小鼠皮肤平铺成像及其在毛囊排列模式与感觉轴突形态分析中的应用

本实验的总体目标是在不进行物理切片的情况下，完整地观察皮肤结构，例如毛囊和神经末梢。该目标首先通过采集来自不同身体部位的皮肤组织来实现，包括背部、后肢足部和尾部。第二步是将皮肤样本压平并清洗干净。

接下来将皮肤样本进行适当的固定处理。最后一步是在皮肤样本上进行免疫染色或组织化学染色。最终，通过解剖显微镜或共聚焦显微镜成像，以观察各种皮肤结构的形态特征。

与现有的表皮激素封片制备等方法相比，该技术的主要优势在于可应用于身体任何部位的皮肤，且无需将表皮与真皮分离。该方法有助于解答足底细胞极性研究中的关键问题。由于皮肤的二维几何结构以及毛囊的特殊排列方式使其成为研究该过程的理想体系，因此该方法不仅能为植物细胞极性研究提供见解，还可用于研究皮肤发育的其他方面，例如通过直接观察单个神经末梢在上层形态中的分布来定义体感神经元类型。

该方法的可视化演示至关重要，因为从某些部位（如足部和尾部）解剖皮肤较难掌握，而将其完全展平并避免皱褶和过度拉伸尤为关键。在本演示中，将从三只经异氟烷吸入麻醉后实施安乐死的小鼠采集背部皮肤。使用刀片从尾部基底沿两侧体壁做水平切口，经四肢基部背侧，侧向延伸至耳部，最终止于鼻部。

用戴着手套的手指轻轻捏住皮肤，从后向前将皮肤与下方组织分离，避免使用镊子夹紧皮肤造成损伤。在耳部水平剥离皮肤时，应先用剪刀剪除耳朵，并特别缓慢操作，因为此处皮肤容易撕裂。此后，将皮肤内面朝上放置。

用约20枚昆虫针将皮肤均匀地固定在S型支架周围，针距分布均匀。切勿过度拉伸皮肤。使用弯头或弧形镊子将10至20毫升PBS覆盖于皮肤表面。

剥离与皮肤相关的脂肪和结缔组织。将镊子的尖端水平朝向，以尽量降低镊子刺穿皮肤的风险。用棉签轻轻在皮肤表面滚动，排出被困在皮肤下方的任何气泡。

下一步是固定针状皮肤。如果皮肤将用于黑色素成像或碱性磷酸酶组织化学染色，请每10厘米培养皿加入20毫升新配制的4% PFA-PBS或10%缓冲福尔马林。如果皮肤将用于免疫染色或观察转基因角蛋白KRT17-GFP，请每10厘米培养皿加入20毫升新配制的2% PFA-PBS，在4°C冰箱中轻轻旋转过夜。次日，在PBS中洗涤超过10分钟。

本视频中不会演示碱性磷酸酶组织化学的实验步骤。对于黑色素成像，将皮肤置于梯度乙醇溶液中逐级脱水，每个步骤一天，在室温下轻轻水平旋转。三天后，将脱水后的皮肤置于100%乙醇中，去除残留的结缔组织。

移除昆虫针，并将皮肤转移至直径为10厘米的玻璃培养皿中。为确保本操作成功，皮肤样本必须完整取下，并完全展平。在皮肤上放置两片玻璃载玻片，以压平组织并防止其卷曲。

加入20毫升苯甲酰基苯甲酸酯和苯甲醇（BBBA），该试剂将在接下来的数小时内迅速使组织硬化。将切片从皮肤上抬起数秒，以使BBBA充分流过皮肤表面。用于毛囊模式分析的足部皮肤通常在动物处死后从出生后第1天（P1）至第8天（P8）的个体中获取，切除踝关节以上的足部，并沿足底腹侧表面做一条直线切口。

轻轻剥离皮肤，从近端向远端方向分离皮下组织。剪开脚趾以释放皮肤，并将皮肤内面朝上用针固定在蜡盘上。足部的结缔组织极少。

皮肤转基因。KRT17 GFP 皮肤现已准备好用于黑色素成像。安乐死处理 P21 动物后，通过涂抹脱毛剂去除毛发，然后按照之前展示的背部皮肤方法对皮肤进行固定和处理。

用戴手套的手指和拇指在皮肤表面涂抹凝胶，静置10分钟。用自来水冲洗皮肤表面。随后按照之前所示方法，将足部皮肤解剖并固定于S型支架上。

在室温下用1% P-F-A-P-B-S固定30分钟，然后用PBS洗涤。制备尾部皮肤时，在尾根部做一圈环形切口，然后沿尾腹面全长做一纵向切口。用一对镊子牢固夹住尾椎末端或结缔组织，另一对镊子夹住皮肤，从尾尖开始剥离尾部皮肤。

将尾部皮肤固定于SIL保护垫上，用于分析黑色素分布和毛囊方向。在固定前，按照背部皮肤的示例方法对皮肤进行固定和处理，以用于皮脂腺分析。将尾部皮肤切成一系列长约0.5至1厘米的片段，并将皮肤组织块在含5毫摩尔EDTA的磷酸盐缓冲液（PBS）中于37摄氏度孵育过夜。

为了在第二天减弱真皮与表皮之间的黏附，轻轻将表皮从真皮上剥离。将表皮界面朝上固定于S型支架上，并在4% PFA-PBS中室温固定1小时。随后用PBS洗涤表皮，并按照方案文本所述使用油红O进行染色。

使用解剖显微镜观察浸没在BBBA中、置于载玻片下压平且仍位于玻璃培养皿中的背部足部或尾部皮肤。该方法可最大限度减少BBBA对显微镜的污染。从下方照亮培养皿，以尽量减少视野内光照强度的空间差异。

将玻璃培养皿抬升至解剖显微镜标准工作台面以上约10厘米的高度，并在光源上方放置一块漫射用的塑料或玻璃板。成像完成后，将皮肤组织放回100%乙醇中，于-20摄氏度条件下长期保存。为准备碱性磷酸酶染色皮肤的成像，将其置于两块用于小型蛋白质凝胶的玻璃板之间。

注意避免在玻片与皮肤之间引入气泡。用纸巾小心吸去多余的BBBA。将这种玻片-皮肤-玻片的夹心结构放置在显微镜载物台上。

使用10倍物镜，结合明场或微分干涉（DIC）照明，以2微米或5微米的Z轴步长进行成像。利用机械化的XY载物台，采集多幅XY图像并拼接，生成单一的三维灰度数据集。采用多种软件包中的任意一种，对轴突分支进行半自动追踪。

皮肤平铺样本的明场成像可用于观察单个皮肤感觉神经分支，图中显示了其追踪图像。明场成像还可基于黑色素沉着来可视化毛囊的排列模式。这些图像展示了野生型小鼠和卷曲受体6基因敲除小鼠的P1期皮肤，以及卷曲受体6基因敲除小鼠的P7期皮肤。

皮肤平铺样本的光学显微成像可用于定义皮脂腺及其尾部的几何结构。使用油红O染色显示，与野生型背侧足部皮肤相比，卷曲受体6基因敲除小鼠的皮脂腺结构紊乱。皮肤样本取自携带GFP标记的角蛋白KRT17（KRT17-GFP）并经油红O染色的野生型和卷曲受体6基因敲除小鼠。

Red O 显示，敲除皮肤的中心存在毛流漩涡。通过 KRT17 GFP 及抗 GFP 免疫染色和立毛肌标记对皮肤平铺样本进行共聚焦成像，还可明确毛囊的几何结构。眼肌则通过抗平滑肌肌动蛋白免疫染色进行可视化。

通过抗细胞角蛋白8抗体或AM 1-43染料摄取来可视化Merkel细胞簇，其中央毛囊则通过KRT17-GFP进行可视化。与正常朝向前侧开放的结构不同，Frizzled six基因敲除后的Merkel细胞簇形成一个闭合的环状结构。一旦掌握操作技巧，若操作得当，一次解剖可在大约30分钟内完成，且可在数天至一周内完成多个样本的制备。观看本视频后，您应能充分理解如何从身体不同区域采集皮肤组织，以及如何制备样本以在整体组织切片（hormone格式）中观察不同的皮肤结构。皮肤结构的全层、高分辨率图像可通过标准的亮视野显微镜和共聚焦显微镜获取。

请注意，使用多聚甲醛和BBBA可能存在极高危险性。应尽量减少吸入其蒸气，将这些溶液保存在带盖容器中，并避免与皮肤接触。切勿让BBBA接触塑料材料。