小鼠多巴胺能神经元的原代培养

该程序的总体目标是展示如何从胚胎小鼠大脑中产生多巴胺能神经元的原代培养物。这是通过首先收集小鼠 E 13.5 胚胎来实现的。第二步是解剖胚胎小鼠大脑并分离中脑。

接下来，将酶和机械解离应用于收集的中脑。最后一步是铺板解离的神经元细胞。最终，免疫荧光染色用于显示培养物中多巴胺能神经元的存在。

这种方法可以帮助回答神经和精神疾病领域的关键问题，例如精神分裂症、注意力缺陷多动障碍和帕金森病。这种方法的视觉演示至关重要，因为解剖和细胞解离步骤很难学习，因为需要精确的手势和结构的解剖学识别，演示该程序将是佛罗伦萨给我小组的一名工程师开始这个程序。在处死 E 13.5 怀孕的小鼠后，用 70% 乙醇清洁其腹部。

接下来，打开腹壁并收集子宫角。从子宫角中解剖出每个胚胎并去除羊膜。然后将胚胎转移到含有无菌 P-B-S-G-A-B 的 100 毫米培养皿中。

通过在三个连续的相同浴中转移来清洗它们。之后，将胚胎转移到 60 毫米无菌培养皿中进行解剖。将培养皿置于立体显微镜下。

接下来，使用 Vanna 剪刀切除大脑。小心地去除并丢弃四个和后脑区域。在喙侧靠近丘脑区域切开，在腱侧的 ssus 区域再切开一次。

然后去除上菌落。分离腹侧中脑后，小心地去除脑膜 使用超细镊子，将没有脑膜的解剖段收集在装满 P-B-S-G-A-B 的 13 毫升无菌管中。用 70% 乙醇彻底清洁含有中脑的试管。

然后在此步骤中将其放在引擎盖下。用无菌 P-B-S-G-A-B 洗涤中脑 3 次。让脑碎片在每次洗涤之间沉淀，避免在最后一次洗涤后破坏组织。

小心地去除尽可能多的溶液，并将脑段放入 3 毫升胰蛋白酶 EDTA 中，在 37 摄氏度下在二氧化碳培养箱中孵育 15 分钟。同时，对移液器进行火抛光 PE 以最大限度地提高神经元的存活率，因为非抛光玻璃移液器的末端很锋利，在解离步骤中会轻微损坏细胞。在火抛光时减小 PE 移液器的末端直径。

现在小心地去除尽可能多的胰蛋白酶 EDTA 溶液。然后加入 10 毫升培养基、10% IFBS，并用它洗涤脑段 3 次。使用火抛光 PEs 移液器，在 6 毫升培养物中开始中脑解离。

中度，10%IFBS 试卷率 10 次，尽量避免气泡。然后让块沉淀下来。将培养基收集到新的无菌 13 ml 试管中。

添加 6 毫升培养物、培养基和 tri 倍数 10 倍以上。让块沉淀并收集含有解离细胞的培养基，并在同一 13 毫升试管中。然后以 160 G 离心细胞 5 分钟。

之后，丢弃上清液和复苏剂。将细胞悬浮在补充有 10% 激素的培养基中。在 mase 池中混合悬浮细胞计数，并将培养基体积调节至每毫升 600， 000 个细胞的浓度。

一般来说，一个小鼠中脑可以获得大约 1， 700， 000 个细胞。现在从 24 孔板中去除含有 FBS 的涂层培养基。向每个细胞中加入 1 毫升细胞悬液。

然后，将板在 37 摄氏度和 5% 二氧化碳 95% 空气多巴胺能神经元在体外约 5 到 7 天后成熟，细胞可以在培养物中保存长达 15 天而无需更换培养基。解剖前一天，将 10 毫升一磨牙 HCL 加入培养皿中。将 12 至 15 个玻璃盖玻片放在液体表面，等待 15 分钟。

然后将盖子压入液体中，再等待 15 分钟。然后，取出 HCL 并用水清洗盖 Slips 3 次，然后用纯乙醇快速清洗 1 次。然后将纯乙醇加入培养皿中，在引擎盖下等待 30 分钟。

从乙醇中取出清洁的盖玻片。随后将盖玻片转移到 12 孔细胞培养板上。用无菌水清洗盖玻片两次，然后用无菌 PBS 清洗一次。

然后去除 PBS 并加入两个 XPLO，每孔 500 微升，在二氧化碳培养箱中于 37 摄氏度孵育 4 小时后。取出 PLO 溶液并用无菌 PBS 洗涤 3 次。之后，去除 PBS 并加入 500 微升 20% IFBS 层粘连蛋白，每毫升 1 微克，在每个孔中，在 30 摄氏度下在二氧化碳培养箱中孵育过夜。

用于免疫荧光。从 12 孔板中取出涂层介质。以每孔 900， 000 个细胞的浓度加入 2 毫升细胞，并在 37 摄氏度的培养箱中培养它们。

细胞可以在培养物中保存长达 15 天，无需更换培养基。显示。以下是不同发育阶段的培养物的相差图像。该图显示了 DIV 处多巴胺能神经元的酪氨酸羟化酶染色，使用抗 TH 抗体检测到 8 个 D 神经元。

中脑培养物中 TH 阳性神经元的数量是培养年龄的函数。以下是培养物中具有代表性的神经元和星形胶质细胞。在 DIV 4 时，使用抗 DAT 或抗 TH 抗体和 GABA 能神经元检测多巴胺能神经元。

分别使用抗 GAD 67 抗 5-羟色胺和抗 GFAP 抗体检测 5-羟色胺能神经元和星形胶质细胞。神经元细胞用抗 MAP 二抗体染色。这是中脑培养物的几个细胞群的代表性染色。

在 DIV 9 处通过 DAT 染色检测到多巴胺能神经元，在 DIV 9 处通过 GAD 67 染色观察这些 GABA 能神经元。5-羟色胺能神经元在 DI 9 处用抗 5-羟色胺抗体染色。神经元通过映射进行鉴定 染色 在 80 年代初发育后。

这项技术为神经科学领域的研究人员探索原代培养物中的多巴胺能细胞发育铺平了道路，并可用于研究多巴胺能神经元生理和病理状态的分子机制。缺乏展示精细解剖的视频可能限制了研究人员开发这种小鼠培养模型。观看本视频后，您应该对如何从胚胎小鼠大脑中精确分离功能并进行专门的解离步骤以获得小鼠多巴胺能的良好原代培养物有一个很好的了解。