Name: 注重形成：一个基于Cell的检测，以确定一个基因的致癌性 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-12-31T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 18 s
Description: 学习使用逆转录病毒载体在NIH 3T3小鼠成纤维细胞中进行集落形成实验，以评估候选癌基因的转化潜能和致癌性。该方法通过结晶紫染色定量细胞集落数量，为癌症生物学研究提供直观的细胞转化可视化结果。

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本研究由美国国立卫生研究院（NIH）院长新创新者奖计划资助（E.D.）。A. A. 部分获得了美国国家癌症研究所和美国国家科学基金会本科生奖项的支持。

1. 病毒载体的制备
目的基因以及阳性和阴性对照的编码序列通过传统克隆方法（PCR扩增、限制性酶切和连接）插入到pBABEpuro载体中。该载体上有四个可用于插入DNA的限制性酶切位点：BamHI、SnaBI、EcoRI和SalI。
<ol>
	<li>使用QIAGEN质粒中量提取试剂盒，从感受态细胞中制备转染级质粒DNA。</li>
	<li>使用NanoDrop2000分光光度计测定DNA浓度。</li>
</ol>
2. 逆转录病毒的制备
将使用Plat-E包装细胞系产生嗜同性逆转录病毒，以将目的cDNA递送至NIH 3T3细胞。
<ol>
	<li>从冻存细胞建立 Plat-E 细胞培养
	<ol>
		<li>将 Plat-E 细胞在 37 °C 水浴中快速解冻，并转移至 15 ml 圆底离心管中。缓慢加入 9 ml Plat-E 培养基（DMEM 培养基 + 10% 胎牛血清 (FBS) + 青霉素和链霉素）。</li>
		<li>以 180 × g 离心 5 分钟，弃去上清液。</li>
		<li>用 10 ml Plat-E 培养基重悬细胞，并转移至 10 cm 培养皿中。</li>
		<li>将细胞置于 37 °C、5% CO2 培养箱中培养，直至细胞融合度达到 80–90%（约 2 天）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>细胞传代
	<ol>
		<li>吸除培养基，用 PBS 洗涤细胞一次。</li>
		<li>加入 2 ml 0.05% 胰蛋白酶-EDTA，在室温下孵育 1 分钟。</li>
		<li>轻弹培养皿使细胞脱落，加入 10 ml Plat-E 培养基，将细胞悬液转移至 15 ml 离心管中。</li>
		<li>以 180 × g 离心 5 分钟，弃去上清液。</li>
		<li>用 10 ml Plat-E 培养基重悬细胞，并按 1:4 至 1:6 的比例接种至新的培养皿中。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Plat-E 细胞接种与转染
	<ol>
		<li>使用不含抗生素的 Plat-E 培养基，按每 10 cm 培养皿接种 2 × 106 个细胞。</li>
		<li>将细胞置于 37 °C、5% CO2 培养箱中过夜培养。</li>
		<li>次日，将 300 μl Opti-MEM 转移至 1.5 ml 微量离心管中。</li>
		<li>向含 Opti-MEM 的离心管中加入 27 μl 聚乙烯亚胺（PEI），一种经济高效的转染试剂12，轻轻弹击混匀，室温孵育 5 分钟。</li>
		<li>向 Opti-MEM/PEI 混合液中加入 9 μg 高纯度质粒 DNA，轻轻涡旋混匀，室温孵育 15 分钟。</li>
		<li>将 DNA/PEI 复合物逐滴加入 Plat-E 培养皿中，在 37 °C、5% CO2 条件下过夜孵育&#160;。</li>
		<li>次日，吸除含转染试剂的培养基，加入 10 ml 新鲜的 Plat-E 培养基（不含抗生素）。</li>
		<li>将细胞放回培养箱继续培养。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. NIH 3T3 细胞及感染
<ol>
	<li>建立 NIH 3T3 细胞培养物并进行接种
	<ol>
		<li>在 37 °C 水浴中快速解冻 NIH 3T3 细胞，并转移至 15 ml 离心管中。缓慢加入 9 ml NIH 3T3 培养基（DMEM + 10% FBS）。</li>
		<li>以 180 × g 离心 5 分钟，弃去上清液。</li>
		<li>用 10 ml NIH 3T3 培养基重悬细胞，并转移至 10 cm 培养皿中。</li>
		<li>将细胞置于 37 °C、5% CO2 的培养箱中孵育。必须始终使 NIH 3T3 细胞保持低密度（50–60%），因为一旦培养物达到汇合状态，其自发转化频率（从而基础水平的集落形成）会显著增加。</li>
		<li>每 10 cm 培养皿接种 3 × 105 个细胞，过夜孵育，次日用于感染。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>感染
	<ol>
		<li>使用 10 ml 一次性注射器收集 Plat-E 培养皿中的逆转录病毒上清液，经 0.45 μm 孔径的尼龙膜滤器过滤后，转移至 15 ml 离心管中。</li>
		<li>向细胞中加入 10 ml 新鲜的 Plat-E 培养基（不含抗生素），并将培养皿放回培养箱。</li>
		<li>吸去待感染的 NIH 3T3 细胞培养皿中的培养基，加入 5 ml 正常 NIH 3T3 培养基和 5 ml 含病毒的过滤上清液。</li>
		<li>以 6 μg/ml 的终浓度向培养皿中加入 polybrene。</li>
		<li>在 37 °C、5% CO2 条件下过夜孵育细胞。</li>
		<li>次日，重复步骤 3.2.1 – 3.2.5，进行第二轮感染。</li>
		<li>将含病毒的培养基更换为正常的 NIH 3T3 培养基。</li>
		<li>让 NIH 3T3 细胞继续生长 2–3 周，根据需要更换培养基。通过平行培养板的全细胞裂解物进行常规蛋白质电泳和免疫印迹，检测目标蛋白的表达情况。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 染色与定量
<ol>
	<li>结晶紫染色
	<ol>
		<li>吸除 NIH 3T3 培养基，将培养皿置于冰上。</li>
		<li>用预冷的 PBS 洗涤培养皿两次。</li>
		<li>用预冷的甲醇固定细胞 10 分钟。</li>
		<li>将培养皿从冰上取出，吸除甲醇，并加入 3 ml 溶于 25% 甲醇中的 0.5% 结晶紫溶液（室温）。</li>
		<li>室温孵育 5 分钟。</li>
		<li>吸除结晶紫溶液，用 Milli-Q H2O 小心冲洗培养皿，直至冲洗液无色。</li>
		<li>将培养皿在实验台上静置过夜干燥&#160;（不加盖）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>克隆灶定量
	<ol>
		<li>待培养皿完全干燥后，使用直尺测量培养板上深色的细胞集落。仅将直径大于 5 mm 的集落计为“克隆灶”。记录克隆灶数量，并计算相对于对照组的平均值及显著性差异。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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<li>Barisone, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+MXD3+in+proliferation+of+DAOY+human+medulloblastoma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Role of MXD3 in proliferation of DAOY human medulloblastoma cells.</a> PloS One. 7, e38508(2012).</li>
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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

FFA 提供了一种快速简便的方法来评估恶性转化 体外适用于筛选相对大量的候选基因，且其技术要求较低，具有较高的成本效益。此外，可同时共表达两个或更多基因（有时称为“协同作用”检测），以评估基因组合的致瘤潜力。该检测的优势在于操作简便、易于定量以及相对较短的实验周期。然而必须强调的是，该方法也具有所有此类实验共有的局限性 体外 检测。该检测通过测量癌细胞的一种表型特征——即在培养皿中生长超出单层的能力——来评估致癌转化。因此，阴性结果应谨慎解读，因为特定的癌基因可能在不促进该特定表型的情况下诱导转化，或需要与其他基因共表达才能发挥作用。即上述合作）。此时，建议通过其他方法评估转化效果 体外 方法，例如通过软琼脂实验测定增殖速率、血清需求和/或非贴壁依赖性生长能力。
尽管焦点形成分析（FFA）技术较为直接，但仍需遵守若干条件。最重要的是，必须使用自发转化率极低的3T3细胞亚克隆。由于该细胞系具有前癌变特性（这一特征使其对本实验极为敏感），某些冻存管中可能已含有大量预先转化的细胞，导致实验本底水平过高而无法接受。为最...

肿瘤细胞与其正常对应细胞相比，在多个层面表现出广泛差异，包括基因表达模式、表观基因组、形态学及增殖特性等方面的改变。其中，血清依赖性降低、接触（密度）抑制丧失、获得锚定非依赖性增殖能力，以及在接种于动物体内后能够形成肿瘤，均为可测量且有效的恶性转化指标。3. 几个 体外 和 体内 已开发出用于细胞转化的检测方法。 体外 检测旨在鉴定和测量培养物形态的变化（集落形成实验）、培养物动态（生长速率、饱和密度）以及生长因子（低血清条件下的生长）或贴壁依赖性（软琼脂中的生长）需求的变化。确定细胞类型恶性特征的金标准仍然是在实验动物中形成肿瘤（异种移植）。然而，其成本高昂且耗时较长 体内 研究并不总能证明将它们作为候选癌基因的初步验证步骤或筛选方法是合理的。尽管没有 体外 该检测虽不能对基因的致癌潜能提供明确评估，但可提供有关致癌潜能的见解，有助于缩小未来研究范围 体内 研究中，用于评估致癌潜能的最常用系统之一 体外 是焦点形成实验2该方法依赖于使用 NIH 3T3 小鼠成纤维细胞，这是一种非转化细胞系，具有强烈的接触抑制特性。癌基因过表达会导致密度依赖性生长的丧失；转化后的细胞可在多个层面上生长，形成“集落”，在未转化细胞的单层背景上易于观察。因此，集落形成实验（Focus Formation Assay）通过接触抑制丧失这一可测量的表型，来评估候选癌基因诱导恶性转化的能力。FFA 已被用于评估蛋白激酶过表达所引起的转化例如，Src4，BRAF5），转录因子（例如，N-myc6），G蛋白偶联受体（例如P2RY87）和GTP酶（例如Ras1），以及其他方法。该检测方法操作相对简便，是验证基因过表达是否足以转化NIH 3T3小鼠成纤维细胞的理想选择，可快速获得直观明确的结果。 体外.
本实验方案中描述的 FFA 采用了 Plat-E 包装细胞系8，该细胞系可提供病毒包装蛋白，并结合逆转录病毒载体 pBABEpuro9（Addgene 质粒 1764）来产生逆转录病毒。将含有目的基因的 pBABEpuro 构建体转染至 Plat-E 细胞系后，该细胞系将产生嗜同种逆转录病毒，可用于感染 NIH 3T3 细胞。这种病毒介导的基因递送方法比传统的化学转染方法更高效，并可实现目的基因的稳定表达10。一旦目的基因整合至 NIH 3T3 细胞的基因组中，其过表达将由病毒长末端重复序列（LTR）启动子驱动11。这种持续性表达可用于检测目的基因是否具有致癌活性，其判断依据为 NIH 3T3 细胞中是否形成集落（foci）。

<table><tbody><tr><td>pBABE-puro 载体</td><td>Addgene</td><td>质粒 1764</td><td>克隆载体</td></tr><tr><td>Platinum-E 逆转录病毒包装细胞系，嗜同种型</td><td>Cell Biolabs, Inc.</td><td>RV-101</td><td>用于病毒生产的细胞系</td></tr><tr><td>NIH 3T3 小鼠细胞系</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>93061524</td><td>用于集落形成实验的细胞系</td></tr><tr><td>10 ml BD Luer-Lok 尖端注射器</td><td>BD Biosciences</td><td>309604</td><td>病毒生产试剂</td></tr><tr><td>0.45 &amp;mu;m Puradisc 注射器滤器</td><td>Whatman</td><td>6750-2504</td><td>病毒生产试剂</td></tr><tr><td>聚乙烯亚胺（PEI）</td><td>Polysciences, Inc.</td><td>23966-2</td><td>细胞转染试剂</td></tr><tr><td>Polybrene 感染/转染试剂</td><td>EMD Millipore</td><td>TR-1003-G</td><td>细胞转染试剂</td></tr><tr><td>结晶紫</td><td>Fisher Scientific</td><td>C581-25</td><td>细胞染色试剂</td></tr><tr><td>质粒大提纯化试剂盒（Plasmid Plus Midi Kit）</td><td>QIAGEN</td><td>12945</td><td>质粒纯化</td></tr><tr><td>BD Falcon 组织培养皿</td><td>BD Biosciences</td><td>353003</td><td>细胞培养耗材</td></tr><tr><td>杜氏改良伊格尔培养基（DMEM）</td><td>Gibco</td><td>11995-065</td><td>细胞培养基</td></tr><tr><td>0.05% 胰蛋白酶-EDTA</td><td>Gibco</td><td>25300-054</td><td>细胞培养耗材</td></tr><tr><td>Opti-MEM I 低血清培养基</td><td>Gibco</td><td>31985-062</td><td>细胞培养基</td></tr><tr><td>胎牛血清（FBS）</td><td>Gibco</td><td>16000-044</td><td>细胞培养基</td></tr></tbody></table>

焦点形成：一种基于细胞的检测基因致癌潜能的实验方法

Focus Formation: A Cell-based Assay to Determine the Oncogenic Potential of a Gene

细胞的恶性转化通常与增殖能力增强、接触抑制丧失、获得锚定非依赖性生长潜能以及在实验动物体内形成肿瘤的能力相关1。在NIH 3T3细胞中，Ras信号转导通路已知可触发上述多种事件，即所谓的Ras转化。将一个过表达的基因导入NIH 3T3细胞，可能促进细胞形态学转化和接触抑制的丧失，从而有助于判断该目的基因的致癌潜能。一种用于评估癌基因转化潜能某一方面的简便方法是焦点形成实验（Focus Formation Assay, FFA）2。当NIH 3T3细胞在培养中正常分裂时，其增殖至形成融合的单层即停止。然而，在存在过表达癌基因的情况下，这些细胞可开始以密集的多层灶状结构生长1，可通过结晶紫或Hema 3染色进行观察和定量。本文描述了通过逆转录病毒转导将目的基因导入NIH 3T3细胞的FFA实验方案，以及如何通过染色对灶状结构数量进行定量。相较于转染，逆转录病毒转导是一种更高效的基因递送方法，而使用嗜鼠性逆转录病毒可在操作潜在的人类癌基因时提供生物安全控制。

MXD3 是一种碱性螺旋-环-螺旋-亮氨酸拉链（bHLHZ）转录因子，属于 MYC/MAX/MAD 调控网络。它是 MAD 家族中一种非典型的成员13-15，已被报道参与致癌过程16,17。与 pBABEpuro（阴性对照）和 MYC（阳性对照）相比，过表达 MXD3 的 NIH 3T3 培养皿中形成的灶状集落显著减少（图 1A）。图 1B 中的数据来自多次实验，用于确定统计学显著性。
最初人们关注MXD3的致癌潜能，是因为它具有与已知癌基因MYC相似的活性。然而，本实验的结果表明，MXD3并不发挥癌基因的功能。
<img alt="菌落计数实验；MYC基因对细胞增殖的影响；柱状图；实验结果。" src="/files/ftp_upload/51742/51742fig1.jpg" data-altupdatedat="17876304080...

焦点形成实验提供了一种简单直接的方法，用于评估候选癌基因的转化潜能。

细胞的恶性转化通常与增殖能力增强、接触抑制丧失以及获得锚定非依赖性生长特性等相关。

本实验的总体目标是利用逆转录病毒在小鼠成纤维细胞系中进行集落形成实验，以评估某个基因的致癌潜能。该目标首先通过将目的基因序列克隆至逆转录病毒载体中来实现；第二步是利用该病毒载体和PLA e包装细胞产生逆转录病毒颗粒。接下来，利用逆转录病毒转导 NIH 3T3 小鼠成纤维细胞，以评估目的基因的转化潜能。最后一步是让 NIH 3T3 细胞分裂两到三周，随后进行结晶紫染色，以定量形成的集落数量。最终，集落形成实验用于验证目的基因的过表达是否足以诱导小鼠成纤维细胞产生密度非依赖性生长。该方法有助于回答癌症生物学领域中的关键问题，例如筛选某个基因的致癌潜能。首先，按照文本方案构建病毒载体。随后，从冻存细胞中建立Plat E细胞培养物：将Plat E细胞在37摄氏度水浴中快速解冻，然后转移至15毫升锥形管中。向15毫升锥形管中缓慢加入9毫升PLA E培养基，在180 × g条件下离心5分钟，弃去上清液。用10毫升plat E培养基重悬细胞，转移至10厘米培养皿中。然后将细胞置于37摄氏度、5% CO2培养箱中孵育，直至细胞融合度达到80%至90%。进行细胞传代时，先吸除培养基，用PBS洗涤细胞一次，随后加入2毫升0.05%胰蛋白酶-EDTA，室温孵育1分钟，通过轻敲培养容器使细胞脱落。然后加入10毫升Plat E培养基，将细胞悬液转移至15毫升离心管中。将离心管如前所述进行离心，并用10毫升plat E培养基重悬细胞。随后，使用不含任何抗生素的plat E培养基，按每10厘米培养皿200万个细胞接种，并将细胞置于培养箱中过夜孵育。次日，将300微升OptiMEM转移至1.5毫升微量离心管中。向含有Optum的预装试管中加入27微升聚乙烯胺。用手指轻弹试管混匀，室温孵育5分钟。接着，向试管中加入9微克转染级质粒DNA，轻轻涡旋混匀，室温孵育15分钟。然后将混合物逐滴加入培养皿中，随后过夜孵育。次日，吸除含有转染试剂的培养基，并加入10毫升新鲜的plat E培养基，再将细胞放回培养箱中以建立NIH 3T3细胞系。首先，在37摄氏度水浴中快速解冻细胞，然后转移至15毫升离心管中。缓慢向细胞中加入9 mL NIH 3T3培养基，以180 ×g离心5分钟，弃去上清液。然后用10 mL NIH 3T3培养基重悬细胞，转移至10 cm培养皿中。将细胞置于37 °C、5% CO2培养箱中孵育，保持细胞亚融合状态，因为自发转化频率会随之增加。当细胞培养至融合度达到一定水平，且生长密度达到每10厘米培养皿3 × 10⁵个NIH 3T3细胞后，于次日进行感染前，先将细胞继续培养过夜。次日，使用10毫升一次性注射器从Plat E培养皿中收集逆转录病毒上清液，经0.45微米孔径的尼龙膜过滤器过滤后，转移至15毫升离心管中。将细胞补加10毫升新鲜的Plat E培养基后，放回培养箱继续培养。然后吸出待感染的 NIH 3T3 细胞培养皿中的培养基，加入 5 毫升常规 NI H 3T3 培养基和 5 毫升含有病毒的过滤上清液。接着向培养皿中加入 polybrene，终浓度为 6 微克/毫升。将细胞孵育过夜，然后重复感染步骤进行第二轮感染。感染后，用常规的IH三T三培养基替换含有病毒的培养基。让IH三T三细胞生长两到三天，根据需要更换培养基，以进行结晶紫染色。吸去 NIH 3T3 培养基，将培养皿置于冰上。用预冷的 PBS 洗涤培养皿两次。用预冷的甲醇固定细胞 10 分钟。然后将培养皿从冰上取出，吸去甲醇。加入3毫升用25%甲醇配制的0.5%结晶紫溶液，在室温下孵育5分钟。孵育结束后，吸去结晶紫溶液，并用Milli-Q水小心冲洗培养皿，直至冲洗液中无颜色脱落为止。将培养皿在实验台面上敞口放置过夜，使其自然干燥。培养皿干燥后，使用直尺测量病灶大小，并计数直径大于五毫米的病灶。MXD3 是一种基本螺旋-环-螺旋-亮氨酸拉链转录因子，属于 MAD 家族中的非典型成员，已有报道表明其在致癌过程中发挥作用，相较于阴性对照和阳性对照可见此现象。在MXD3过表达的NIH 3T3培养皿中，集落形成显著减少。数据来自多次实验，以确定其显著性，且该检测中观察到了相同趋势。结果表明，按照此实验流程，MXD3不发挥癌基因功能。为了进一步探究目的基因在肿瘤发生和致病过程中的作用，还可开展其他实验方法，例如基因组合的集落形成实验、软琼脂增殖实验以及细胞周期分析。

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从小鼠横纹肌肉瘤原代肿瘤细胞中分离肿瘤球并进行处理

内在无序结构域对致癌融合转录因子的功能具有重要作用。为了靶向治疗这些蛋白，需要更深入地理解这些结构域所采用的调控机制。本文中，我们利用转录组学方法，绘制尤因肉瘤中内在无序的 EWS...

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学习使用逆转录病毒载体在NIH 3T3小鼠成纤维细胞中进行集落形成实验，以评估候选癌基因的转化潜能和致癌性。该方法通过结晶紫染色定量细胞集落数量，为癌症生物学研究提供直观的细胞转化可视化结果。

焦点形成：一种基于细胞的检测基因致癌潜能的实验方法

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