焦点形成：一种基于细胞的检测基因致癌潜能的实验方法

本实验的总体目标是利用逆转录病毒在小鼠成纤维细胞系中进行集落形成实验，以评估某个基因的致癌潜能。该目标首先通过将目的基因序列克隆至逆转录病毒载体中来实现；第二步是利用该病毒载体及PLA e包装细胞产生逆转录病毒颗粒。

接下来，利用逆转录病毒转导 NIH 3T3 小鼠成纤维细胞，以评估目的基因的转化潜能。最后一步是让 NIH 3T3 细胞分裂两到三周，随后进行结晶紫染色，以定量形成的集落数量。最终，集落形成实验用于验证目的基因的过表达是否足以诱导小鼠成纤维细胞产生密度非依赖性生长。

该方法有助于解答癌症生物学领域中的关键问题，例如筛选某个基因的致癌潜能。首先，按照文本方案所述构建病毒载体。然后，通过在37摄氏度水浴中快速解冻plat E细胞，再转移至15毫升锥形管中，建立plat E细胞培养物。

缓慢加入9毫升PLA E培养基至15毫升锥形管中。以180 × g离心5分钟，弃去上清液。用10毫升plat E培养基重悬细胞，转移至10厘米培养皿中。

然后将细胞置于37°C、5% CO2的培养箱中孵育，直至细胞融合度达到80%至90%。进行细胞传代时，先吸除培养基，用PBS洗涤细胞一次，然后加入2 mL 0.05%胰蛋白酶EDTA，室温孵育1分钟，通过轻敲培养容器使细胞脱落。随后加入10 mL培养基，将细胞悬液转移至15 mL离心管中。

将离心管如前所述进行离心，并用10毫升plat E培养基重悬细胞。随后，使用不含任何抗生素的plat E培养基，按每10厘米培养皿200万个细胞接种，置于培养箱中过夜孵育。次日，将300微升OptiMEM转移至1.5毫升微量离心管中。

向含有Optum的预装试管中加入27微升聚乙烯胺。轻轻弹击管壁混匀，并在室温下孵育5分钟。随后，向试管中加入9微克转染级质粒DNA，通过涡旋轻轻混匀，并在室温下孵育15分钟。

然后将混合物逐滴加入培养皿中，随后过夜孵育。次日，吸除含有转染试剂的培养基，并加入10毫升新鲜的plat E培养基，然后将细胞放回培养箱以建立NIH 3T3细胞系。首先，在37摄氏度水浴中快速解冻细胞，并转移至15毫升离心管中。

缓慢向细胞中加入九毫升 NIH 3T3 培养基，以 180 ×g 离心五分钟，弃去上清液。随后用 10 毫升 NIH 3T3 培养基重悬细胞，并转移至 10 厘米的培养皿中。将细胞置于 37°C、5% CO₂ 的培养箱中孵育，保持细胞亚融合状态，因为自发转化频率会随之增加。

当细胞培养至汇合时，待其生长至每10厘米培养皿中含3×10⁵个T3细胞，孵育过夜，以备次日进行感染。次日，使用10毫升一次性注射器从Plat E培养皿中收集逆转录病毒上清液，经0.45微米孔径的尼龙膜滤器过滤后，转移至15毫升离心管中。将细胞补加10毫升新鲜Plat E培养基后，放回培养箱继续培养。

然后吸除待感染的 NIH 3T3 细胞培养皿中的培养基，加入 5 毫升常规 NI H 3T3 培养基和 5 毫升含有病毒的过滤上清液。接着向培养皿中加入 polybrene，终浓度为 6 微克/毫升。

将细胞孵育过夜，然后重复感染步骤进行第二轮感染。感染后，用常规的IH3T3培养基替换含病毒的培养基。让IH3T3细胞生长2至3天，根据需要更换培养基，以进行结晶紫染色。

吸去 NIH 3T3 培养基，将培养皿置于冰上。用预冷的 PBS 洗涤培养皿两次。用预冷的甲醇固定细胞 10 分钟。

然后将培养皿从冰上取下，吸去甲醇。加入3毫升用25%甲醇配制的0.5%结晶紫溶液，在室温下孵育5分钟。孵育结束后，吸去结晶紫溶液，并用Milli-Q水小心冲洗培养皿，直至冲洗液中无颜色脱落为止。

将培养皿在实验台面上敞口放置过夜使其自然干燥。培养皿干燥后，使用直尺测量集落大小，并计数直径大于五毫米的集落。MXD3 是一种碱性螺旋-环-螺旋-亮氨酸拉链转录因子，属于 MAD 家族中的非典型成员，已有报道表明其在致癌过程中发挥作用，相较于阴性对照和阳性对照。

在NIH 3T3细胞中过表达MXD3的培养皿中，集落形成显著减少。这些数据来自多次实验，以确定其显著性，且该检测中观察到了相同趋势。结果表明，按照此实验流程，MXD3并不发挥癌基因的功能。

为了进一步探究目的基因在肿瘤发生和致病过程中的作用，还可进行其他实验方法，如基因组合的集落形成实验、软琼脂增殖实验以及细胞周期分析。