用含生理盐水的纱布覆盖，并从腹主动脉切口的远端开始继续连续缝合4-5针。</li>
	<li>使用30 G针头在下腔静脉（IVC）上做静脉切开，将切口扩大至与供体肺动脉大小相匹配。</li>
	<li>使用带锥形针头的无菌10-0单丝缝线进行端侧吻合。先在IVC切口的近端用一针固定供体肺动脉（PA），然后从下腔静脉远端开始连续缝合4-5针。由于此时主动脉可能遮挡视野，需确保供体PA左侧壁的缝合位于IVC内侧。</li>
	<li>用肝素和生理盐水溶液（100单位/ml）冲洗IVC管腔。通过连续缝合将供体PA右侧壁与受体IVC闭合至远端。</li>
	<li>移除远端结扎线，并局部使用可吸收无菌止血剂控制出血。待出血完全停止后，移除近端缝线，并以相同方式控制出血。</li>
	<li>将肠管复位，使用6-0黑色单丝聚酰胺缝线分两层缝合腹壁肌肉和皮肤。</li>
	<li>皮下注射0.5 ml生理盐水，将小鼠置于带有加热垫的恢复笼中，直至其完全恢复活动能力。恢复后，将小鼠转移至铺有纸垫的新笼中。术后48小时内给予止痛药物（布洛芬，30 mg/kg，溶于饮用水中）。任何接受手术的动物在完全恢复前不得与其他动物合笼饲养。</li>
</ol>

<ol><li>Polito, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+morbidity+and+mortality+in+very+preterm+VLBW+infants+with+congenital+heart+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Intens+Care+Med%22%5BJournal%5D)">Increased morbidity and mortality in very preterm VLBW infants with congenital heart disease.</a> Intens Care Med. 39, 1104-1112 (2013).</li>
<li>Wren, C., Reinhardt, Z., Khawaja, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Twenty+year+trends+in+diagnosis+of+life+threatening+neonatal+cardiovascular+malformations%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Dis+Child+Fetal%22%5BJournal%5D)">Twenty year trends in diagnosis of life threatening neonatal cardiovascular malformations.</a> Arch Dis Child Fetal. 93, F33-F35 (2008).</li>
<li>Vacanti, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beyond+transplantation+Third+annual+Samuel+Jason+Mixter+lecture%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+surgery%22%5BJournal%5D)">Beyond transplantation Third annual Samuel Jason Mixter lecture.</a> Archives of surgery. 123, Chicago Ill. 545-549 (1960).</li>
<li>Tudorache, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Orthotopic+replacement+of+aortic+heart+valves+with+tissue-engineered+grafts%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+engineering+Part+A%22%5BJournal%5D)">Orthotopic replacement of aortic heart valves with tissue-engineered grafts.</a> Tissue engineering Part A. 19, 1686-1694 (2013).</li>
<li>van Geldorp, M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patient+outcome+after+aortic+valve+replacement+with+a+mechanical+or+biological+prosthesis+weighing+lifetime+anticoagulant+related+event+risk+against+reoperation+risk%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+thoracic+and+cardiovascular+surgery%22%5BJournal%5D)">Patient outcome after aortic valve replacement with a mechanical or biological prosthesis weighing lifetime anticoagulant related event risk against reoperation risk.</a> The Journal of thoracic and cardiovascular surgery. 137, 881-886 (2009).</li>
<li>El Oakley, R., Kleine, P., Bach, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Choice+of+prosthetic+heart+valve+in+today%27s+practice%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Choice of prosthetic heart valve in today's practice.</a> Circulation. 117, 253-256 (2008).</li>
<li>Quinn, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+Models+for+Bench+to+Bedside+Translation+of+Regenerative+Cardiac+Constructs%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Pediatric+cardiology%22%5BJournal%5D)">Animal Models for Bench to Bedside Translation of Regenerative Cardiac Constructs.</a> Progress in Pediatric cardiology. 35, (2013).</li>
<li>Shinoka, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+engineering+heart+valves+valve+leaflet+replacement+study+in+a+lamb+model%5BTitle%5D)+AND+%22The+Annals+of+thoracic+surgery%22%5BJournal%5D)">Tissue engineering heart valves valve leaflet replacement study in a lamb model.</a> The Annals of thoracic surgery. 60, S513-S516 (1995).</li>
<li>Sodian, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+engineering+of+heart+valves+in+vitro+experiences%5BTitle%5D)+AND+%22The+Annals+of+thoracic+surgery%22%5BJournal%5D)">Tissue engineering of heart valves in vitro experiences.</a> The Annals of thoracic surgery. 70, 140-144 (2000).</li>
<li>Shinoka, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+engineered+heart+valves.+Autologous+valve+leaflet+replacement+study+in+a+lamb+model%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Tissue engineered heart valves. Autologous valve leaflet replacement study in a lamb model.</a> Circulation. 94, II164-II168 (1996).</li>
<li>Sodian, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+biodegradable+three+dimensional+matrices+for+tissue+engineering+of+heart+valves%5BTitle%5D)+AND+%22ASAIO+journal+%28American+Society+for+Artificial+Internal+Organs%22%5BJournal%5D)">Evaluation of biodegradable three dimensional matrices for tissue engineering of heart valves.</a> ASAIO journal (American Society for Artificial Internal Organs. 46, 107-110 (1992).</li>
<li>Sodian, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+in+vivo+experience+with+tissue-engineered+trileaflet+heart+valves%29%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Early in vivo experience with tissue-engineered trileaflet heart valves).</a> Circulation. 102, III22-III29 (2000).</li>
</ol>

我们没有需要披露的内容。

该手术的死亡率接近20%，主要原因为门静脉移植部位以及供体主动脉与受体腹主动脉吻合处发生出血。大多数情况下，术后48小时死亡率显著下降。存活的小鼠表现出强有力的心跳以及血液流经植入的门静脉。对于经验丰富的显微外科医生而言，整个手术过程耗时约四小时。掌握该技术大约需要250只小鼠。与将门静脉植入供体心脏相比，异位心脏移植相对简单。门静脉移植成功最关键的步骤之一是从供体小鼠中获取门静脉结构。门静脉结构应在瓣膜下方约1-2 mm处横断。若残留组织过短，吻合将变得困难；若门静脉下方组织过长（即肺动脉过长（与升主动脉相比）可能导致植入后发生扭曲或成角。另一个关键步骤是植入的肺动脉与受体下腔静脉之间的吻合。由于下腔静脉管壁极薄，缝合时极易撕裂。
在此模型中，主动脉血液经主动脉流入，通过冠状动脉，随后经冠状窦流入供体右心房。因此，流经植入肺动脉瓣的血量估计仅为总血容量的5%，这是该模型在研究组织工程心脏瓣膜（TEHV）时最主要的局限性。为了增加通过肺动脉瓣的血流量，建立了三种额外的模型。首先，在供体右心室与受体下腔静脉之间建立第三条吻合口。该第三条吻合口可使血流量增加至总血容量...

先天性心血管缺陷是西方世界婴儿死亡的主要原因之一1,2。&#160; 其中，肺动脉瓣狭窄和二叶式主动脉瓣缺陷是较为常见的类型3。&#160; 心脏瓣膜置换手术是重建性手术的常规选择；然而，瓣膜狭窄和钙化等并发症，以及终身依赖抗凝药物，是导致慢性疾病和死亡的重要原因4-7。此外，由于缺乏生长潜力，患者需要接受多次修复手术，这进一步增加了年轻患者的死亡率4,8,9。
为了开发具有生长潜力的功能性替代心脏瓣膜，Shinoka 等将自体细胞接种到一种可生物降解的合成心脏瓣膜上8。该合成瓣膜转化为类似天然心脏瓣膜的结构，并具备生长潜能。初步的大动物研究表明，采用此方法制造功能性心脏瓣膜是可行的10&#160;。然而，长期植入研究显示，由于瓣膜新生组织进行性增厚，导致心脏瓣膜狭窄，耐久性较差。Sodian 等的研究采用了Shinoka的方法，但最终用一种可生物降解的弹性体替代了PGA基质，使组织工程瓣膜构建物的生物力学性能更接近生理状态9,11,12。在体内研究中，尽管植入取得成功，但未形成连续的内皮细胞层，这可能限制该支架的长期效果12。
为了合理设计改进的第二代人工心脏瓣膜，建立了小鼠心脏瓣膜移植模型，以研究新生组织形成、瓣膜增厚及狭窄发展的细胞与分子机制。小鼠模型提供了丰富的分子试剂资源，包括转基因技术，而这些资源在其他物种中尚不便于获得7在此心脏瓣膜移植模型中，一个 离体 首先进行同基因型肺动脉瓣置换；随后利用显微外科技术将植入了瓣膜的心脏异位移植到同基因型受体体内。该模型实现了无需体外循环的心脏瓣膜置换。
本文详细描述了心脏瓣膜取材、供体心脏制备、心脏瓣膜移植以及异位心脏移植的操作过程。结果显示，供体心脏保持持续跳动，且其节律独立于受体心脏。通过使用脉冲波多普勒的高频超声系统，测量了植入的肺动脉瓣血流情况。

<table><tbody><tr><td>DPBS</td><td>Gibco</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>显微镜</td><td>Leica</td><td>M80</td><td></td></tr><tr><td>C57BL/6J (H-2b)，雌性</td><td>Jackson Laboratories</td><td>664</td><td>8–12 周龄</td></tr><tr><td>盐酸氯胺酮注射液</td><td>Hospira Inc.</td><td>NDC 0409-2053</td><td></td></tr><tr><td>无菌赛拉嗪溶液</td><td>Akorn Inc.</td><td>NADA# 139-236</td><td></td></tr><tr><td>酮洛芬</td><td>Fort Dodge Animal Health</td><td>NDC 0856-4396-01</td><td></td></tr><tr><td>布洛芬</td><td>PrecisionDose</td><td>NDC 68094-494-59</td><td></td></tr><tr><td>肝素钠</td><td>Sagent Pharmaceticals</td><td>NDC 25021-400</td><td></td></tr><tr><td>生理盐水溶液（无菌 0.9% 氯化钠）</td><td>Hospira Inc.</td><td>NDC 0409-0138-22</td><td></td></tr><tr><td>0.9% 氯化钠注射液</td><td>Hospira Inc.</td><td>NDC 0409-4888-10</td><td></td></tr><tr><td>凡士林眼膏</td><td>Dechra Veterinary Products</td><td>NDC 17033-211-38</td><td></td></tr><tr><td>碘伏消毒片</td><td>Triad Disposables, Inc.</td><td>NDC 50730-3201-1</td><td></td></tr><tr><td>酒精消毒片</td><td>McKesson Corp.</td><td>NDC 68599-5805-1</td><td></td></tr><tr><td>棉签</td><td>Fisher Sientific</td><td>23-400-118</td><td></td></tr><tr><td>精细剪刀</td><td>FST</td><td>14028-10</td><td></td></tr><tr><td>微型 Adson 镊子</td><td>FST</td><td>11018-12</td><td></td></tr><tr><td>夹子施加镊</td><td>FST</td><td>00072-14</td><td></td></tr><tr><td>S&amp;T 血管夹</td><td>FST</td><td>00396-01</td><td></td></tr><tr><td>弹簧剪</td><td>FST</td><td>15008-08</td><td></td></tr><tr><td>Colibri 牵开器</td><td>FST</td><td>17000-04</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 镊子</td><td>FST</td><td>11251-20</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #7 – 精细镊子</td><td>FST</td><td>11274-20</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5/45 镊子</td><td>FST</td><td>11251-35</td><td></td></tr><tr><td>Tish 持针器/镊子</td><td>Micrins</td><td>MI1540</td><td></td></tr><tr><td>黑色聚酰胺单丝缝线，10-0</td><td>AROSurgical Instruments Corporation</td><td>TI638402</td><td>用于移植缝合</td></tr><tr><td>黑色聚酰胺单丝缝线，6-0</td><td>AROSurgical Instruments</td><td>SN-1956</td><td>用于肌肉和皮肤闭合</td></tr><tr><td>非织造海绵</td><td>McKesson Corp.</td><td>94442000</td><td></td></tr><tr><td>可吸收止血剂</td><td>Ethicon</td><td>1961</td><td></td></tr><tr><td>1 ml 注射器</td><td>BD</td><td>309659</td><td></td></tr><tr><td>3 ml 注射器</td><td>BD</td><td>309657</td><td></td></tr><tr><td>10 ml 注射器</td><td>BD</td><td>309604</td><td></td></tr><tr><td>18 G 1 1/2 英寸针头</td><td>BD</td><td>305190</td><td></td></tr><tr><td>25 G 1 英寸针头</td><td>BD</td><td>305125</td><td></td></tr><tr><td>30 G 1 英寸针头</td><td>BD</td><td>305106</td><td></td></tr><tr><td>循环温水加热系统</td><td>Gaymar</td><td>TP-700</td><td></td></tr><tr><td>加热垫</td><td>Gaymar</td><td>TP-22G</td><td></td></tr><tr><td>剃毛器</td><td>Wahl</td><td>9854-500</td><td></td></tr><tr><td>VEVO2100 高频超声系统</td><td>VisualSonics</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.visualsonics.com/vevo2100">http://www.visualsonics.com/vevo2100&lt;/a&gt;</td><td>货号和价格可向销售代表咨询获取。</td></tr><tr><td>超声耦合凝胶</td><td>Parker Laboratories,&lt;br/&gt; INC.</td><td>01-02</td><td></td></tr><tr><td>台式实验动物麻醉系统</td><td>VetEquip, INC.</td><td>901806</td><td></td></tr><tr><td>异氟烷</td><td>Baxter</td><td>1001936060</td><td></td></tr></tbody></table>

异位心脏移植小鼠模型中肺动脉瓣移植

Transplantation of Pulmonary Valve Using a Mouse Model of Heterotopic Heart Transplantation

组织工程心脏瓣膜，尤其是脱细胞瓣膜，近年来在重建手术的临床应用中逐渐受到关注，但其效果尚不一致。然而，新生组织形成、瓣膜增厚以及狭窄发展的细胞与分子机制尚未得到充分研究。为回答上述问题，我们建立了一种小鼠异位心脏瓣膜移植模型。从瓣膜供体小鼠获取心脏瓣膜，并将其移植至心脏供体小鼠体内。携带新瓣膜的心脏随后被异位移植到受体小鼠体内。移植后的心脏表现出独立于受体心跳的自主搏动。通过高频超声系统结合脉冲波多普勒技术对血流进行定量分析。经植入的肺动脉瓣血流显示为前向血流，反流极少，峰值流速接近100 mm/sec。该小鼠心脏瓣膜移植模型具有高度可变性，可进行修改和调整，以提供不同的血流动力学环境，或与多种转基因小鼠联合使用，用于研究组织工程心脏瓣膜中新生组织的发育过程。

图1展示了利用异位心脏移植建立心脏瓣膜移植模型的示意图。心脏瓣膜取自供体心脏，并植入另一只供体小鼠的心脏上。随后，将带有新心脏瓣膜的心脏移植至受体小鼠的腹腔内。图2显示了移植后心脏在腹腔内的位置示意图（A）、心脏移植刚完成时的状态（B）以及移植后5分钟的状态。当主动脉和下腔静脉（IVC）两侧的缝线被拆除后，心脏通常在1-2分钟后开始搏动，并随着血流灌注增加而逐渐变为粉红色。请注意，右心房在（C）中的扩张程度较（B）更为明显。心脏搏动逐渐增强，并在24小时后趋于稳定。
植入肺动脉瓣后10天，使用高频超声系统结合脉冲波多普勒模式经皮测量通过植入肺动脉瓣的血流（图3）。B模式下显示了主动脉、右心室（RV）、植入肺动脉瓣（PV）和肺动脉（PA）的位置（图3（A））。黄色取样容积重叠区域位于...

为了理解组织工程心脏瓣膜中新生组织形成和狭窄发展的细胞与分子机制，研究人员建立了一种小鼠异位心脏瓣膜移植模型。采用异位心脏移植技术，将肺动脉瓣移植至受体动物体内。

组织工程心脏瓣膜，尤其是脱细胞瓣膜，正逐渐在重建手术的临床应用中获得关注，其效果尚不均衡……

本实验的总体目标是研究组织工程心脏瓣膜中新生组织形成、瓣膜增厚以及狭窄发展的细胞与分子机制。首先从供体小鼠心脏组织中获取肺动脉瓣，然后从第二个供体中完整取出整个心脏。随后将供体肺动脉瓣植入供体心脏，将带有新心脏瓣膜的心脏异位移植到受体小鼠体内。最终，可通过脉冲波多普勒模式的高频超声系统监测移植心脏的功能以及血液流经肺动脉瓣的情况。与其他大型动物模型相比，使用小鼠模型的主要优势在于，小鼠模型可利用种类广泛的分子试剂，从而有助于研究血管新生组织形成过程中涉及的细胞与分子机制，以及在狭窄发展和组织工程心脏瓣膜研究中的相关机制。通常，初次接触该方法的研究人员会因手术存活微血管吻合术的复杂性而面临困难。该方法的可视化演示至关重要，因为移植部位的正确操作难以掌握，且在小口径血管上进行操作时极易发生出血。为获取供体肺动脉瓣，首先固定一只6至8周龄的雌性供体C57黑六小鼠的胸部区域，并将其置于仰卧位。开胸后暴露心脏，在右心房做一小切口，用冰冻生理盐水灌注左心室。随后，钝性分离肺动脉与升主动脉，连同约2毫米的肺动脉袖状组织一并切除肺动脉瓣，并将获取的肺动脉瓣保存在低温的肝素生理盐水溶液中，可在移植前保存最多2小时。对一只已处死的6至8周龄雌性C57黑六小鼠进行开胸手术后，如前所述钝性分离心脏、下腔静脉、上腔静脉、升主动脉、肺动脉和肺静脉。用冰冻的无菌生理盐水灌注下腔静脉，然后用6-0丝线结扎下腔静脉、上腔静脉和肺静脉，于结扎线上方切断，将主动脉和肺动脉保留2毫米袖状组织后切断，并切除肺动脉瓣，以将肺动脉瓣移植至供体心脏。首先将瓣膜置入供体心脏，并调整组织方向。接下来，使用带圆锥形针的10-0单丝缝线在瓣膜右侧缝合一针以固定。然后在肺动脉瓣的另一侧连续缝合五到六针。完成瓣膜前面的缝合后，将心脏水平旋转，将肺动脉瓣的背面缝合到供体心脏上。然后结扎供体心脏的肺静脉并取出心脏。将心脏置于冷肝素生理盐水中，可在植入受体小鼠前保存长达两小时。现在通过脚趾夹捏法确认一只六至八周龄雌性受体 C57BL/6 小鼠的麻醉状态。然后，剪除腹部毛发，并用无菌眼膏润滑眼睛，将小鼠置于仰卧位，使用碘伏和酒精棉片对腹部进行消毒，并用无菌洞巾覆盖小鼠，仅暴露手术切口区域。接着，从剑突下方至耻骨上区做一正中腹腔切口。然后插入自持式拉钩，并用生理盐水浸湿的纱布包裹肠管。简要地，明确腹主动脉和下腔静脉。然后在腹主动脉和下腔静脉的近端和远端分别放置两根6-0丝线缝合线并进行结扎。为阻断血流，使用30号针头在腹主动脉上做主动脉切开术（AOR autotomy），并在下腔静脉上做静脉切开术（venotomy）。用剪刀将切口扩大至与供体主动脉和肺动脉相同的尺寸。将供体心脏置于腹主动脉右侧，并用湿润的无菌纱布覆盖并保持湿润。在腹主动脉切口的近端用一针固定供体主动脉，然后从腹主动脉的远端开始缝合4到5针连续缝线。将心脏翻转至

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