小鼠皮肤及其毛囊图案和感觉轴突形态分析中的应用平山成像

哺乳动物的皮肤中含有结构的多样化 - 如毛囊和神经末梢 - 表现出独特的空间组织模式。作为平坦安装分析皮肤借此组织的2维几何的优点，以产生皮肤结构的全厚的高清晰度图像。

该程序的总体目标是在不对样本进行物理切片的情况下，将毛囊和神经末梄等皮肤结构完整可视化。这是通过首先从身体的各个区域收集皮肤来实现的，包括后、后、爪和尾。第二步是压平和清洁皮肤样本。

接下来，对皮肤样本进行适当的固定。最后一步是对皮肤样本进行免疫染色或组织化学。最终，使用解剖或共聚焦显微镜进行成像，以可视化各种皮肤结构的几何形状。

与表皮激素镶嵌制备等现有方法相比，该技术的主要优点是它可以应用于身体任何位置的皮肤，并且不需要将表皮与真皮分离。这种方法可以帮助回答足底细胞极性研究中的关键问题。由于皮肤的二维几何形状和毛囊的奇特排列使皮肤成为研究这一过程的理想系统，因此这种方法不仅可以深入了解植物细胞极性，还可以应用于研究皮肤发育的其他方面，例如基于直接可视化个体作用的体感神经元类型上层形态。

这种方法的视觉演示至关重要，因为从某些区域（如脚和尾巴）解剖皮肤很难学习，将它们完美地压平并避免皱纹和过度拉伸很重要。在这个演示中，将从 P 三只被 isof fluorine 安乐死的小鼠中收集背部皮肤。吸气使用刀片从尾巴底部沿每个侧面进行水平切割，从每个肢体底部的背侧穿过耳朵的侧面，到鼻子结束。

用戴手套的手指夹住皮肤，轻轻地从从后到前的底层组织剥落皮肤，以免被镊子夹住。先在耳朵水平剥皮时，用剪刀剪掉耳朵，并且要特别缓慢，因为皮肤可能会在这个位置撕裂。从这时起，调整皮肤内侧朝上的方向。

大约 20 个昆虫针均匀分布在外围，将皮肤固定在 S Guard 上。不要过度拉伸皮肤。使用倾斜或弯曲的镊子用 10 至 20 毫升 PBS 覆盖皮肤。

解剖掉皮肤相关的脂肪和结缔组织。将镊子的尖端水平面对，以最大限度地降低镊子穿透皮肤的风险。通过在皮肤表面轻轻滚动棉签涂抹器，挤出被困在皮肤下的任何气泡。

下一步是修复 pin 皮肤。如果皮肤将用于黑色素成像或碱性磷酸酶组织化学，则每 10 厘米雪茄板添加 20 毫升新鲜制备的 4%P-F-A-P-B-S 或 10% 缓冲福尔辛。如果皮肤将用于免疫染色或可视化转基因角蛋白，KRT 17 GFP 每 10 厘米 sogar 板添加 20 毫升新鲜制备的 2%P-F-A-P-B-S 第二天在冷藏室中轻轻旋转过夜，在 PBS 中洗涤超过 10 分钟。

本视频中不会演示碱性磷酸酶组织化学的程序。对于黑色素成像，每个步骤通过分级乙醇系列一天使皮肤脱水，并在室温下轻轻水平旋转。三天后，用 100% 乙醇溶液去除脱水皮肤上残留的结缔组织。

取下虫针，将皮转移到直径为 10 厘米的玻璃皿中。为了成功进行此过程，必须将皮肤样本作为完整的块收集并完美压平。将两张显微镜玻璃载玻片放在皮肤上，使其变平并防止其卷曲。

加入 20 毫升苯甲酰苯甲酸酯和苯甲酰醇或 BBBA，这将在接下来的几个小时内迅速使组织变硬。将载玻片从皮肤上提起几秒钟，让 BBBA 冲洗皮肤。用于分析毛囊图案的足部皮肤通常从 P 1 到 P 8 解剖给动物 安乐死后，切掉踝关节上方的脚，并通过脚底沿腹面做一个笔直的切口。

轻轻地从皮下组织剥离皮肤，沿近端到远端方向进行。切开手指以释放皮肤，并将皮肤固定在 sard 上，内表面朝上。足部的结缔组织最少。

皮肤转基因。KRT 17 GFP 皮肤现在可以进行黑色素成像。如前所述修复和处理背部皮肤 P 21 动物安乐死后，用擦毛剂去除毛发。

用戴手套的手指和拇指将凝胶涂抹在皮肤表面，等待 10 分钟。用自来水清洗皮肤表面。随后解剖并将足部皮肤固定到 S 护罩上，如前所述。

在室温下用 1% P-F-A-P-B-S 固定 30 分钟，然后在 PBS 中洗涤。为了准备尾巴皮肤，在尾巴的底部做一个圆形的切口，然后沿着尾巴的腹面做一个纵向的切口。用一对镊子牢牢抓住尾骨和/或结缔组织的尖端，用第二对镊子抓住皮肤，从尖端开始剥去尾皮。

将尾部皮肤固定到 SIL 保护装置上，以分析黑色素分布和毛囊方向。如背侧皮肤所示，固定和处理皮肤，以便在固定前分析皮脂腺。将尾部皮肤切成一系列长约 0.5 至 1 厘米的段，并将皮肤块在 PBS 5 毫摩尔 EDTA 中于 37 摄氏度孵育过夜。

为了在第二天削弱真皮表皮的粘附力，轻轻地从真皮上剥离表皮。将表皮界面固定到 S guard 并在室温下在 4% P-F-A-P-B-S 中固定 1 小时。随后，如方案文本中所述，用 PBS 洗涤表皮并用油红 O 染色。

显微镜用于对淹没在 BBBA 中的背侧足或尾部皮肤进行成像，这些皮肤在载玻片下方变平，但仍在玻璃盘中。这种方法最大限度地减少了显微镜的 BBBA 污染。从下方照亮培养皿，以最大限度地减少整个视野中光强度的空间变化。

将玻璃培养皿升高到解剖显微镜标准工作表面上方约 10 厘米的高度，并在光源上放置漫射塑料或玻璃板。成像完成后，将皮肤放回 100% 乙醇中，在零下 20 摄氏度下长期储存。为了制备用于成像的碱性磷酸酶染色皮肤，请将其放置在用于小蛋白凝胶类型的两个玻璃板之间。

小心避免在板和皮肤之间引入气泡。用纸巾小心地吸走多余的 BBBA。将这种板皮板夹层放在显微镜载物台上。

使用具有 10 x 物镜和 2 微米或 5 微米 Z 步长的明场或 DIC 照明。使用机械化 XY 舞台捕获 XY 图像的蒙太奇，这些图像拼接在一起以创建单个三维灰度数据集。使用各种软件包中的任何一个对轴突心轴进行半自动追踪。

皮肤平面支架的明场成像可用于对此处显示的单个皮肤感觉心轴及其追踪图像进行成像。明场成像还可以根据黑色素沉着实现毛囊模式的可视化。这些图像显示了 P 1 个野生型和 6 只卷曲小鼠的皮肤和 P 7 个卷曲的 6 只敲除小鼠的皮肤。

皮肤平面支架的光学显微镜成像可用于定义皮脂腺和尾部的几何形状。与野生型背足相比，用油红色 O 皮脂腺可视化的皮肤在卷曲的六敲除小鼠中杂乱无章。从野生型收获皮肤并卷曲 6 只携带 A GFP 标记的角蛋白 KRT 17 GFP 并用油染色的敲除小鼠。

Red O 透露，淘汰赛皮肤的中心有一个头发漩涡。皮肤平面支架的共聚焦成像还可以定义使用 KRT 17 GFP 和抗 GFP 免疫染色和竖立丸可视化的毛囊几何形状。用抗 smoo 肌动蛋白免疫染色观察眼部肌肉。

默克尔细胞簇用抗细胞角蛋白 8 或 am 1 43 染料摄取可视化，其中央毛囊用 KRT 17 GFP 可视化 卷曲的 6 个敲除默克尔细胞簇不是向前开放，而是形成一个闭合的圆圈 一旦掌握，如果作得当，可以在大约 30 分钟内完成解剖，并且可以在几天到一周内完成不同的排名。看完这个视频，你应该对如何从身体的各个部位收集皮肤以及如何站立它们以激素形式可视化不同的皮肤结构有一个很好的了解。皮肤结构的全厚度、高分辨率图像可以通过标准高光显微镜和共聚焦显微镜收集。

不要忘记，使用多聚醛和 BBBA 可能非常危险。应将这些溶液保存在有盖的容器中，尽量减少蒸气的吸入，并应避免皮肤接触。不要让 BBBA 接触塑料。