用于表征候选细胞黏附分子的微珠聚集实验
2014年10月17日
本文介绍一种简单、快速的方法，用于表征假定细胞黏附分子的内在黏附特性。将细胞黏附分子分泌的、带有表位标签的胞外结构域从培养基中捕获至小型、均一的功能化微珠上。随后可立即利用这些微珠进行简单的微珠聚集实验。
本实验的总体目标是检测蛋白质胞外域介导同嗜性黏附的能力。为此，将编码胞外域片段与人 IgG 的 FC 区域融合的质粒转染至 HEC 293 细胞中。分泌的 Odin-Fc 融合蛋白被偶联了蛋白 G 的磁珠捕获，经洗涤后，使包被的磁珠在溶液中相互作用。随后对磁珠进行成像，以评估其聚集程度，并最终通过简单的图像分析进行定量。所得数据可揭示被研究蛋白是否具有介导同嗜性黏附的能力。
与现有的细胞聚集实验等方法相比，该技术的主要优势在于快速、简便，并且能够直接检测所选蛋白质的黏附活性。演示该技术的是来自实验室的高级科学家 Dr. Michelle Eman。在转染前两到三天，开始准备用于NCA实验的培养细胞（此处为ECFC）。
使用含EDTA的0.05%胰蛋白酶消化液将HEC 293细胞从培养皿中分离。每种条件准备两个100毫米培养皿。按1:5比例传代细胞，然后进行培养。
添加补充物的生长培养基。将细胞在37摄氏度、5%二氧化碳条件下孵育，直至细胞融合度达到60%至80%。在转染当天，使用脂质体转染试剂（如lipo）导入编码FC融合蛋白的质粒。
转染后，将细胞放回培养箱中培养24小时。转染次日，将不含胎牛血清但含有青霉素-链霉素的DMEM预热至37摄氏度。用10毫升预热的培养基将每块培养皿清洗两次，然后将培养皿放回37摄氏度培养箱中继续孵育1小时。孵育结束后，再用10毫升不含胎牛血清的DMEM对培养皿清洗一次，共计清洗三次。随后，将转染后的细胞在37摄氏度下继续培养48小时，之后收集培养基。转染后第四天，使用血清移液管从每对培养皿中收集培养基，并转移至50毫升锥形管中。
随后将培养基在500 × g条件下离心5分钟，以沉淀细胞碎片；离心后，将每支50毫升锥形管中的培养基倒入30毫升注射器中，并通过0.45微米的注射器滤器进行过滤。将滤液收集至超滤离心浓缩管中。离心过滤直至浓缩后的培养基体积减少至约500微升。
此过程大约需要15分钟。重复此步骤，直至所有培养基均已被加入并浓缩。接下来，为每个样品准备一个1.5毫升的微量离心管，向其中加入1.5微升蛋白G磁珠和1毫升冰上预冷的结合缓冲液。
该实验步骤中最困难的部分是磁珠的聚集。为确保成功，务必严格遵循操作流程。需迅速观察磁珠，但避免过于剧烈地操作。
切勿让其在离心管管壁上干燥，或在磁铁上放置过久。将离心管置于磁铁上，用移液器吸除缓冲液，随后立即向蛋白G磁珠中加入浓缩培养基。
将离心管在 4 摄氏度下旋转孵育两小时。将离心管置于磁力架上，迅速移除上清液。用一毫升冰预冷的结合缓冲液洗涤磁珠两次，然后将磁珠重悬于 300 微升结合缓冲液中。
将重悬的磁珠均分至两个离心管中，每管150 µL。随后，分别向钙离子组和无钙组中加入1.5 µL的氯化钙或EDTA。从每种条件下转移100 µL至凹孔中。
使用透射光显微镜观察多孔载玻片。在每次实验的每个所需时间点，采集五个视野的图像。使用 ImageJ 或类似的图像分析软件进行分析。
在下拉菜单中，使用 ImageJ 打开五个图像数据集之一。在屏幕顶部，选择文件，然后选择导入，再选择图像序列。
找到包含图像文件的文件夹，然后将其作为图像堆栈打开。接着在下拉菜单栏中，单击“image”，然后选择“properties”。以打开其中的属性窗口。
将图像单位更改为像素，并将像素宽度和像素高度设置为 1.0。再次点击图像，选择“调整”，然后选择“阈值”以打开阈值窗口，使用滑块调整图像阈值。包含构成微珠的像素，排除小颗粒。
将阈值应用于图像堆栈中的所有图像。接下来，在屏幕顶部的下拉菜单栏中，点击“analyze”。
然后，选择“设置测量”以打开测量对话框，使用屏幕顶部的复选框选择“面积”和“堆栈位置”。单击“分析”，然后选择“分析颗粒”。这将生成一个已识别颗粒的列表，包括颗粒的大小以及识别出该颗粒的图像。
针对每个实验和每种实验条件重复此过程，以确定斑马鱼钙黏蛋白的钙依赖性黏附能力。将含有NCAT herrin OD结构域与两个fc融合的质粒转染至HEC 2 9 3细胞中，随后进行钙依赖性微珠聚集实验，并按照本视频所述方法对细胞进行成像和分析，结果如图中所示。在无钙条件下，微珠几乎不发生聚集；而在有钙条件下，聚集物的尺寸随时间无明显增加。
然而，此处涂有 NCAT 的磁珠与 ECFC 表现出显著的聚集现象，聚集物的尺寸随时间逐渐增大，可作为黏附能力的半定量指标。通过分析三次实验的透射光图像，确定了聚集物的平均尺寸。从该图中可以看出，在有钙离子和无钙离子条件下，ncoer ECFC 包被磁珠的聚集情况均以 15 分钟为间隔进行了测定。
在一个小时内，这些数据表明斑马鱼N-钙黏蛋白的胞外结构域介导了钙依赖性的同亲性黏附。观看本视频后，您应能够充分理解如何验证黏附是否为您所关注蛋白的内在生化特性。
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概述
本文介绍了一种利用胞外域片段快速表征细胞黏附分子黏附特性的方法。该技术通过将分泌型、带有表位标签的胞外域捕获在功能化微珠上，用于微珠聚集实验。
关键研究组成部分
科学领域
- 细胞黏附
- 蛋白质相互作用
- 生物化学检测
背景
- 理解细胞黏附对于多种生物学过程至关重要。
- 传统方法可能耗时且复杂。
- 该方法旨在简化对蛋白质黏附特性的评估。
- 同亲性黏附是本研究的重点。
研究目的
- 建立一种快速简便的蛋白质胞外结构域黏附性检测方法。
- 评估特定蛋白质的黏附活性。
- 改进现有的细胞聚集实验方法。
使用的方法
- 将编码胞外域片段的质粒转染至HEK 293细胞。
- 利用与蛋白G偶联的磁珠捕获分泌的Fc融合蛋白。
- 溶液中包被磁珠的相互作用，随后进行成像。
- 通过图像分析对磁珠聚集进行定量。
主要结果
- 该方法可用于直接检测蛋白质的黏附能力。
- 结果可表明该蛋白质是否能够介导同嗜性黏附。
- 已被证明比传统方法更快速、更简便。
- 为研究细胞黏附分子提供了一种可靠的途径。
结论
- 该技术为评估蛋白质黏附性提供了一种简化的途径。
- 它在生物研究的多个领域具有潜在应用价值。
- 未来的研究可在此方法基础上进一步探索其他黏附特性。
常见问题
行业高管相关性
对细胞黏附分子进行快速表征，对于降低早期发现靶点的风险以及阐明细胞生物学驱动的治疗项目中的机制假说至关重要。微珠聚集实验可实现对同源性黏附特性的直接、定量评估，有助于提高靶点选择和功能验证的预测可信度。这一简化的实验流程减少了蛋白质功能判断的不确定性，可在发现阶段的关键节点加速项目组合的筛选与优先级排序。
生物制药研发中的战略应用
早期发现与靶点验证
- 可直接研究蛋白质介导的细胞黏附机制，用于靶点验证。
- 通过区分候选分子的内在黏附特性，支持生物学层面的风险评估。
- 实现快速功能评估，为早期项目中的立项或终止决策提供依据。
- 提供突变研究平台，用于绘制关键黏附功能域。
筛选与检测方法开发
- 提供一种可重复的定量检测方法，用于评估蛋白胞外域的黏附活性。
- 标准化微球聚集的测量，支持检测方法的可转移性和可扩展性。
- 实现经验证的基于微球的系统制备，用于下游化合物筛选或机制研究。
- 减少对稳定细胞系的依赖，提高通量和灵活性。
转化与临床前研究
- 与疾病相关机制一致，其中细胞黏附参与病理过程。
- 通过实现机制性风险降低，支持从发现到临床前验证的连续性研究。
- 提供半定量结果，可在适当时为转化生物标志物策略提供依据。
流程与工作流整合
这种微珠聚集实验适用于从早期发现到先导物鉴别的连续过程，为分子表征与功能筛选之间提供了桥梁。
- 发现生物学：支持细胞黏附功能的假设验证及通路图谱绘制。
- 筛选：提供定量、可重复的检测读数，用于比较蛋白质变体或不同条件。
- 分析：生成基于图像的聚集体大小和动力学测量数据，支持可靠的统计分析。
- 转化研究：将机制性发现与黏附作为关键驱动因素的疾病模型相联系。
- 企业级复用：建立可模块化适配于多种蛋白质靶标及突变分析的检测平台。
运营与企业影响
- 科学价值：提高对靶点功能的预测可信度，并减少机制上的不确定性。
- 操作价值：通过快速、可扩展且标准化的检测流程，简化工作流程。
- 战略价值：实现更早期基于数据的决策，判断项目是否继续推进，并优化资本使用效率的资源配置。
- 项目组合影响：支持对黏附相关靶点进行风险调整后的优先排序与推进。
实施注意事项
- 需要具备分子克隆、细胞培养和定量图像分析方面的专业知识。
- 需要能够使用蛋白G磁珠、成像系统以及ImageJ等分析软件。
- 要求严格遵守实验方案，以确保可重复性及跨团队标准化。
- 经过 minimal 优化后，可适用于不同的蛋白质靶标及突变研究。
- 受限于目标蛋白可溶性胞外域的表达以及磁珠与目标蛋白的兼容性。
