珠聚集测定假定的细胞粘附分子的表征
2014年10月17日
在这里，我们提出了一种简单、快速的方法，用于表征推定的细胞粘附分子的内在粘附特性。 细胞粘附分子的分泌的、带有表位标记的胞外域从培养基中捕获在小的、均匀的功能化珠子上。 然后，这些微珠可立即用于简单的微珠聚集分析。
该程序的总体目标是测试蛋白质胞外结构域介导嗜同性粘附的能力，以实现将编码胞外结构域片段与人 IgG 的 FC 区融合的质粒转染到 HEC 2 93 细胞中。分泌的 Odin FC 融合蛋白被捕获在与蛋白 G 偶联的磁珠上，洗涤后，包被的磁珠在溶液中相互作用。然后对包被的珠子进行成像以评估聚集的程度，最后进行量化 使用简单的图像分析，所得数据揭示了蛋白质研究是否能够介导嗜同性粘附。
与细胞聚集测定等现有方法相比，该技术的主要优点是它快速、简单，并且直接测试所选蛋白质的粘附活性。演示这项技术的将是实验室的高级科学家 Michelle Eman 博士。在转染前 2 至 3 天，在此处 ECFC 准备用于 NCA 的培养细胞，以开始此程序。
在 EDTA 中使用 0.05% 脱印组从培养皿中分离 HEC 2 93 细胞。为每种情况准备两个 100 毫米的培养皿。将细胞 1 到 5 分开，然后培养它们。
补充生长培养基。在 37 摄氏度下用 5% 二氧化碳孵育细胞，直到它们达到 60% 至 80% 汇合。在转染当天，使用 lipo 等试剂引入编码 FC 融合的质粒。
转染后，在转染后第二天将细胞放回培养箱中 24 小时预热，含五级链球菌且不含胎牛血清的 DMEM，温度为 37 °C。用 10 毫升加热的培养基冲洗每个培养皿两次，然后在孵育后将培养皿放回 37 摄氏度培养箱中 1 小时，用 10 毫升不含胎牛血清的 DMEM 再次冲洗培养皿一次，总共洗涤 3 次，然后将横切细胞在 37 摄氏度下再孵育 48 小时，然后收集培养基。转染后 4 天，使用血清移液器从每对培养皿中收集培养基，并将其转移到 50 mL 锥形管中。
然后以每 5 分钟 500 Gs 的速度离心培养基，以沉淀离心后的细胞碎片，将每个 50 毫升锥形管中的培养基倒入 30 毫升注射器中，并通过 0.45 微米注射器过滤。过滤到离心浓缩器中。旋转离心过滤器，直到浓缩培养基的体积减少到大约 500 微升。
这大约需要 15 分钟。重复此过程，直到添加并浓缩所有培养基。接下来，在 1.5 ml 微量离心管中，对于每个样品，将 1.5 μL 蛋白 G 磁珠加入 1 mL 冰冷结合缓冲液中。
该程序最困难的方面是微珠聚集。为确保成功，请务必严格遵循程序。快速观察珠子，但不要太严厉。
切勿让它们在管的侧面干燥或在磁铁上停留太久。将试管放在磁铁上，用移液管吸出缓冲液。然后立即将浓缩的培养基添加到蛋白 G 磁珠中。
在 4 摄氏度下旋转试管 2 小时。将试管放在磁铁上并快速去除培养基。用 1 毫升冰冷的结合缓冲液洗涤磁珠两次，然后将磁珠重悬于 300 微升结合缓冲液中。
将重悬的珠子分成两个管，每个管中 150 μL。然后分别加入 1.5 微升氯化钙或 EDTA 用于钙和无钙条件。将 100 μL 从每种情况转移到凹陷中。
使用透射光显微镜进行滑玻片。在每个所需时间点从每个实验的五个视野中收集图像。使用图像 J 或类似的图像分析软件。
在下拉菜单中打开图像 J 中五个图像数据集之一。在屏幕顶部，选择 file （文件）。然后选择 import，然后选择 image sequence。
找到包含图像文件的文件夹，然后以图像堆栈的形式打开它们。接下来，在下拉菜单栏中，单击图像，然后选择 属性.在此处打开属性窗口。
将图像单位更改为 pixel，并将 pixel width 和 pixel height 设置为 1.0。再次单击图像，选择 调整 然后 阈值 以打开阈值窗口，并使用滑块调整图像阈值。包括对珠子有贡献的像素，并排除和小颗粒。
将阈值应用于图像堆栈中的所有图像。下一步 在屏幕顶部的下拉菜单栏中。点击 analyze。
然后选择 Set measurements （设置测量） 以打开测量对话框，使用屏幕顶部的复选框 select area （区域） 和 stack position （堆栈位置）。单击 analyze（分析），然后选择 analyze particles（分析粒子）。这将生成一个已识别粒子的列表，包括它们的大小和识别它们的图像。
对每个实验和每个实验条件重复此过程，以确定斑马鱼和钙粘蛋白的钙依赖性粘附能力。用 NCAT herrin OD 结构域转染 HEC 2、9、3 细胞，融合两个 fc，然后按照本视频中的描述对钙依赖性微珠聚集细胞进行成像和分析，如这些图像所示。在没有钙的情况下，珠子几乎没有聚集的趋势，并且在钙存在下，聚集体大小不会随着时间的推移而增加。
然而，涂有 NCAT 和 ECFC 的 beats 显示出强大的聚集性，聚集体尺寸随着时间的推移而增加，作为粘附力的半定量测量。分析来自三个实验的透射光图像以确定聚集体的平均大小。从该图中可以看出，在钙存在和无钙的情况下，每隔 15 分钟测定一次 ncoer ECFC 包被珠子的聚集。
在一个小时内，这些数据揭示了斑马鱼 n 钙粘蛋白的胞外结构域介导钙依赖性嗜同菌性粘附。观看本视频后，您应该对如何测试粘附是否是目标蛋白质的内在生化特性有很好的了解。
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概述
本文介绍了一种快速方法，用于使用胞外区碎片来表征细胞粘附分子的粘附特性。该技术涉及捕获功能化珠子上分泌的、带有表位标记的胞外区，以进行珠子聚集分析。
关键研究组成部分
科学领域
- 细胞粘附
- 蛋白质相互作用
- 生化分析
背景
- 理解细胞粘附对于各种生物过程至关重要。
- 传统方法可能耗时且复杂。
- 该方法旨在简化蛋白质粘附特性的评估。
- 同源粘附是该研究的重点。
研究目的
- 开发一种快速简单的方法来测试蛋白质胞外区粘附。
- 评估特定蛋白质的粘附活性。
- 改进现有的细胞聚集分析。
所用方法
- 将编码胞外区碎片的质粒转染到 HEC 2 93 细胞中。
- 捕获连接到蛋白质 G 的磁珠上分泌的 FC 融合蛋白。
- 包衣珠子在溶液中的相互作用，随后进行成像。
- 通过图像分析定量珠子聚集。
主要结果
- 该方法允许直接测试蛋白质的粘附能力。
- 结果表明蛋白质是否能够介导同源粘附。
- 已证明比传统方法更快、更简单。
- 提供了一种研究细胞粘附分子的可靠方法。
结论
- 该技术提供了一种评估蛋白质粘附的简化方法。
- 它在生物研究的各个领域中具有潜在应用。
- 未来的研究可以在此方法基础上探索其他粘附特性。
常见问题
Executive Industry Relevance
Rapid characterization of cell adhesion molecules is critical for de-risking early discovery targets and clarifying mechanistic hypotheses in cell biology-driven therapeutic programs. The bead aggregation assay enables direct, quantitative assessment of homophilic adhesion properties, supporting predictive confidence in target selection and functional validation. This streamlined workflow reduces ambiguity in protein function, accelerating portfolio triage and prioritization at the discovery inflection point.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct interrogation of protein-mediated cell adhesion mechanisms for target validation.
- Supports biological de-risking by distinguishing intrinsic adhesive properties of candidate molecules.
- Facilitates rapid functional assessment to inform go/no-go decisions in early-stage programs.
- Provides a platform for mutagenesis studies to map critical adhesion domains.
Screening & Assay Development
- Delivers a reproducible, quantitative assay for evaluating adhesive activity of protein ectodomains.
- Standardizes measurement of bead aggregation, supporting assay transferability and scalability.
- Enables preparation of validated bead-based systems for downstream compound screening or mechanistic studies.
- Reduces reliance on stable cell lines, increasing throughput and flexibility.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant mechanisms where cell adhesion is implicated in pathology.
- Supports continuity from discovery through preclinical validation by enabling mechanistic de-risking.
- Provides semi-quantitative outputs that can inform translational biomarker strategies when relevant.
Pipeline & Workflow Integration
This bead aggregation assay fits within the early discovery to lead identification continuum, providing a bridge between molecular characterization and functional screening.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing for cell adhesion function and pathway mapping.
- Screening: Offers quantitative, reproducible readouts for comparing protein variants or conditions.
- Analytics: Generates image-based measurements of aggregate size and kinetics for robust statistical analysis.
- Translational Research: Connects mechanistic findings to disease models where adhesion is a key driver.
- Enterprise Reuse: Establishes a modular assay platform adaptable to diverse protein targets and mutational analyses.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target function and reduces mechanistic ambiguity.
- Operational Value: Streamlines workflows with rapid, scalable, and standardized assay procedures.
- Strategic Value: Enables earlier, data-driven go/no-go decisions and capital-efficient resource allocation.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of adhesion-related targets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in molecular cloning, cell culture, and quantitative image analysis.
- Needs access to protein G magnetic beads, imaging systems, and analysis software such as ImageJ.
- Demands strict adherence to protocol for reproducibility and cross-team standardization.
- Can be adapted to different protein targets and mutational studies with minimal optimization.
- Limited by the need for soluble ectodomain expression and bead compatibility with target proteins.
