Name: 造型中风小鼠：在远端大脑中动脉永久性混凝 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-07-31T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 14 s
Description: 学习使用电凝法建立小鼠远端大脑中动脉永久性闭塞模型，通过圆柱试验评估肢体不对称性，并利用甲酚紫染色分析梗死体积。该方法可产生与人类中风相似的皮层梗死，死亡率低于5%，为基础与转化性中风研究提供可重复的动物模型。

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本工作由德国研究基金会卓越集群“慕尼黑系统神经学集群（SyNergy）”以及戴姆勒-奔驰基金会资助，资助对象为 A.L.。

伦理声明
本视频中报道的实验均按照国家关于实验动物使用的规定进行，并已获得德国政府委员会（德国慕尼黑上巴伐利亚行政区）的批准。本研究使用10周龄雄性C57Bl/6J小鼠。动物饲养环境温度控制在（22 ± 2 °C），光照-黑暗周期为12小时，可自由摄取颗粒饲料和饮水ad libitum.&#160;镇痛和镇静方案已获当地政府部门批准，但可能与其他实验室所用方案有所不同。
1. 材料与仪器的准备
<ol>
	<li>连接加热毯以保持手术区域温暖，并在麻醉期间维持小鼠体温（37 °C）。</li>
	<li>准备已灭菌的剪刀、镊子和&#160;棉签、右泛醇眼膏和缝合材料。准备一支含有生理盐水（不带针头）的注射器，以保持手术区域湿润。准备麻醉气体（70% N₂2O + 30% O2 + 异氟烷）</li>
	<li>腹腔注射镇痛剂：甲氧基丙嗪 200 mg/kg、卡洛芬 4 mg/kg 和布托啡诺 0.1 mg/kg。</li>
	<li>将小鼠放入诱导室，以4%异氟烷流速麻醉，直至其身体和须部自发运动停止。</li>
	<li>将小鼠侧卧放置，使其鼻部伸入麻醉面罩，维持异氟烷浓度为4%约1分钟，随后将其降低至约1.5%以维持适当的麻醉状态。</li>
	<li>双眼涂抹右旋泛醇眼膏。&#160;</li>
</ol>
2. 远端大脑中动脉阻塞模型
<ol>
	<li>使用小手术剪在耳与眼之间做1 cm的皮肤切口&#160;，切口前需用皮肤消毒剂对术区进行无菌准备。</li>
	<li>分离皮肤并定位颞肌。</li>
	<li>在高频电刀上选择凝固功能、双极模式，设定功率为12 W，并将电凝镊通过电缆连接至设备。</li>
	<li>滴加一滴生理盐水，用镊子从颅骨上分离颞肌的顶端和背侧部分，形成肌瓣，但不完全切除肌肉。</li>
	<li>在颞区的头侧、眶后窦背侧的透明颅骨下方识别大脑中动脉（MCA）（图2A）。若因解剖学正常变异无法看到MCA分叉，则识别最靠头侧的血管。</li>
	<li>在颅骨上滴加少量生理盐水，用钻头在MCA分支正上方打磨颅骨，直至其变得薄而半透明（图2B）。</li>
	<li>用极细的镊子小心移除动脉上方的骨片。</li>
	<li>将高频电刀调至双极模式，功率设为7 W。用电凝镊在分叉的近端和远端凝固动脉（图2C）。若因解剖变异无法看到分叉，则对已正确识别的MCA分支（见上文）在相距约1 mm的两个位置进行电凝。电凝时无需用镊子夹住动脉，仅需从上方两侧轻轻接触动脉即可，这样足以完成凝固且可减少机械损伤。</li>
	<li>等待30秒，用钝头镊子轻触动脉，检查是否有因自发再通而产生的血流。若发生再通，需重复一次电凝操作。</li>
	<li>将颞肌复位，覆盖钻孔区域。</li>
	<li>缝合伤口，将动物置于32 °C的护理箱中恢复麻醉，之后放回笼中。通常动物在5–10分钟内可从麻醉中恢复。</li>
	<li>术后24小时开始注射术后镇痛药（腹腔注射），每日一次，持续至术后第五天：卡洛芬（Carprofen）4 mg/kg。</li>
</ol>
3. 假手术操作
所有操作步骤均与上述手术相同——包括颅骨变薄及其去除——但暴露的动脉无需进行凝固处理。
4. 圆筒实验13
<ol>
	<li>将动物放入一个透明的丙烯酸玻璃圆筒（直径：8 cm；高度：25 cm）中，圆筒前方放置两面镜子，录像5分钟。将摄像机置于两面镜子和圆筒正前方的中心位置，以获得最佳视频效果（图3A）。</li>
	<li>评估独立前肢使用情况时，记录以下两种行为：（1）动物完全直立时，单个前肢接触圆筒壁；（2）完全直立后，仅用单个前肢着地。使用视频播放软件 Video Lan Client (VLC)（<a href="http://www.videolan.org/vlc">http://www.videolan.org/vlc</a>）的慢放或逐帧功能，统计单个前肢至少20次的接触次数。</li>
	<li>术前基线分析：每只小鼠进行两次测试，两次试验之间间隔1小时。前肢使用情况以右侧与左侧独立前肢使用次数的比值表示。</li>
	<li>大脑中动脉凝闭术后：每只小鼠再次进行两次测试，两次试验之间同样间隔1小时，操作同上。</li>
</ol>
5. 灌注
<ol>
	<li>麻醉动物（例如， 分别按120/16 mg/kg体重剂量给予氯胺酮和赛拉嗪</li>
	<li>将动物仰卧位固定，沿中线切开腹腔。去除肋骨和胸骨，在右心房做一小切口。将灌注导管插入左心室，缓慢灌注20 ml生理盐水。</li>
	<li>将动物断头，打开颅骨，轻柔地将脑组织从颅底剥离。</li>
	<li>将脑组织置于-40 °C的异戊烷中冷冻10分钟。随后将脑组织从异戊烷中取出，于-80 °C保存，直至进一步分析。</li>
</ol>
6. 梗死体积测量
<ol>
	<li>冷冻切片：将脑组织在冷冻切片机上进行连续冠状切片，每400 µm取一片，每片厚度为20 µm，置于载玻片上，并将载玻片储存在-20 °C环境中。</li>
	<li>焦油紫（Cresyl violet, CV）染色：
	<ol>
		<li>配制染色液：将0.5 g焦油紫乙酸盐溶于500 ml H2O中，搅拌并加热至60 °C，直至晶体完全溶解。待溶液冷却后，储存于避光瓶中。每次使用前需重新加热至60 °C并过滤。</li>
		<li>将载玻片在室温下干燥30分钟，随后依次浸入95%乙醇中15分钟、70%乙醇中1分钟，再转入50%乙醇中1分钟。</li>
		<li>将载玻片置于蒸馏水中2分钟，更换新鲜蒸馏水后再次浸入1分钟。随后将载玻片放入60 °C的染色液中染色10分钟，再用蒸馏水漂洗两次，每次1分钟。</li>
		<li>将载玻片依次浸入95%乙醇中2分钟，然后转入100%乙醇中5分钟，更换一次100%乙醇后再浸入2分钟。最后用封片剂封片。</li>
		<li>分析： 
		扫描载玻片，并采用Swanson方法14计算校正水肿后的间接梗死体积： 
		（缺血区域面积）=（对侧皮层面积）–（同侧非缺血皮层面积）（图4A）。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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<li>Bouet, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+adhesive+removal+test%3A+a+sensitive+method+to+assess+sensorimotor+deficits+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">The adhesive removal test: a sensitive method to assess sensorimotor deficits in mice.</a> Nat. Protoc. 4, 1560-1564 (2009).</li>
<li>Zhang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+test+for+detecting+long-term+sensorimotor+dysfunction+in+the+mouse+after+focal+cerebral+ischemia%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Methods%22%5BJournal%5D)">A test for detecting long-term sensorimotor dysfunction in the mouse after focal cerebral ischemia.</a> J. Neurosci. Methods. 117, 207-214 (2002).</li>
<li>Orset, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+model+of+in+situ+thromboembolic+stroke+and+reperfusion%5BTitle%5D)+AND+%22Stroke%22%5BJournal%5D)">Mouse model of in situ thromboembolic stroke and reperfusion.</a> Stroke. 38, 2771-2778 (2007).</li>
<li>Farr, T. D., Whishaw, I. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+and+qualitative+impairments+in+skilled+reaching+in+the+mouse+%28Mus+musculus%29+after+a+focal+motor+cortex+stroke%5BTitle%5D)+AND+%22Stroke%22%5BJournal%5D)">Quantitative and qualitative impairments in skilled reaching in the mouse (Mus musculus) after a focal motor cortex stroke.</a> Stroke. 33, 1869-1875 (2002).</li>
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</ol>

作者无任何竞争利益需要披露。

本方案描述了通过经颅电凝固法建立远端永久性大脑中动脉闭塞（MCAO）的实验性脑卒中模型——即所谓的“凝固模型”。目前，该模型已成为实验性脑卒中研究中最常用的动物模型之一12。与其他局灶性脑缺血模型相比，由受过训练的科研人员操作时，本视频所展示的凝固模型具有手术时间极短（约10分钟）的优势。因此，该模型可实现较短的麻醉时间，这是实验性脑卒中模型的一个有利特征，因为麻醉剂对神经保护作用及脑卒中预后的影响已得到充分证实15。此外，正如Carmichael et al.11此前所述，我们进一步证实，远端永久性大脑中动脉凝固所导致的梗死体积和定位，按脑容量比例计算，与大多数人类脑卒中的缺血性脑损伤相一致。根据既往人群研究和临床影像学试验，人类脑卒中病灶通常较小，病变范围约占大脑半球的5-15%16-18，而出现广泛性脑梗死伴压迫性脑水肿的情况在临床脑卒中中占比不足10%19。因此，本模型在大脑中动脉供血区产生的约占据半球12%的脑卒中病灶，可被视为具有转化相关性的脑卒中体积。然而，需注意的是，不同的小鼠品系或所采用的麻醉方案可能会影响最终的病灶体积20。
在此模型中，卒中诱导后观察期间的死亡率几乎为零。总体死亡率低于5%，主要由术中麻醉相关并发症导致的死亡，或因达到排除标准而实施安乐死所致。为了确保该模型的低变异性及其优异的可重复性，我们建议采用以下排除标准：1）术中出现任何蛛网膜下腔出血；2）手术时间超过15分钟；3）在进行两次电凝尝试后，仅实现短暂性大脑中动脉闭塞（MCAO），但未能维持闭塞。此外，动物在MCAO术后需每日接受检查（包括基本生理行为、毛发状况和体重），以监测疼痛、不适或病态行为。
可采用多种方法分析卒中结局，例如激光散斑成像、磁共振成像、行为学测试或组织学分析。在本方案中，我们提供了行为学分析和梗死体积分析的示例方法。已有多种行为学测试被开发并应用于局灶性脑缺血后的实验性卒中研究。我们课题组此前在此卒中模型中使用过的适用于感觉运动功能障碍评估的测试21,22包括转棒实验23、黏性标签测试24、转角实验25以及本视频所展示的圆筒实验13。圆筒实验能够持续反映远端永久性大脑中动脉闭塞（MCAO）后急性期的运动不对称性，并可检测后续运动功能的逐步恢复。
尽管该脑卒中模型具有明显的优势，但仍需考虑其某些局限性。首先，为了凝固动脉，需要进行颅骨开窗，这可能为术中脑部感染提供潜在途径，尽管我们自身从未检测到、也未见其他研究者在使用该模型时报道过手术伤口、颞肌或脑组织本身的细菌感染。此外，制备和凝固过程中对皮层造成的机械性损伤虽不能完全排除，但可通过精细钻孔和去除颅骨、持续湿润手术区域以及尽可能减少电凝（参见排除标准）来加以限制。虽然在大多数 C57Bl/6 小鼠中大脑中动脉（MCA）的走行如图2所示，但本方案中也描述了如何应对血管走行的正常变异，以尽量减少模型的变异性。此外，我们建议采用多个阻塞位点（MCA 存在分叉时为 3 个，无分叉时为 2 个），以降低 MCA 部分再通的风险，根据我们的经验，这是影响该模型变异性的一个重要因素。
在行为学测试方面，上述行为学测试中仅能检测到轻微的行为缺陷，且在卒中后第一周内即可观察到功能再生。因此，在该模型中，采用灵敏度更高、具有定性测试参数的更先进测试系统（如熟练 reaching 测试27）可能更适合检测长期功能结局。
最后，由于大脑中动脉（MCA）发生永久性凝固，无法实现再灌注，这一特征在相当比例的卒中患者中可见，原因在于自发性血栓溶解或治疗作用28。然而，先前描述的一种血栓栓塞性卒中模型26提供了一种可选的卒中模型，能够实现皮质脑缺血的再灌注。综上所述，该“凝固模型”具有高度可重复性、因极低死亡率而允许长期观察，以及在梗死体积相对大小和病灶定位方面与人类卒中具有可比性等优势，使其成为基础与转化卒中研究中一种有价值的模型。

脑卒中是发达国家中第三大常见死因，也是成人获得性残疾的主要原因之一1。这种急性神经系统疾病中约80%由脑缺血引起，即脑血流受阻所致，而约15%由脑内出血引起2。尽管相关研究持续进行，目前唯一获批用于缺血性脑卒中的药物治疗方案是静脉注射组织型纤溶酶原激活剂，但由于其批准使用时间窗仅为发病后4.5小时内，仅有少数脑卒中患者能够接受该治疗3,4。由于尚无能够准确模拟脑卒中期间脑组织、血管系统与全身病理生理机制之间复杂相互作用的体外模型，动物模型在脑卒中临床前研究中至关重要。
因此，已在多种物种中建立了多种缺血性脑卒中模型。其中最常用的卒中模型之一是“线栓模型”，即将一根缝合线暂时插入&#160;颈内动脉&#160;，并向前推进，直至其尖端阻塞&#160;大脑中动脉（MCA）的起始部，导致血流中断，进而引起皮层下区域以及在长时间阻塞情况下同时累及皮层区域的脑梗死&#160;5,6。在光化学诱导的缺血性卒中模型中，注射光敏剂后，对皮层血管进行照射，可实现靶向血管的光化学闭塞，从而形成小范围、边界清晰的局部病灶7。通过结扎、短暂压迫或永久性凝固的方法，可实现大脑中动脉在豆纹动脉远端的永久性闭塞8,9。该模型产生的梗死灶主要累及新皮层10，因为此模型中大脑中动脉的闭塞部位位于豆纹动脉的远端，而豆纹动脉负责供应基底节区域。
由于大多数人类脑卒中病灶位于大脑中动脉供血区域，因此常见的脑卒中模型均模拟大脑中动脉（MCA）或其某一分支的阻塞11大脑中动脉是为脑部供血的主要动脉之一，起源于颈内动脉，沿外侧裂走行&#160;随后分支并投射至基底神经节以及额叶、顶叶和颞叶的外侧面，包括初级运动皮层和初级感觉皮层。左右大脑中动脉通过&#160;大脑前动脉和&#160;后交通动脉，与之相连&#160;大脑后动脉，形成威尔斯环（图1).
正如 Carmichael 等人先前报道的那样et al.11，通过小鼠远端大脑中动脉闭塞（MCAO）模型建立的梗死灶约占半球体积的10-15%，从而模拟了大多数位于大脑中动脉皮层区域的人类脑卒中病灶11,12。1981年，Tamura et al. 报道了一种在大鼠中实施的永久性经颅大脑中动脉闭塞电凝模型8。然而，Tamura 描述的模型通过对大脑中动脉近端进行阻塞，以避开动脉更远端的分叉部位。因此，原始的“Tamura 模型”不仅引起皮层损伤，还导致纹状体损伤，与“线栓模型”所获得的损伤相似6。本文中，我们描述了在小鼠中采用经颅电凝法建立永久性远端 MCAO 模型的方法。此外，我们还报告了与此模型相关的组织学和功能学分析方法，用于评估脑卒中后的病理结果。所有方法均基于我们实验室开发并常规使用标准操作程序。

<table><tbody><tr><td>佳能 EOS 500D 相机</td><td>Canon</td><td></td><td>光学镜头：18-55 mm；30 帧/秒；640 x 480 视频功能</td></tr><tr><td>镜子</td><td>Kristallform</td><td>2677089</td><td>30 x 30 cm&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>透明亚克力玻璃圆柱</td><td>H&amp;#38;S Kunststofftechnik</td><td></td><td>直径：8 cm&amp;nbsp;，高度：25 cm</td></tr><tr><td>加热毯</td><td>FHC DC Temperature Controller</td><td></td><td></td></tr><tr><td>精细剪刀</td><td>FST</td><td>15000-00</td><td></td></tr><tr><td>梅奥剪刀</td><td>FST</td><td>1410-15</td><td></td></tr><tr><td>镊子</td><td>FST</td><td>11616-15</td><td></td></tr><tr><td>棉球</td><td>NOBA Verbondmitel Danz</td><td>974116</td><td></td></tr><tr><td>生理盐水溶液</td><td>Braun</td><td>131321</td><td></td></tr><tr><td>贝潘汀软膏</td><td>Bayer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>异氟烷</td><td>Abbot</td><td>B506</td><td></td></tr><tr><td>异氟烷麻醉系统</td><td>Drager</td><td></td><td></td></tr><tr><td>体视显微镜&amp;nbsp;</td><td>Zeiss</td><td>Stemi DV4</td><td></td></tr><tr><td>电外科设备</td><td>ERBETOM ICC 80/50 HF-Chirurgieger&amp;auml;t</td><td></td><td></td></tr><tr><td>钻孔机</td><td>Proxxon</td><td>D-34343</td><td></td></tr><tr><td>氯胺酮</td><td>Inresa Arzneimittel GmbH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>赛拉嗪</td><td>Albrecht</td><td></td><td></td></tr><tr><td>5 ml 注射器&amp;nbsp;</td><td>Braun</td><td></td><td></td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液，pH：7.4</td><td>Apotheke Innestadt Uni Munchen</td><td>P32799</td><td></td></tr><tr><td>异戊烷</td><td>Fluka</td><td>59070</td><td></td></tr><tr><td>冷冻切片机</td><td>Thermo Scientific CryoStarNX70</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Superfrost Plus 载玻片</td><td>Thermo Scientific</td><td>J1800AMNZ</td><td></td></tr><tr><td>焦油紫</td><td>Sigma Life Science</td><td>C5042-10G</td><td></td></tr><tr><td>乙酸</td><td>Sigma Life Science</td><td>695092</td><td></td></tr><tr><td>70% 乙醇</td><td>CLN Chemikalien Laborbedorf</td><td>521005</td><td></td></tr><tr><td>96% 乙醇</td><td>CLN Chemikalien Laborbedorf</td><td>522078</td><td></td></tr><tr><td>99% 乙醇</td><td>CLN Chemikalien Laborbedorf</td><td>ETO-5000-99-1</td><td></td></tr><tr><td>Roti-Histokit 封片介质</td><td>Roth</td><td>6638.1</td><td></td></tr><tr><td>C57Bl/6J 小鼠</td><td>Charles River</td><td>000664</td><td></td></tr></tbody></table>

小鼠卒中模型：远端大脑中动脉永久性凝闭

Modeling Stroke in Mice: Permanent Coagulation of the Distal Middle Cerebral Artery

脑卒中是发达国家中第三大常见死因，也是成人获得性残疾的主要原因。在急性期，仅有极少数脑卒中患者可获得非常有限的治疗选择。目前研究正积极寻找新的治疗策略，并 increasingly 将重点放在脑卒中后的亚急性期和慢性期，因为在更长的时间窗内可能有更多患者适合接受治疗干预。这些延迟发生的机制包括脑卒中后炎症、血管生成、神经元可塑性和再生等重要的病理生理通路。为了分析这些机制并进一步评估新的药物靶点，人们迫切需要具有临床相关性、低死亡率和高可重复性的实验性脑卒中模型。此外，小鼠是可诱导局灶性脑卒中损伤的最小哺乳动物，且拥有广泛的转基因模型资源。因此，本文介绍的是通过电凝法对大脑中动脉在豆纹动脉远端进行经颅永久性凝固阻断的小鼠模型，即所谓的“凝固模型”。该模型产生的梗死主要位于大脑皮层，其相对于脑体积的梗死体积与大多数人类脑卒中情况相符。同时，该模型也满足上述可重复性和低死亡率的要求。在本视频中，我们将演示“凝固模型”中脑卒中的手术诱导方法，并介绍组织学和功能分析工具。

由于麻醉时间较短且脑损伤程度适中，动物转移至笼中约10分钟后均已苏醒，能够在笼内自由活动并与同窝动物互动。MCAO手术期间的死亡率低于5%，主要原因为意外发生的蛛网膜下腔出血或麻醉不当。脑卒中诱导后7天观察期内的死亡率极低，仅约1-2%的动物出现死亡。本报告所涉及的10只动物的手术系列中，所有动物均成功度过手术及7天观察期，无一例因排除标准而被剔除。
通过圆筒试验13评估大脑中动脉（MCA）凝闭后的行为功能缺陷，该试验用于分析前肢使用不对称性。在该试验中，于脑卒中诱导后的指定时间点测量左侧和右侧前肢独立使用比例，并与MCAO前24小时获得的基线值进行比较（图3B）。动物在MCAO后24小时（1.72 ± 0.326；p &lt; 0.05）和3天（1.36 ± 0.17；p &lt; 0.05）时，在圆筒试验中表现出显著的肢体使用不对称性变化。尽管在为期1周的观察期间该比值有所改善，但在MCAO后7天，与基线值相比，运动不对称性仍然显著（1.35 ± 0.29；p &lt; 0.05）。
我们在卒中诱导后7天，采用焦油紫染色的连续冠状脑切片进行梗死体积测量（图4B）。平均梗死体积为15.4 mm3，相当于单侧脑半球体积的12%（图4C）。该卒中模型的变异性极低，标准差约为10%。病变区域主要累及体感皮层和运动皮层，仅轻微影响皮层下结构。此外，梗死区域的定位高度可预测，变异性极小，如示意图分布图所示（图4D）。
<img alt="显示标注动脉的威尔斯环示意图，突出大脑中动脉阻塞部位及脑部血液循环。" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51729/51729fig1highres.jpg" width="500" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图1"> 
图1. 威尔斯环示意图。 威尔斯环由大脑中动脉（MCA）和大脑前动脉（ACA）组成，这两者源自颈内动脉（ICA）；此外还包括大脑后动脉（PCA）和后交通动脉（PComA）。MCA 延伸至外侧裂，并在此处分出至大脑皮层的分支。本模型所展示的是永久性阻断主要供应运动皮层大部分区域及部分体感皮层的主导 MCA 分支（AcomA = 前交通动脉；BA = 基底动脉；SuCA = 小脑上动脉）。
<img alt="小鼠脑部注射装置；光纤放置和实验配置示意图。" fo:content-width="3in" src="/files/ftp_upload/51729/51729fig2highres.jpg" width="400" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 2"> 
图 2. 去除颞肌后的经颅视图及大脑中动脉阻塞示意图。(A) 去除颞肌后，可通过部分半透明的小鼠颅骨观察皮层动脉（适用于8-12周龄小鼠）。在颞部视野的前部可识别出主要的大脑中动脉（MCA）分支，而在后部则可见从MCA和大脑后动脉（PCA）发出的其他皮层动脉分支。(B) 钻孔并去除颅骨后，在外侧颞皮层上大脑中动脉主干最常见的分支模式示意图，显示其典型的二分叉结构。(C) 黑色方块表示在分叉近端和远端两侧进行大脑中动脉凝固的位点。
<img alt="小鼠行为分析；前肢使用比例图；运动模式与恢复实验。" fo:content-width="4in" src="/files/ftp_upload/51729/51729fig3highres.jpg" width="500" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 3"> 
图3. 行为功能缺陷分析。（A） 圆筒实验装置：将小鼠放入垂直的圆筒中，并在后方放置镜子，以便通过摄像机记录其所有运动。（B） 使用圆筒实验分析前肢使用不对称性。在MCAO前24小时及脑卒中诱导后的指定时间点，计算独立使用前肢的左右比例。N = 10，*p &lt; 0.05，表示指定时间点与基线（对照）值之间的差异。
<img alt="小鼠脑梗死分析；MRI切片、梗死体积图、梗死区域示意图。" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51729/51729fig4highres.jpg" width="500" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图4"> 
图4. 远端大脑中动脉闭塞（MCAO）后的体积性梗死分析及梗死结局。（A） MCAO术后7天典型的焦油紫染色冠状脑切片图像。黄色线标示对侧（右侧）皮层的选区，红色线标示同侧脑中未梗死（有染色）的皮层区域。左侧半球的苍白区域代表梗死组织区域。（B） 远端MCA凝闭后24小时、3天和7天时10个脑组织的梗死体积分析（每个点代表一个独立脑组织）。红色横线表示均值，误差线表示标准差。（C） MCA凝闭后7天，每隔400 µm的代表性焦油紫染色冠状脑切片。（D） MCAO术后7天梗死脑组织的示意图分布。每张切片显示了在特定脑区位置（相对于前囟）的梗死分布累积信息（按图示颜色编码）（修改自：Liesz A et al., Brain, 2011；经牛津大学出版社许可）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51729/51729fig4highres.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>

多种小鼠大脑中动脉闭塞（MCAO）模型广泛应用于实验性脑科学研究。本文展示了经颅永久性远端MCAO模型，该模型可产生稳定的皮质梗死，其大小与大多数人类缺血性卒中所造成的损伤相当。

中风是发达国家中导致死亡的第三大原因，也是成人获得性残疾的主要原因。目前仅有极少数治疗方法……

本实验的总体目标是通过电凝法永久阻断小鼠远端大脑中动脉，从而产生主要位于皮层、体积相对与人类脑卒中相当的梗死灶。该目标的实现首先需要在手术前评估动物肢体使用不对称性的基线水平，随后通过远端大脑中动脉电凝手术诱导脑卒中。手术后，通过评估四肢使用不对称性来检测局灶性感觉运动功能缺损。最后一步是利用结晶紫染色分析梗死体积。最终形成的皮层损伤范围适中且变异较小，这使得该技术成为基础与转化卒中研究中的一个重要模型。与其他常见卒中模型相比，该技术的主要优势在于此模型的死亡率极低，且梗死体积和定位具有高度可重复性。新皮层梗死代表了人类卒中的大多数情况，因此该模型具有重要的研究价值。初次接触该方法的研究人员，通常首先需要在轻柔去除颅骨以尽量减少机械性损伤方面进行练习和掌握技巧。其次，正确识别并恰当结扎远端中结肠动脉对该模型至关重要。首先，在开始手术前30分钟注射镇痛剂。打开小鼠的加热垫，并将温度设置为37摄氏度以进行手术。接下来，确保由70%氮气、30%氧气和异氟烷组成的麻醉气体已准备就绪。然后将小鼠置于诱导室中，暴露于4%异氟烷，直至其停止活动。随后将小鼠置于加热垫上，并以4%异氟烷继续麻醉一分钟。一分钟后，将异氟烷的流量调整至1.5%。现在通过脚趾夹捏法确认小鼠是否已充分麻醉，若确认麻醉充分，则使用剪刀将凡士林乙醇涂抹于眼睛表面。从耳部与眼部之间的区域开始，做一厘米长的切口，逐层分离皮肤并暴露颞肌。现在将高频发生器的功能设置为凝固模式，模式选择双极，功率设为12瓦，并连接镊子。在准备过程中，向暴露的颞肌滴加一滴生理盐水。然后使用电凝镊子从颅骨的顶端和远端部分分离颞肌。结果是得到一块松解的肌瓣。现在在透明的颅骨下方识别大脑中动脉（MCA）。它位于颞区的头侧部分，眶后窦的背侧。使用钻头在该动脉正上方钻薄颅骨，直至骨质变薄透亮。钻孔过程中需用生理盐水保持颅骨湿润。然后使用精细镊子小心去除骨质，以暴露大脑中动脉分支。将高频发生器调整至七瓦。现在使用电凝镊轻轻接触动脉进行凝固，注意不要夹持。在大脑中动脉（MCA）无分叉的解剖变异情况下，需在分叉近端和远端对动脉进行凝固；若无分叉，则尽可能在近端位置相距约一毫米的两个点进行凝固。等待30秒，然后用钝头镊子轻轻触碰动脉。接着，将肌肉复位至覆盖钻孔的位置。缝合伤口，并将动物置于32摄氏度的护理箱中，以恢复麻醉状态，随后将其放回笼中。通常，动物从麻醉状态恢复需要5到10分钟。圆筒实验用于检测动物是否更倾向于使用某一侧肢体。将动物放入一个透明的丙烯酸玻璃圆筒中，圆筒两侧以直角放置两面镜子。在圆柱体另一侧的两个镜子顶点相对位置，对动物进行五分钟的录像。每次试验结束后，使用60%乙醇擦拭圆柱体和桌面。之后，进行逐帧分析。通过计数大鼠完全直立时单侧前肢与圆筒接触的次数，以及单侧前肢着陆的次数来评分。每次完整的直立试验中，至少记录20次单侧前肢接触。将每只动物的大脑连续冠状切片，每隔400微米采集一片，每片厚度为20微米。将切片收集到载玻片上，于-20°C保存。采用此切片方案，可将一个大脑中覆盖梗死区域的所有切片置于同一张载玻片上。使用标准的克雷斯尔紫染色法对切片进行染色，以明确各脑切片中梗死组织的范围。随后可将切片封片、扫描，并采用Swanson法对水肿进行分析。由于大脑中动脉阻塞手术导致的校正死亡率低于5%，主要原因是蛛网膜下腔出血或麻醉不当。在观察期间无动物死亡。在本项用于PA分析的研究中，脑卒中诱导后通过圆柱体试验测量肢体不对称性，并与大脑中动脉阻塞前获得的基线值进行比较，结果显示在卒中后24小时出现显著的肢体不对称性，该不对称性在卒中发生后第一周内部分恢复。通过冠状面紫染色测量的诱导梗死体积平均为15.4立方毫米，约占单侧大脑半球的12%。该模型的标准差非常低，且梗死部位的变异性极小。一旦掌握，若操作得当，该手术可在10分钟内完成。除了演示的圆筒实验和结晶紫染色外，还可采用其他已建立的行为学测试和组织学方法，以进一步表征实验结果并解答特定的研究问题。观看本视频后，您应能充分理解如何在小鼠中实施永久性远端大脑中动脉阻塞。我们强烈建议使用标准操作程序和详细记录，以确保该方法的可重复性。

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