小鼠卒中模型：远端大脑中动脉永久性凝闭

本实验的总体目标是通过电凝法永久阻断小鼠远端大脑中动脉，从而产生主要位于皮层、体积相对与人类脑卒中相当的梗死灶。该目标的实现首先需要在手术前评估动物肢体使用不对称性的基线水平，随后通过远端大脑中动脉电凝手术诱导脑卒中。

手术后，通过评估四肢使用不对称性来检测局灶性感觉运动功能缺损。最后一步是利用结晶紫染色分析梗死体积。最终形成的皮层损伤范围适中且变异较小，这使得该技术成为基础与转化卒中研究中的一个重要模型。

与其他常见卒中模型相比，该技术的主要优势在于此模型的死亡率极低，且梗死体积和定位具有高度可重复性。新皮层梗死代表了人类卒中的大多数情况，因此该模型具有重要的研究价值。初次接触该方法的研究人员，通常首先需要在轻柔去除颅骨以尽量减少机械性损伤方面进行练习和掌握技巧。

其次，正确识别并恰当结扎远端中结肠动脉对该模型至关重要。首先，在开始手术前30分钟注射镇痛剂。打开小鼠的加热垫，并将温度设置为37摄氏度以进行手术。

接下来，确保由70%氮气、30%氧气和异氟烷组成的麻醉气体已准备就绪。然后将小鼠置于诱导室中，暴露于4%异氟烷，直至其停止活动。随后将小鼠置于加热垫上，并以4%异氟烷继续麻醉一分钟。

一分钟后，将异氟烷的流量调整至1.5%。现在通过脚趾夹捏法确认小鼠是否已充分麻醉，若确认麻醉充分，则使用剪刀将凡士林乙醇涂抹于眼睛表面。从耳部与眼部之间的区域开始，做一厘米长的切口，逐层分离皮肤并暴露颞肌。

现在将高频发生器的功能设置为凝固模式，模式选择双极，功率设为12瓦，并连接镊子。在准备过程中，向暴露的颞肌滴加一滴生理盐水。然后使用电凝镊子从颅骨的顶端和远端部分分离颞肌。

结果是得到一块松解的肌瓣。现在在透明的颅骨下方识别大脑中动脉（MCA）。它位于颞区的头侧部分，眶后窦的背侧。

使用钻头在该动脉正上方钻薄颅骨，直至骨质变薄透亮。钻孔过程中需用生理盐水保持颅骨湿润。然后使用精细镊子小心去除骨质，以暴露大脑中动脉分支。

将高频发生器调整至七瓦。现在使用电凝镊轻轻接触动脉进行凝固，注意不要夹持。在大脑中动脉（MCA）无分叉的解剖变异情况下，需在分叉近端和远端对动脉进行凝固；若无分叉，则尽可能在近端位置相距约一毫米的两个点进行凝固。

等待30秒，然后用钝头镊子轻轻触碰动脉。接着，将肌肉复位至覆盖钻孔的位置。缝合伤口，并将动物置于32摄氏度的护理箱中，以恢复麻醉状态，随后将其放回笼中。

通常，动物从麻醉状态恢复需要5到10分钟。圆筒实验用于检测动物是否更倾向于使用某一侧肢体。将动物放入一个透明的丙烯酸玻璃圆筒中，圆筒两侧以直角放置两面镜子。

在圆柱体另一侧的两个镜子顶点相对位置，对动物进行五分钟的录像。每次试验结束后，使用60%乙醇擦拭圆柱体和桌面。之后，进行逐帧分析。

通过计数大鼠完全直立时单侧前肢与圆筒接触的次数，以及单侧前肢着陆的次数来评分。每次完整的直立试验中，至少记录20次单侧前肢接触。将每只动物的大脑连续冠状切片，每隔400微米采集一片，每片厚度为20微米。将切片收集到载玻片上，于-20°C保存。

采用此切片方案，可将一个大脑中覆盖梗死区域的所有切片置于同一张载玻片上。使用标准的克雷斯尔紫染色法对切片进行染色，以明确各脑切片中梗死组织的范围。随后可将切片封片、扫描，并采用Swanson法对水肿进行分析。

由于大脑中动脉阻塞手术导致的校正死亡率低于5%，主要原因是蛛网膜下腔出血或麻醉不当。在观察期间无动物死亡。在本项用于PA分析的研究中，脑卒中诱导后通过圆柱体试验测量肢体不对称性，并与大脑中动脉阻塞前获得的基线值进行比较，结果显示在卒中后24小时出现显著的肢体不对称性，该不对称性在卒中发生后第一周内部分恢复。

通过冠状面紫染色测量的诱导梗死体积平均为15.4立方毫米，约占单侧大脑半球的12%。该模型的标准差非常低，且梗死部位的变异性极小。

一旦掌握，若操作得当，该手术可在10分钟内完成。除了演示的圆筒实验和结晶紫染色外，还可采用其他已建立的行为学测试和组织学方法，以进一步表征实验结果并解答特定的研究问题。观看本视频后，您应能充分理解如何在小鼠中实施永久性远端大脑中动脉阻塞。

我们强烈建议使用标准操作程序和详细记录，以确保该方法的可重复性。