酵母内体系统的纳米金标记用于超微结构分析

以下实验的总体目标是在超微结构水平上观察酵母菌酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）的内体区室。该目标通过制备酵母球状体实现，这些球状体会内吞带正电荷的纳米金颗粒。第二步是固定样品并进行切片，以获得细胞的超薄冷冻切片。

接下来，将冷冻切片进行银增强反应。该步骤可放大并可视化内吞的带正电荷的纳米金颗粒，从而获得能够显示不同酵母内体区室形态的结果，这些结果基于本实验方法的特异性标记。与现有的免疫金标记切片等方法相比，该技术的主要优势在于不依赖抗体，而抗体在电镜样品制备中常常无法有效发挥作用。

尽管该方法可帮助我们深入了解酿酒酵母sarchi ESIS vei的溶酶体系统，但也可应用于其他真核生物模型，如其他酵母和哺乳动物细胞。用于制备原生质球的酵母需首先在适宜的培养基中于30摄氏度下振荡培养过夜，培养基种类根据次日实验设计确定。用分光光度计测定培养液在600纳米处的光密度（OD600）后，用相同的培养基将细胞稀释至OD600值为0.2至0.4。

将细胞培养至指数生长期，OD 600 达到 1 至 2 时，转移相当于 10 D 600 的细胞至 50 毫升离心管中，在 2100 ×g 条件下离心 5 分钟。离心后弃去上清液，将细胞沉淀重悬于 5 毫升含 100 毫摩尔 Pipes 和 10 毫摩尔二硫苏糖醇（Dithiothreitol, DTT）的溶液中，于 30 摄氏度孵育 10 分钟。通过离心收集细胞。

弃去上清液后，将细胞重悬于5 mL含有1 M山梨醇和5 mg溶壁酶的培养基中。在30 °C下轻轻振荡孵育30分钟。将细胞悬液在300 ×g下离心5分钟，收集沉淀组分，即为原生质球。

弃去上清液，将原生质体重悬于960 µL含1 M山梨醇的冰冻培养基中。将混合液转移至预冷的2 mL微量离心管中。开始纳米金摄取实验时，用移液器吸取4 µL带正电荷的纳米金颗粒，轻轻混入Sphero原生质体中。

将重悬物溶于40微升水中。混合液的终体积必须为1毫升。将获得的细胞悬液置于冰上15分钟。

将悬液转移至室温，孵育所需时间以使纳米金通过内吞作用进入细胞。当达到理想的纳米金摄取量后，向细胞悬液中加入1毫升含1摩尔山梨醇的双倍浓度固定液以终止反应。将离心管在室温下放置30分钟。

在30分钟内手动轻轻倒置微量离心管数次，以保持PHE塑块和悬浮液均匀混合。随后在1700 ×g条件下离心两次，每次25秒，弃去上清液，加入1毫升含1摩尔山梨醇的新鲜标准浓度固定液，在室温下缓慢旋转轮上孵育2小时。之后，细胞按照文本方案中所述方法进行处理并进行冷冻切片。在开始本操作前，从冰箱中取出银增强试剂盒，置于37摄氏度培养箱中解冻。将解冻后的试剂盒放入已预先置于暗室中的24摄氏度台式培养箱内，直至使用。

将加热板放置于暗室中，并将其加热至最终温度24摄氏度。用实验台防护布覆盖加热板顶部，防护布有光泽的一面朝上，并用胶带固定。在防护布表面覆盖一层封口膜，并用黑色记号笔标记其边缘，以便在黑暗环境中进行观察。

将温度计用胶带固定在表面保护器的顶部。为了监测加热板的温度，逐渐调节温度。如果温度不是24摄氏度，放置一个含有双蒸水的50毫升离心管。

在培养箱内，用37摄氏度预热的双蒸水填充一个小培养皿。将两个带有冷冻切片的镍网放入水中，样品面朝下，浸泡30分钟。30分钟后，用预热的双蒸水填充第二个培养皿，并将相同的两个镍网放入水中，继续浸泡30分钟。

将载网的样品面朝下，在置于加热板上且已固定的石蜡膜表面的数滴双蒸水（24摄氏度）中依次漂洗。确保在石蜡膜上另备有九滴双蒸水，用于银增强反应后的漂洗。在此步骤中，暗室内的所有光源必须关闭，仅开启红光灯。

然而，仅为拍摄目的，光源将保持开启。在本演示中，从24°C培养箱中取出银增强试剂盒的A液和B液，取1.5毫升微量离心管，加入6滴A液，随后加入6滴B液，用玻璃移液棒充分混匀，同时避免产生气泡。涡旋混匀溶液。

将A溶液和B溶液短暂放回24摄氏度培养箱，取出C溶液。向AB混合液中加入六滴C溶液。再次使用移液管混合，随后涡旋振荡，注意避免产生气泡。

立即使用此最终混合液。用一对干净的抗磁镊子将液滴滴加到载样片上。将载网放置于混合液上。

这是银增强反应。根据实验所需的增强程度，将载网放置六到十五分钟。从混合液中取出载网，并在Perfil上依次快速通过六滴双蒸水，最后三次洗涤置于24摄氏度。

每滴水处理七分钟。若进行真实实验，在清洗完成后重新打开光源。随后通过免疫金标记或膜染色对结果进行可视化，以用于电镜观察。

不同类型的酵母内体区室可通过纳米金银增强标记，并通过电子显微镜进行观察。纳米金孵育5分钟可标记质膜以及早期内体区室，例如可能是内吞囊泡的单个囊泡和极可能是早期内体的管状结构。纳米金孵育30分钟则可标记晚期内体或多泡体。

将免疫电镜技术与这种纳米金银增强方案相结合的分辨率能力，通过所展示细胞器形态的保存程度和质量得以凸显，尤其是多泡体内的内部囊泡。在使用银增强方法之前，有必要进行预实验，以确定银颗粒大小和均匀性所需的最优孵育时间。遵循本实验步骤。

还可以进行其他方法，例如免疫标记，以回答特定蛋白质在细胞器特定区域定位的问题。