酵母核内体系统的超微结构分析的纳米金标记
2014年7月14日
酵母， 酿酒酵母 ，一直是一个关键模式生物识别和研究基因调节内体系统的生物合成和功能。在这里，我们提出了内体车厢的超微结构研究特定的标签一个详细的协议。
以下实验的总体目标是在超结构水平上可视化酵母 Saccharomyces cei 的内体区室。这是通过制备酵母 Sphera plast 来实现的，然后对其进行带正电荷的纳米金颗粒的内吞摄取。作为第二步，将样品固定并切片以获得细胞的超薄冷冻切片。
接下来，将冷冻切片提交给银增强反应。为了扩大和可视化内吞酶带正电荷的纳米金颗粒，获得了结果，这些结果根据该程序的特定标记显示了不同酵母内体区室的形态。我们现有方法的这种技术的主要优势，如切片的 ImmunoGold 标记，是它不依赖于通常不适用于电镜制备的抗体。
虽然这种方法可以向我们展示对酵母 sarchi ESIS vei 溶酶体系统的见解，但它也可以应用于其他真核模型，例如其他酵母和哺乳动物细胞。首先将制备 Sphero Plast 的酵母在 30 摄氏度的 10 毫升适当培养基中孵育过夜，由第二天的实验设计确定。在 600 纳米处测量培养物的光密度后，在相同的培养基中将细胞稀释至 OD 600 为 0.2 至 0.4。
将细胞培养至指数生长期，OD 600 为 1 到 2，将 10 D 600 当量细胞转移到 50 毫升试管中，并以 2100 Gs 离心 5 分钟。离心后，弃去上清液，将细胞沉淀重悬于 5 毫升 100 毫摩尔管和 10 毫摩尔 dihi 3 中，在 30 摄氏度下孵育 10 分钟。通过离心收集细胞。
弃去上清液 Resus 后，将细胞悬浮在含有 1 磨牙山梨醇和 5 毫克裂解酶的 5 毫升培养基中。将混合物在 30 摄氏度下孵育，轻轻摇晃 30 分钟。将细胞悬液以 300 Gs 离心 5 分钟，以收集与 Sphero 平台相对应的沉淀组分。
弃去上清液，将飞溅物重新悬浮在含有 1 磨牙山梨糖醇的 960 微升冰冷培养基中。将混合物转移到冰冷的 2 毫升微量离心管中。要开始纳米金摄取的程序，请使用移液管并将 Sphero plast 与四个带正电的纳米金颗粒轻轻混合。
复苏悬浮在 40 μL 水中。混合物的最终体积必须为 1 毫升。将获得的细胞悬液置于冰上 15 分钟。
将悬浮液转移至室温并孵育所需时间，以允许纳米金通过内吞作用内化。当所需的纳米金摄取完成时，向细胞悬液中加入 1 毫升含有 1 摩尔山梨醇的双倍强度固定剂以终止反应。将试管在室温下放置 30 分钟。
在 30 分钟内手动轻轻倒置微量离心管数次，以保持 PHE 塑性物质和悬浮液接下来以 1700 Gs 离心两次，持续 25 秒，弃去上清液，加入 1 毫升新鲜的标准强度固定剂，其中含有 1 颗磨牙山梨醇，在室温下在缓慢旋转的轮子上孵育 2 小时。随后，按照文本方案中的说明处理和冷冻切片细胞，在开始此过程之前，从冰箱中取出银增强试剂盒并在 37 摄氏度的培养箱中解冻。将解冻套件放入事先放置在暗室中的 24 摄氏度台式培养箱中，直至使用。
将加热板放在暗室中，加热至 24 摄氏度的最终温度。用工作台涂层表面覆盖加热板的顶部，保护器闪亮的一面朝上，并用胶带固定。将 para 薄膜放在表面保护膜上，并用黑色记号笔标记边缘，以便在黑暗中可视化。
将温度计贴在表面保护器的顶部。要监测加热板的温度，请逐渐调整温度。如果不是 24 摄氏度，则放置一个装有双蒸水的 50 毫升管。
在培养箱内，在一个小培养皿中装满双蒸水，预先警告 37 摄氏度。将两个镍网格放在水样中，冷冻切片面朝下，放置 30 分钟。30 分钟后，在第二个培养皿中加入预热的双蒸水，然后将相同的两个镍网格放入水中再放置 30 分钟。
再次冲洗网格，将它们样品面朝下放在几滴 24 摄氏度的双蒸水上，放在固定在加热板上的香水上。确保在香水上准备好九个额外的双蒸水滴，以便在银增强反应后进行冲洗。在手术的此时，必须关闭暗室中的所有灯并打开红灯。
但是，仅用于拍摄目的，指示灯将保持亮起。在本演示中，从 24 摄氏度培养箱中的 1.5 毫升微量离心管中取出银增强试剂盒的 a 和 B 溶液，滴入 6 滴 A 溶液，然后滴入 6 滴 B 溶液，并与玻璃糊状移液器充分混合，同时避免气泡形成。涡旋溶液。
将 A 和 B 溶液短暂放回 24 摄氏度的培养箱中，然后取出 C 溶液。向 AB 混合物中加入 6 滴 C 溶液。用糊状移液器再次混合，然后涡旋，避免产生气泡。
立即使用这种最终混合物。用一对干净的防磁镊子将液滴滴在副体上。将网格放在混合物上。
这是银增强反应。将网格放置 6 到 15 分钟，具体取决于实验所需的增强功能。从混合物中取出网格，然后快速通过连续六滴双蒸水，在 24 摄氏度的 Perfil 上进行最后三次洗涤。
每滴水将网格放置 7 分钟。如果进行真正的实验，请在洗涤完成后重新打开灯。随后，通过 ImmunoGold 标记或膜染色将结果可视化以进行 EM 研究。
不同类型的酵母内体区室可以用银增强纳米金标记，并通过电子显微镜观察。纳米金的摄取 5 分钟即可标记质膜和早期内体区室，例如单个囊泡，它们可能是内吞囊泡和管状结构，它们很可能是早期内体。与纳米金孵育 30 分钟可标记晚期内体或多泡体。
将免疫电子显微镜程序与这种纳米金银增强方案相结合的分辨率能力通过所示细胞器的形态的保存和质量得到强调，特别是多泡体的内部囊泡。在使用银增强方法之前，有必要进行一次中试实验，以确定这些银颗粒的大小和均匀性所需的最佳孵育时间。遵循此过程。
可以执行免疫标记等其他方法，以回答诸如特定蛋白质定位到 mar 隔室下的特异性等问题。
查看完整文字稿并访问数千部科学视频
概述
本文介绍了一种在超结构水平上可视化酵母Saccharomyces cerevisiae内体区室的详细协议。该方法使用带正电的纳米金粒子进行特定标记，从而增强了这些细胞结构的可视化。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 细胞生物学
- 微生物学
背景
- 酵母是研究细胞过程的关键模型生物。
- 内体系统在细胞运输中起着关键作用。
- 传统方法可能依赖于在电子显微镜中不起作用的抗体。
- 本研究旨在改进内体区室的可视化技术。
研究目的
- 在超结构水平上可视化酵母内体区室。
- 开发一个增强这些区室标记的协议。
- 提供现有免疫-金标记方法的可靠替代方案。
使用的方法
- 酵母球质的制备。
- 带正电的纳米金粒子的内吞摄取。
- 固定和切片样品以获得超薄冷冻切片。
- 应用银增强反应进行可视化。
主要结果
- 成功可视化了不同的酵母内体区室。
- 增强了内体结构的形态学细节。
- 证明了标记技术的有效性。
- 与传统方法的比较突显了这种方法的优势。
结论
- 该协议提供了一种研究内体区室的稳健方法。
- 该技术克服了基于抗体的方法的局限性。
- 它为酵母的超结构研究开辟了新的途径。
常见问题
Executive Industry Relevance
This method enables ultrastructural visualization of endosomal compartments without antibody dependence, addressing a key limitation in electron microscopy-based target validation. By providing direct morphological readouts of endocytic trafficking, it supports mechanistic de-risking in early discovery where lysosomal and endosomal pathways are implicated in disease. The approach enhances predictive confidence in phenotypic screening assays that monitor organelle integrity or protein trafficking as functional readouts.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables direct observation of endosomal morphology to interrogate therapeutic hypotheses involving vesicular trafficking pathways.
- Operational Value: Provides antibody-independent labeling, reducing reliance on reagents that may fail in EM sample preparation.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates ultrastructural readouts that can validate compound effects on endosomal size, uniformity, and compartmentalization.
- Operational Value: Supports assay standardization through quantifiable silver enhancement kinetics tied to uptake duration.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Facilitates correlation of genetic or pharmacological perturbations with endosomal ultrastructure in disease-relevant models.
- Operational Value: Enables side-by-side comparison of wild-type and mutant phenotypes to de-risk target mechanisms before preclinical advancement.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within early discovery workflows where endosomal function is a phenotypic readout, bridging target validation to assay development through direct ultrastructural analysis.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by visualizing endosomal compartmentalization following genetic or chemical perturbation.
- Screening: Enables quantitative assessment of nanoparticle uptake kinetics as a proxy for endocytic activity in compound screening.
- Analytics: Provides morphometric data on vesicle size and distribution that can be correlated with functional assays.
- Translational Research: Connects cellular trafficking defects observed in yeast to conserved pathways in higher eukaryotes.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable ultrastructural platform for evaluating endosomal function across multiple projects and model systems.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity in trafficking studies by providing direct visual evidence of endosomal labeling.
- Operational Value: Standardizes sample preparation through defined spheroplast formation and nano gold uptake parameters.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by validating target engagement through organelle-level phenotypic changes.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets based on endosomal phenotype rescue or modulation.
Implementation Considerations
- Expertise in yeast spheroplast preparation and electron microscopy sample handling.
- Access to cryo-ultramicrotomy and silver enhancement reagents for nanoparticle visualization.
- Standardization of incubation times to ensure uniform particle labeling across experimental conditions.
- Adaptation considerations for applying the protocol to mammalian or other yeast endosomal systems.
- Requirement for pilot experiments to optimize nano gold concentration and enhancement duration for specific ultrastructural readouts.
