Name: 小鼠多巴胺能神经元的原代培养 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-09-08T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 58 s
Description: 学习从小鼠胚胎中脑中分离和培养多巴胺能神经元的原代培养技术。该方法通过酶解和机械解离获得细胞，用于研究帕金森病等神经系统疾病的神经元易损性机制。

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由法国国家科学研究中心（CNRS）和法国国家健康与医学研究院（INSERM）资助。PM 感谢法国医学研究基金会（Fondation pour la Recherche Médicale en France）（FRM 团队 2009）的支持。SC 感谢法国基金会（Fondation de France）的支持。

&#160;本研究中使用的小鼠均按照欧洲联盟关于实验动物使用指南（86/609/EU）的规定进行饲养和操作。
1. 所需溶液的配制
<ol>
	<li>储备溶液
	<ol>
		<li>10× 多聚-L-鸟氨酸（PLO）溶液：称取10 mg PLO氢溴酸盐（分子量 = 30,000–70,000），溶于70 ml无菌水中。使用0.2 µm&#160;注射器滤器过滤，分装后于-20 °C保存。</li>
		<li>30% 葡萄糖溶液：称取30 g D(+)-葡萄糖，用无菌水定容至100 ml。过滤、分装后于4 °C保存。</li>
		<li>5× DMEM/F-12培养基（Dulbecco改良Eagle培养基/Ham F-12营养混合物）：称取6 g DMEM/F-12 Ham粉末，用无菌水定容至100 ml。过滤、分装后于4 °C保存。</li>
		<li>7.5% 碳酸氢钠（NaHCO3）溶液：称取7.5 g NaHCO3，用无菌水定容至100 ml。过滤、分装后于4 °C保存。</li>
		<li>1 M HEPES溶液：称取23.8 g HEPES，用无菌水定容至100 ml。过滤、分装后于4 °C保存。</li>
		<li>70%（v/v）乙醇：将70 ml无水乙醇与30 ml无菌水混合稀释。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>含葡萄糖和抗生素的磷酸盐缓冲液（PBS-GAB）：向500 ml杜氏磷酸盐缓冲液（Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline）中加入10 ml 30%葡萄糖溶液和5 ml青霉素-链霉素溶液，4 °C保存。</li>
	<li>灭活胎牛血清（iFBS）：在4 °C条件下过夜解冻牛血清，于56 °C灭活30分钟。分装为50 ml后于-20 °C保存。</li>
	<li>培养基：在无菌水中依次加入40 ml 5× DMEM/F12-Ham、1 ml 1 M HEPES、2 ml 200 mM L-谷氨酰胺、2 ml青霉素-链霉素、4 ml 30%葡萄糖和3 ml 7.5% NaHCO3，定容至180 ml。过滤后当天使用。</li>
	<li>激素混合液
	<ol>
		<li>制备180 ml培养基，将200 mg去铁转铁蛋白（apo-transferrin）溶于其中。</li>
		<li>称取50 mg胰岛素，溶于2 ml 0.1 M HCl中，边轻柔搅拌边缓慢加入8 ml无菌水。将此溶液稀释入培养基中。</li>
		<li>称取19.3 mg盐酸亚精胺（Putrescine dihydrochloride），溶于10 ml无菌水中。将10 ml该溶液加入激素混合液中。</li>
		<li>用无菌水配制3 mM亚硒酸钠溶液，用无水乙醇配制2 mM孕酮溶液。各取20 μl加入激素混合液中。</li>
		<li>过滤激素混合液，分装为10 ml，于-20 °C保存。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 培养平板与仪器的准备
<ol>
	<li>培养板的FBS包被：解剖前一天，准备180 ml培养基。将10 ml iFBS加入90 ml培养基中。向已预先包被多聚-D-赖氨酸的24孔板中每孔加入300 μl培养基/10% iFBS。在37 °C下孵育过夜。将剩余的培养基（含iFBS和不含iFBS的）在4 °C保存。</li>
	<li>对器械和巴斯德吸管进行灭菌。准备材料表中所列设备，以及II级生物安全柜和CO2培养箱。</li>
</ol>
3. 小鼠中脑的解剖
<ol>
	<li>根据机构指南处死一只E13.5的怀孕小鼠。用70%乙醇清洁小鼠腹部，切开腹壁。取出子宫角，用精细剪刀打开，将每个胚胎从子宫角中分离，并去除羊膜。将胚胎置于含有无菌PBS-GAB的100 mm培养皿中，用镊子依次转移至3个相同的洗涤液中进行清洗。进行解剖时，将胚胎每3个一组放置于60 mm无菌培养皿中。</li>
	<li>将最终的培养皿置于体视显微镜下。切勿切除胚胎头部。使用Vannas剪刀切除脑组织。
	<ol>
		<li>小心去除并弃去前脑和后脑区域。在头端侧，靠近丘脑区域进行切割；在尾端侧，在峡部区域进行切割，并移除上丘。</li>
		<li>一旦分离出腹侧中脑，使用超细镊子小心去除脑膜。将不含脑膜的解剖组织段收集至装有PBS-GAB的无菌13 ml离心管中。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>用70%乙醇彻底清洁装有中脑组织的离心管，并将其移入生物安全柜中。</li>
</ol>
4. 细胞解离
<ol>
	<li>用无菌 PBS-GAB 洗涤中脑组织 3 次&#160;。每次洗涤后让脑组织碎片自然沉降，避免扰动组织。最后一次洗涤后，小心吸除尽可能多的上清液，并将脑组织段置于 3 ml 胰蛋白酶/EDTA 溶液中，在 37 °C 的 CO2 培养箱中孵育 15 分钟。</li>
	<li>将巴斯德移液管口进行火焰抛光，以最大程度提高神经元存活率，因为未抛光的玻璃移液管末端锋利，在解离步骤中可能损伤细胞。在火焰抛光过程中，略微缩小巴斯德移液管末端的直径（最多缩小 0.5 mm）。</li>
	<li>小心吸除尽可能多的胰蛋白酶/EDTA 溶液，加入 10 ml 含 10% 灭活胎牛血清（iFBS）的培养基。用含 10% iFBS 的培养基洗涤脑组织段 3 次&#160;。</li>
	<li>使用经火焰抛光的巴斯德移液管，在 6 ml 含 10% iFBS 的培养基中开始解离中脑组织。吹打 10 次&#160;（避免产生气泡），待组织块沉降后，将上清液收集至一个新的无菌 13 ml 离心管中。</li>
	<li>加入 6 ml 培养基，重复上一步操作一次，并将含有解离细胞的上清液收集至同一个 13 ml 离心管中。</li>
	<li>以 160 g 离心 5 分钟。弃去上清液，将细胞重悬于补充了 10% 激素混合物的培养基中。</li>
</ol>
5. 细胞铺板
<ol>
	<li>使用血细胞计数板对悬浮细胞进行计数，并调整培养基体积使细胞浓度为 600,000 个细胞/ml。每只小鼠中脑可获得约 1,700,000 个细胞。</li>
	<li>从24孔板中移除含FBS的包被培养基，每孔加入1 ml细胞悬液（600,000个细胞/孔，TH+细胞占2-4%）。</li>
	<li>在 37 °C 和 5% CO₂ 条件下孵育培养板2/95% 空气。无需更换培养基。多巴胺能神经元在约5-7天后成熟 体外 （多巴胺转运体的稳定表达）。细胞培养时间最长可达15天，期间无需更换培养基。</li>
</ol>
6. 免疫荧光实验方案
<ol>
	<li>盖玻片的清洗
	<ol>
		<li>解剖前一天，向培养皿中加入 10 ml 的 1 M HCl。将 12–15 片玻璃盖玻片平铺于液面表面，静置 15 分钟。</li>
		<li>将盖玻片完全浸入液体中，继续静置 15 分钟。</li>
		<li>移除 HCl 溶液，并用去离子水洗涤 3 次。</li>
		<li>用纯乙醇快速洗涤盖玻片 1 次，然后向培养皿中加入纯乙醇，静置 30 分钟。</li>
		<li>在通风橱内，使用无菌镊子将清洗后的盖玻片从乙醇中取出，并将每片盖玻片转移至 12 孔细胞培养板的各个孔中（每孔 1 片）。</li>
		<li>用无菌水（1 ml/孔）洗涤盖玻片 2 次，随后用无菌 PBS 洗涤 1 次。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>盖玻片的包被
	<ol>
		<li>移除 PBS，每孔加入 500 μl 的 2x 多聚赖氨酸（PLO，用 PBS 稀释），在 37 °C 的 CO2 培养箱中孵育 4 小时。</li>
		<li>移除 PLO 溶液，并用无菌 PBS 洗涤 3 次。</li>
		<li>移除 PBS，每孔加入 500 μl 的含 20% 灭活胎牛血清（iFBS）和 1 g/ml 层粘连蛋白（Laminin）的溶液，在 37 °C 的 CO2 培养箱中过夜孵育。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>细胞接种用于免疫荧光染色
	<ol>
		<li>从 12 孔板中移除包被液。</li>
		<li>每孔加入 900,000 个细胞，总体积为 2 ml，在 37 °C 培养箱中培养。细胞可在不更换培养基的情况下培养长达 15 天。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>免疫染色
	<ol>
		<li>从 12 孔板中移除培养基，并用预热至 37 °C 的 DMEM 溶液（500 μl/孔）洗涤。</li>
		<li>每孔加入 500 μl 预热至 37 °C 的 DMEM，然后轻柔加入 160 μl/孔的 8% 多聚甲醛（PFA，终浓度为 2%），在 37 °C 下孵育 10 分钟。</li>
		<li>移除 PFA 溶液，并用含 0.1 M 甘氨酸的 PBS 溶液洗涤 3 次，每次 10 分钟。</li>
		<li>移除 PBS，每孔加入 300 μl 含 0.05% Triton X-100 和 20% 山羊血清的 PBS 溶液，在室温下孵育 30 分钟。</li>
		<li>移除封闭液，每孔加入 300 μl 用含 0.05% Triton X-100 和 1% 山羊血清的 PBS 溶液稀释的一抗，室温孵育 2 小时。可用于检测多巴胺能神经元及鉴定培养物特性的具体一抗列于材料表中。保留一个孔不加一抗，以评估不同二抗的背景信号。</li>
		<li>移除一抗溶液，并用含 0.2% 明胶的 PBS 溶液洗涤 3 次，每次 10 分钟。</li>
		<li>移除洗涤液，每孔加入 300 μl 用含 0.05% Triton X-100 和 1% 山羊血清的 PBS 溶液稀释的二抗，在避光条件下室温孵育 1 小时。所用二抗详见材料表。</li>
		<li>移除二抗溶液，并用含 0.2% 明胶的 PBS 溶液洗涤 3 次，每次 10 分钟。</li>
		<li>移除洗涤液，并用 PBS 洗涤 3 次。</li>
		<li>将盖玻片细胞面向下置于载玻片上的 VECTASHIELD 封片剂液滴中。将载玻片在室温下放置过夜，使封片剂自然干燥，随后于 4 °C 保存。</li>
		<li>使用共聚焦显微镜或配备落射荧光装置的相差显微镜采集图像。代表性图像使用 Leica SP2 UV 共聚焦显微镜获取。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Glowinski, J., Cheramy, A., Romo, R., Barbeito, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Presynaptic+regulation+of+dopaminergic+transmission+in+the+striatum%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Presynaptic regulation of dopaminergic transmission in the striatum.</a> Cell Mol Neurobiol. 8, 7-17 (1988).</li>
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<li>Ohlin, K. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vascular+endothelial+growth+factor+is+upregulated+by+L-dopa+in+the+parkinsonian+brain%3A+implications+for+the+development+of+dyskinesia%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%22%5BJournal%5D)">Vascular endothelial growth factor is upregulated by L-dopa in the parkinsonian brain: implications for the development of dyskinesia.</a> Brain. 134, 2339-2357 (2011).</li>
<li>Obeso, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Missing+pieces+in+the+Parkinson%27s+disease+puzzle%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Missing pieces in the Parkinson's disease puzzle.</a> Nat Med. 16, 653-661 (2010).</li>
<li>Cooper, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pharmacological+rescue+of+mitochondrial+deficits+in+iPSC-derived+neural+cells+from+patients+with+familial+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">Pharmacological rescue of mitochondrial deficits in iPSC-derived neural cells from patients with familial Parkinson's disease.</a> Sci Transl Med. 4, (2012).</li>
<li>Michel, P. P., Toulorge, D., Guerreiro, S., Hirsch, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+needs+of+dopamine+neurons+for+stimulation+in+order+to+survive%3A+implication+for+Parkinson+disease%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">Specific needs of dopamine neurons for stimulation in order to survive: implication for Parkinson disease.</a> FASEB J. 27, 3414-3423 (2013).</li>
<li>Decressac, M., Volakakis, N., Bjorklund, A., Perlmann, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NURR1+in+Parkinson+disease-from+pathogenesis+to+therapeutic+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Neurol%22%5BJournal%5D)">NURR1 in Parkinson disease-from pathogenesis to therapeutic potential.</a> Nat Rev Neurol. , (2013).</li>
<li>Jouve, L., Salin, P., Melon, C., Le Goff, L. K. erkerian- <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deep+brain+stimulation+of+the+center+median-parafascicular+complex+of+the+thalamus+has+efficient+anti-parkinsonian+action+associated+with+widespread+cellular+responses+in+the+basal+ganglia+network+in+a+rat+model+of+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Deep brain stimulation of the center median-parafascicular complex of the thalamus has efficient anti-parkinsonian action associated with widespread cellular responses in the basal ganglia network in a rat model of Parkinson's disease.</a> J Neurosci. 30, 9919-9928 (2010).</li>
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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

本方案介绍了从胚胎小鼠制备中脑神经元原代培养所需的步骤和试剂，以及通过免疫荧光检测多巴胺能神经元的方法。该操作的关键步骤包括胚胎的解剖和收集到的脑组织碎片的机械性分离。高质量的解剖器械有助于掌握解剖技术。多巴胺能（DA）神经元在中脑中所占比例较小，因此准确获取腹侧中脑的特定区域对于获得含有2-4% DA神经元的培养物至关重要。机械分离过程应谨慎轻柔地进行。如果培养物中存在未充分解离的神经元团块，应增加一至两次吹打步骤。
本实验方案采用无血清培养基进行神经元培养。然而，需要用血清包被以增强细胞的贴壁。激素混合物可替代血清，其成分为明确组分，能够支持神经元生长，同时最大限度地抑制胶质细胞的存活与增殖。因此，非神经元细胞约占培养细胞总数的2-3%（通过GFAP染色进行定量）。另一种方法是，在培养基中添加血清，并在接种后两天加入阿糖胞苷（cytosine-β-D-arabinofuranoside, ara-C，5–8 μM），以抑制胶质细胞的增殖26。除激素混合物外，还可使用成分明确的培养基及补充物29。
<p class="jove_...

多巴胺是大脑中一种重要的神经递质1,2，主要由中脑多巴胺能（DA）神经元释放。大多数DA神经元位于中脑的腹侧区域2-6。从解剖和功能上看，中脑DA神经元可划分为三个结构和功能上不同的投射系统：黑质纹状体通路、中脑边缘通路和中脑皮层通路2,5。其中，黑质纹状体通路参与运动行为调控，中脑边缘通路在强化、动机和学习过程中发挥重要作用，而投射至前额叶皮层的多巴胺能通路则与认知功能相关2。
多巴胺能神经元参与多种人类神经系统疾病，如精神分裂症、注意力缺陷、多动障碍以及帕金森病（PD）2,4。帕金森病的特征是连接黑质致密部（SNc）与纹状体的多巴胺能神经元发生进行性且选择性的退化。黑质-纹状体多巴胺能神经元的丧失导致纹状体中多巴胺严重耗竭，从而引发帕金森病的运动症状（运动迟缓、静止性震颤和肌强直）7。特发性帕金森病的初始病因尚未明确，目前的治疗手段仅能缓解症状，旨在恢复纹状体中的多巴胺水平。最常用的药物是左旋多巴（L-Dopa），即多巴胺的天然前体。尽管左旋多巴的使用可在一定时间内补偿多巴胺的缺失，但长期治疗后会出现运动并发症（异动症和“开关”现象）8,9。
关于多巴胺能神经元和帕金森病（PD）的研究正在不断推进，人们正大力开展基于细胞移植、基因治疗或神经保护剂的治疗方法开发10,11。然而，一个主要问题仍未阐明：多巴胺能（DA）神经元为何具有极高的易损性？部分答案可能存在于DA神经元的电活动特性中。DA神经元电活动及兴奋性的降低似乎会增加其退变倾向12。然而，PD发病机制的复杂性要求进一步研究以明确导致DA神经元退变的相关机制13-15。
原代培养对于研究多巴胺能神经元的特性16-19，以及在评估神经保护剂时对这些神经元施加各种应激刺激具有重要意义20-24。大鼠培养模型最为常用，因为与小鼠相比，大鼠胚胎中脑的解剖操作更为简便，且可获得更多的神经元。然而，随着疾病转基因小鼠模型的建立25，神经科学界对小鼠来源的原代培养兴趣显著增加26-29。尽管也可使用新生动物制备培养物，但最好从处于有丝分裂后阶段的胚胎（中脑神经元为E13.5）获取细胞，此时神经元仍保持分化能力。以下方案介绍了从小鼠胚胎（E13.5）分离中脑神经元进行原代培养的方法，这是最难制备的培养体系之一。特别地，我们提供了一种无血清培养基的培养方案，以提高实验的可重复性。培养制备过程中最关键的两个步骤（解剖和机械性解离）将在配套视频中详细展示。

<table><tbody><tr><td>胎牛血清</td><td>Lonza</td><td>14-801F</td><td></td></tr><tr><td>含L-谷氨酰胺的DMEM（4.5 g/L葡萄糖）</td><td>Lonza</td><td>BE12-604F</td><td></td></tr><tr><td>0.05%胰蛋白酶-EDTA（1×），含酚红</td><td>Life Technologies</td><td>25300-054</td><td></td></tr><tr><td>青霉素-链霉素（10,000 U/ml）</td><td>Life Technologies</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>L-谷氨酰胺，200 mM溶液</td><td>Life Technologies</td><td>25030123</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&amp;rsquo;磷酸盐缓冲液</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&amp;rsquo;s改良Eagle&amp;rsquo;s培养基/营养混合物F-12 Ham</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>D0547</td><td>粉末</td></tr><tr><td>层粘连蛋白 - Tris缓冲NaCl溶液中1 mg/ml</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>L2020</td><td></td></tr><tr><td>聚-L-鸟氨酸氢溴酸盐</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>P3655</td><td></td></tr><tr><td>猪胰岛素</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>I5523</td><td></td></tr><tr><td>人脱铁转铁蛋白</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>T1147</td><td></td></tr><tr><td>盐酸亚精胺</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>P5780</td><td></td></tr><tr><td>孕酮</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>P8783</td><td></td></tr><tr><td>亚硒酸钠</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>S5261</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>H4034&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>甘氨酸</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>G7126</td><td>1 M水溶液储备液</td></tr><tr><td>明胶</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>G9391</td><td>2%（w/v）水溶液储备液</td></tr><tr><td>曲拉通X-100</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>T8532</td><td></td></tr><tr><td>水中16%多聚甲醛</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>RT 15710-S</td><td></td></tr><tr><td>碳酸氢钠（NaHCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;）</td><td>Merck Millipore</td><td>106329</td><td></td></tr><tr><td>D(+)-葡萄糖一水合物</td><td>Merck Millipore</td><td>4074-2</td><td></td></tr><tr><td>盐酸 - c(HCl) = 1 mol/L（1 N）Titripur</td><td>Merck Millipore</td><td>109057</td><td></td></tr><tr><td>无菌水 - Aqua B. Braun</td><td>Braun</td><td></td><td></td></tr><tr><td>绝对乙醇 NORMAPUR 分析纯试剂</td><td>VWR</td><td>20821.321</td><td></td></tr><tr><td>无菌培养皿</td><td>VWR</td><td>82050-566</td><td></td></tr><tr><td>普通玻璃巴斯德吸管 - Wilhelm Ulbrich GdbR.</td><td>VWR</td><td>612-2297</td><td></td></tr><tr><td>Malassez计数板</td><td>VWR</td><td>631-0975</td><td></td></tr><tr><td>带Supor膜的无菌血清Acrodisc注射器滤器，GF/0.2 &amp;micro;m，37 mm</td><td>PALL Life science</td><td>4525</td><td></td></tr><tr><td>外科剪刀 - 直型，尖-尖刃，14.5 cm长</td><td>Fine Science Tools</td><td>14002-14</td><td>用于切开腹壁</td></tr><tr><td>剪刀 - 直型，尖头，精细，10 cm长</td><td>MORIA</td><td>4877A</td><td>用于切开子宫壁</td></tr><tr><td>镊子 - 弯型，普通，带锯齿夹头（1 mm）</td><td>MORIA</td><td>2183</td><td>用于操作胚胎</td></tr><tr><td>Vannas剪刀 - 弯型，尖头，7 mm刀片</td><td>MORIA</td><td>MC50</td><td>用于取出中脑</td></tr><tr><td>超细镊子 - 弯型，精细，13 cm长</td><td>MORIA</td><td>9987</td><td>用于去除脑膜</td></tr><tr><td>BD BioCoat 聚-D-赖氨酸24孔多孔板</td><td>BD Bioscience</td><td>356414</td><td></td></tr><tr><td>BD Falcon 12孔细胞培养板，平底带盖</td><td>BD Bioscience</td><td>353043</td><td></td></tr><tr><td>SuperFrost显微镜载玻片，磨边90&amp;ordm;</td><td>MENZEL-GL&amp;Auml;SER</td><td>AG00008032E</td><td></td></tr><tr><td>精密盖玻片，厚度No. 1.5H，圆形，直径18 mm &amp;Oslash;</td><td>MARIENFELD</td><td>117580</td><td></td></tr><tr><td>兔多克隆抗微管相关蛋白2（MAP2）抗体</td><td>Chemicon Millipore</td><td>AB5622</td><td>1/200</td></tr><tr><td>小鼠单克隆抗谷氨酸脱羧酶（GAD67）抗体，克隆1G10.2</td><td>Chemicon Millipore</td><td>MAB5406</td><td>1/400</td></tr><tr><td>大鼠单克隆抗多巴胺转运体（DAT）抗体，克隆DAT-Nt&amp;nbsp;</td><td>Chemicon Millipore</td><td>MAB369</td><td>1/500</td></tr><tr><td>小鼠单克隆抗5-HT抗体</td><td></td><td></td><td>1/8,000 - 由瑞士Yves Charnay慷慨赠送（Yves.Charnay@hcuge.ch）</td></tr><tr><td>新西兰来源山羊血清</td><td>Life Technologies</td><td>16210-064</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 405山羊抗兔IgG（H+L）抗体</td><td>Life Technologies</td><td>A-31556</td><td>1/200</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488山羊抗小鼠IgG（H+L）抗体</td><td>Life Technologies</td><td>A-11001</td><td>1/1,000</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594山羊抗大鼠IgG（H+L）抗体</td><td>Life Technologies</td><td>A-11007</td><td>1/1,000</td></tr><tr><td>VECTASHIELD HardSet封片介质</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1400</td><td></td></tr><tr><td>体视显微镜</td><td>Carl Zeiss microscopy</td><td>Stemi-2000C</td><td></td></tr><tr><td>Bunsen Burner FIREBOY</td><td>VWR</td><td>451-0136</td><td></td></tr></tbody></table>

小鼠多巴胺能神经元的原代培养

Primary Culture of Mouse Dopaminergic Neurons

多巴胺能神经元占大脑神经元总数不到1%。尽管数量稀少，这类神经元却调控着运动控制、动机以及工作记忆等重要的脑功能。在帕金森病（PD）中，黑质纹状体多巴胺能神经元会发生选择性退化。这种进行性的神经元丢失与疾病的运动症状（如运动迟缓、静止性震颤和肌肉强直）明确相关。目前，导致多巴胺能神经元退化的主因仍不明确。然而，这些神经元在多种条件下表现出极高的易损性。原代培养是研究多巴胺能神经元特性和功能的最重要模型之一。此类培养体系可暴露于多种模拟PD病理的应激因子中，也可用于评估神经保护化合物是否能够阻止或延缓神经元退化。过去十年中，大量帕金森病转基因小鼠模型的建立进一步提升了科研人员对多巴胺能神经元培养的兴趣。本视频方案重点介绍胚胎小鼠脑组织的精细解剖过程。准确切除中脑腹侧区域对于获得富含多巴胺能细胞的神经元培养体系至关重要，以确保后续实验研究的可行性。该方案适用于胚胎期转基因小鼠，可用于免疫荧光染色、定量PCR、第二信使定量分析或神经元死亡/存活评估。

中脑培养步骤的图示流程见图1。简言之，从怀孕的Swiss小鼠中获取E13.5胚胎后，从中完整胚胎中分离出腹侧中脑组织。分离的脑组织依次进行酶消化和机械解离。解离后的细胞经离心沉淀，重悬于培养基中，并接种于预先包被的12孔或24孔板中。细胞培养最长可达15天，期间无需更换培养基。
与步骤3.2相对应的腹侧中脑解剖详细流程图如图2所示。虚线红框表示E13.5小鼠脑示意图上的三条主要切割线（改编自Prestoz et al.30），并图示了切割步骤。
培养1天、4天和7天后的相差显微图像 体外 （体外培养天数，DIV）如图所示 图3神经元迅速长出突起并出芽（图3A）。在DIV4和DIV7时，分支和分枝更为延伸（图3B-3C).
使用抗TH抗体通过免疫细胞...

多巴胺能神经元在大脑中发挥着重要的调节作用，其丢失与帕金森病相关。在本视频中，我们展示了如何从胚胎小鼠中脑分离培养原代中枢多巴胺能神经元。此类培养体系可用于研究这些神经元对各种应激因素高度敏感的特性。

多巴胺能神经元占大脑神经元总数不到1%。这类数量稀少的神经元调控着重要的脑功能……

本实验的总体目标是展示如何从胚胎小鼠脑组织中建立多巴胺能神经元的原代培养。首先获取小鼠 E 13.5 胚胎，第二步是解剖胚胎小鼠脑组织并分离中脑区域。接下来，对收集到的中脑组织进行酶解和机械解离。最后一步是将解离的神经元细胞接种培养。最终，通过免疫荧光染色来显示培养物中多巴胺能神经元的存在。该方法有助于回答神经科学和精神疾病领域的一些关键问题，例如精神分裂症、注意缺陷多动障碍以及帕金森病。由于该方法中的解剖和细胞分离步骤需要精确的操作动作以及对结构的准确解剖学识别，因此对其进行可视化演示至关重要。本实验程序将由我团队中的一名工程师 Florence 演示。开始实验前，处死一只孕 13.5 天的小鼠，并用 70% 乙醇清洁其腹部。接着，打开腹壁并取出子宫角。从子宫角中分离出每个胚胎，并去除羊膜。然后将胚胎转移至一个含有无菌PBSGAB的100毫米培养皿中。通过在三个连续的相同溶液中依次转移清洗。随后，将胚胎转移至一个60毫米的无菌培养皿中，用于解剖。将培养皿置于体视显微镜下。接下来，使用范纳剪刀切除脑组织。小心移除并弃去第四脑室和后脑区域。在头侧靠近丘脑区域处做一切口，在尾侧的ssus区域做另一切口。然后去除上丘。一旦腹侧中脑被分离出来，使用超细镊子小心去除脑膜，将不含脑膜的解剖组织段收集到装有PBSGAB的13毫升无菌离心管中。用70%乙醇彻底清洁含有中脑的离心管。然后在此步骤中将其置于通风橱内。用无菌的 P-B-S-G-A-B 洗涤中脑组织三次。每次洗涤后让脑组织碎片自然沉降，并在最后一次洗涤后避免扰动组织。尽可能小心地吸除溶液，并将脑组织片段置于含有 3 毫升胰蛋白酶 EDTA 的环境中，在 37 摄氏度的二氧化碳培养箱中孵育 15 分钟。在此期间，对移液管进行火焰抛光处理，以最大限度地提高神经元的存活率，因为未抛光的玻璃移液管末端较为锋利，在解离步骤中可能轻微损伤细胞。在进行火焰抛光时，应减小 PE 移液管末端的直径。现在小心地尽可能吸除胰蛋白酶EDTA溶液。然后加入10毫升培养基（含10% IFBS），用其清洗脑组织片段三次。使用火焰抛光的PE移液管，在6毫升培养基中开始中脑组织的解离。培养基，加入10%胎牛血清，涡旋混匀10次，尽量避免产生气泡。随后静置使组织块沉降。将培养基收集至新的无菌13毫升离心管中。加入六毫升培养基，使培养物和培养基的体积增加至原来的十倍。让组织块自然沉降，收集含有解离细胞的上清液至同一个13毫升离心管中。随后在160 ×g 条件下离心五分钟。随后，弃去上清液并重悬细胞。将细胞悬浮于添加了10%激素的培养基中。在血细胞计数板中混匀并计数悬浮细胞，然后调整培养基体积，使细胞浓度为每毫升600,000个细胞。通常，从小鼠中脑可获得约 1,700,000 个细胞。现在从 24 孔板中移除含有 FBS 的包被培养基。向每孔加入一毫升

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JoVE Journal

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神经科学

原代分离的中脑多巴胺细胞培养可用于研究多巴胺神经元的突触前特性。这些培养细胞可用于实时监测多巴胺释放动力学，以及多巴胺胞吐作用调控因子的蛋白质/mRNA水平。本文中，我们将展示如何从啮齿类动物新生个体中建立此类细胞培养。...

新生鼠中脑多巴胺能细胞原代分离培养

本方案概述了分离、通过电穿孔转染以及培养小鼠海马和皮层神经元所需的步骤。短期培养可用于轴突生长和导向研究，而长期培养则适用于突触形成和树突棘分析的研究。...

胚胎小鼠海马和皮层神经元的核转染与原代培养

本文介绍了在原代培养中获得富集的小鼠少突胶质细胞前体细胞（OPCs）的方法，这些细胞可分化为成熟的少突胶质细胞（OLs）。此外，本文还描述了一种通过将小鼠OPCs接种于小鼠背根神经节神经元（DRGNs）的神经突网络上，以建立小鼠髓鞘形成共培养体系的技术。...

从出生后小鼠组织中分离富集的少突胶质细胞培养物及少突胶质细胞/神经元髓鞘形成共培养物

本视频介绍了一种从小鼠胚胎脑组织中培养多巴胺能神经元的方法。该过程包括用蛋白水解酶处理中脑，使细胞解离，并将细胞接种于聚合物包被的盖玻片上，在含抗生素的营养丰富培养基中进行培养，以促进细胞生长并维持其长期存活能力。...

培养和维持小鼠胚胎脑组织来源的多巴胺能神经元

该视频展示了从小鼠胚胎中脑分离和培养多巴胺能神经元的过程。分离出的腹侧中脑组织通过酶消化法进行解离。获得的多巴胺能神经元被收集并转移至多孔板内的微岛结构中。细胞在多巴胺能神经元培养基中孵育，以维持其在微岛内的高密度生长状态。...

原代小鼠中脑多巴胺能神经元的分离与培养

本视频展示了在经α-突触核蛋白预形成纤维预处理的胚胎小鼠多巴胺能神经元中，定量α-突触核蛋白聚集的过程。该方法详细说明了通过免疫荧光技术对含有α-突触核蛋白聚集体的多巴胺能神经元进行固定、染色和定量分析的步骤。...

研究α-突触核蛋白在原代胚胎小鼠多巴胺能神经元中的聚集

本文详细描述了一种从单只成年小鼠的脑室下区和齿状回同时生成神经前体细胞培养物的实验方案，该培养物可采用贴壁单层培养或神经球培养的形式。...

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帕金森病期间中脑多巴胺能神经元退化的原因尚未完全明确。细胞培养系统为研究这些神经元的神经生理特性提供了重要工具。本文介绍了一种优化的方案，可用于 体外...

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在帕金森病（Parkinson's Disease, PD）中，黑质致密部（Substantia Nigra, SNc）的多巴胺能神经元发生退化，导致运动功能障碍。本文报道了一种实验方案：从酪氨酸羟化酶（Tyrosine Hydroxylase,...

利用RNA测序和TH启动子驱动的eGFP表达在中脑培养物中可靠鉴定活体多巴胺能神经元

尽可能充分地在体外实验中模拟体内条件并非易事。使用原代细胞培养是理解完整生物体中细胞生物学的重要一步。本方案详细介绍了如何成功培养和培育小鼠胚胎小脑神经元。...

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研究预制纤维诱导的α-突触核蛋白在原代胚胎小鼠中脑多巴胺能神经元中的聚集

学习从小鼠胚胎中脑中分离和培养多巴胺能神经元的原代培养技术。该方法通过酶解和机械解离获得细胞，用于研究帕金森病等神经系统疾病的神经元易损性机制。

小鼠多巴胺能神经元的原代培养

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