Name: 珠聚集测定假定的细胞粘附分子的表征 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-10-17T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 15 s
Description: 了解利用珠聚集测定法表征细胞粘附分子的快速方法。该技术通过捕获分泌型外结构域片段于功能化磁珠上，直接检测蛋白质的同型粘附活性，为研究细胞粘附提供简便可靠的生化分析手段。

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本工作得到了美国国家科学基金会/美国复苏与再投资法案资助（IOS 0920357）以及美国国立卫生研究院资助（5R21MH098463）的支持。

1. 细胞准备（第 -2 天至第 0 天）
<ol>
	<li>使用0.05%胰蛋白酶-EDTA溶液以1:5比例传代HEK293细胞，并在37 °C、5% CO2条件下于生长培养基中培养至60–80%汇合度（2–3天）。每种实验条件需在2个100 mm培养皿中分别培养细胞。</li>
</ol>
2. 细胞转染（第1天）
<ol>
	<li>使用转染试剂（如Lipofectamine）将编码Fc融合蛋白的质粒转染HEK293细胞。也可采用其他能达到相当转染效率的替代方法。</li>
	<li>将转染后的细胞放回培养箱中孵育24小时。</li>
</ol>
3. 细胞传代（第2天）
<ol>
	<li>将不含胎牛血清（-FBS）的生长培养基预热至 37 °C。</li>
	<li>用 10 ml 不含胎牛血清的生长培养基（-FBS）冲洗培养皿 2 次，并将培养皿放回 37 °C 培养箱中孵育 1 小时。</li>
	<li>再用 10 ml 不含胎牛血清的生长培养基（-FBS）冲洗培养皿一次，共计洗涤 3 次。</li>
	<li>转染后的 HEK293 细胞在无 FBS 条件下于 37 °C 继续孵育 48 小时，然后收集培养上清。</li>
</ol>
4. 磁珠聚集（第4天）
<ol>
	<li>收集培养皿中的培养基时，将每对培养皿中的培养基转移至50 ml锥形管中，在500 × g条件下离心5分钟，以沉淀细胞碎片。</li>
	<li>使用30 ml注射器和0.45 µm注射式滤器，将50 ml锥形管中的培养基过滤至离心过滤装置中。</li>
	<li>在4,000 × g、4 °C条件下离心过滤装置，直至浓缩后的培养基体积约为500 µl（约15分钟）。重复此步骤，直至所有培养基均完成添加与浓缩。</li>
	<li>每个样品取1.5 µl Protein G磁珠，加入含1 ml冰冻结合缓冲液的1.5 ml微量离心管中，置于磁力架上并吸除缓冲液。立即向Protein G磁珠中加入浓缩后的培养基。</li>
	<li>在4 °C条件下旋转孵育2小时。</li>
	<li>将离心管置于磁力架上，吸除上清液。用1 ml冰冻结合缓冲液快速洗涤磁珠两次，然后将磁珠重悬于300 µl结合缓冲液中。</li>
	<li>将重悬的磁珠均分至两个离心管中，每管150 µl，随后分别加入1.5 µl 200 mM CaCl2（“含钙”条件）或200 mM EDTA（“无钙”条件）。</li>
	<li>从每种条件下各取100 µl转移至凹孔载玻片中，使用透射光显微镜采集显微图像（图2）。在每个实验的每个目标时间点，采集五个视野的图像。</li>
</ol>
5. 数据分析
<ol>
	<li>使用 ImageJ 或类似的图像分析软件，通过 文件 下拉菜单中的 导入/图像序列… 功能打开五个图像数据集中的一个。这些图像将作为图像堆栈打开。</li>
	<li>在 图像/属性… 对话框中，将图像单位更改为像素，并将像素宽度和像素高度均设置为 1.0。</li>
	<li>使用 图像 下拉菜单中的 调整/阈值… 命令将图像转换为二值图像。设置阈值以包含构成微珠或微珠聚集体的像素，同时排除背景和微小颗粒。将该阈值应用于堆栈中的所有图像。</li>
	<li>在 设置测量 对话框中，选中 面积 和 堆栈位置 选项。</li>
	<li>在 分析 下拉菜单中运行 分析粒子… 功能。这将生成一个已识别粒子的列表，包括每个粒子的大小（面积）及其被识别所在的图像。</li>
	<li>对每个实验及实验条件重复此过程。</li>
</ol>

<ol><li>Chen, X., Gumbiner, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paraxial+protocadherin+mediates+cell+sorting+and+tissue+morphogenesis+by+regulating+C-cadherin+adhesion+activity%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Paraxial protocadherin mediates cell sorting and tissue morphogenesis by regulating C-cadherin adhesion activity.</a> J. Cell Biol. 174 (2), 301-313 (2006).</li>
<li>Grumet, M., Friedlander, D. R., Edelman, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+the+binding+of+Ng-CAM+to+laminin%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Adhes.+Commun%22%5BJournal%5D)">Evidence for the binding of Ng-CAM to laminin.</a> Cell Adhes. Commun. 1 (2), 177-190 (1993).</li>
<li>Hatta, K., Nose, A., Nagafuchi, A., Takeichi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cloning+and+expression+of+cDNA+encoding+a+neural+calcium-dependent+cell+adhesion+molecule%3A+its+identity+in+the+cadherin+gene+family%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Cloning and expression of cDNA encoding a neural calcium-dependent cell adhesion molecule: its identity in the cadherin gene family.</a> J. Cell Biol. 106 (3), 873-881 (1988).</li>
<li>Hirano, S., Nose, A., Hatta, K., Kawakami, A., Takeichi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium-dependent+cell-cell+adhesion+molecules+%28cadherins%29%3A+subclass+specificities+and+possible+involvement+of+actin+bundles%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Calcium-dependent cell-cell adhesion molecules (cadherins): subclass specificities and possible involvement of actin bundles.</a> J. Cell Biol. 105 (6 Pt 1), 2501-2510 (1987).</li>
<li>Nose, A., Nagafuchi, A., Takeichi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expressed+recombinant+cadherins+mediate+cell+sorting+in+model+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Expressed recombinant cadherins mediate cell sorting in model systems.</a> Cell. 54 (7), 993-1001 (1988).</li>
<li>Nose, A., Takeichi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+cadherin+cell+adhesion+molecule%3A+its+expression+patterns+associated+with+implantation+and+organogenesis+of+mouse+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">A novel cadherin cell adhesion molecule: its expression patterns associated with implantation and organogenesis of mouse embryos.</a> J. Cell Biol. 103 (6 Pt 2), 2649-2658 (1986).</li>
<li>Schreiner, D., Weiner, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combinatorial+homophilic+interaction+between+gamma-protocadherin+multimers+greatly+expands+the+molecular+diversity+of+cell+adhesion%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Combinatorial homophilic interaction between gamma-protocadherin multimers greatly expands the molecular diversity of cell adhesion.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 107 (33), 14893-14898 (2010).</li>
<li>Takeichi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+correlation+between+cell+adhesive+properties+and+some+cell+surface+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Functional correlation between cell adhesive properties and some cell surface proteins.</a> J. Cell Biol. 75, 464-474 (1977).</li>
<li>Sivasankar, S., Brieher, W., Lavrik, N., Gumbiner, B., Leckband, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+molecular+force+measurements+of+multiple+adhesive+interactions+between+cadherin+ectodomains%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Direct molecular force measurements of multiple adhesive interactions between cadherin ectodomains.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 96 (21), 11820-11824 (1999).</li>
<li>Sivasankar, S., Gumbiner, B., Leckband, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+measurements+of+multiple+adhesive+alignments+and+unbinding+trajectories+between+cadherin+extracellular+domains%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Direct measurements of multiple adhesive alignments and unbinding trajectories between cadherin extracellular domains.</a> Biophys. J. 80, 1758-1768 (2001).</li>
<li>Sivasankar, S., Zhang, Y., Nelson, W. J., Chu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterizing+the+initial+encounter+complex+in+cadherin+adhesion%5BTitle%5D)+AND+%22Structure%22%5BJournal%5D)">Characterizing the initial encounter complex in cadherin adhesion.</a> Structure. 17 (8), 1075-1081 (2009).</li>
<li>Zhang, Y., Sivasankar, S., Nelson, W. J., Chu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resolving+cadherin+interactions+and+binding+cooperativity+at+the+single-molecule+level%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Resolving cadherin interactions and binding cooperativity at the single-molecule level.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 106 (1), 109-114 (2009).</li>
<li>Yasuda, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activity-induced+protocadherin+arcadlin+regulates+dendritic+spine+number+by+triggering+N-cadherin+endocytosis+via+TAO2beta+and+p38+MAP+kinases%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Activity-induced protocadherin arcadlin regulates dendritic spine number by triggering N-cadherin endocytosis via TAO2beta and p38 MAP kinases.</a> Neuron. 56 (3), 456-471 (2007).</li>
<li>Chappuis-Flament, S., Wong, E., Hicks, L. D., Kay, C. M., Gumbiner, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+cadherin+extracellular+repeats+mediate+homophilic+binding+and+adhesion%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Multiple cadherin extracellular repeats mediate homophilic binding and adhesion.</a> J. Cell Biol. 154 (1), 231-243 (2001).</li>
<li>Emond, M. R., Biswas, S., Blevins, C. J., Jontes, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+complex+of+Protocadherin-19+and+N-cadherin+mediates+a+novel+mechanism+of+cell+adhesion%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">A complex of Protocadherin-19 and N-cadherin mediates a novel mechanism of cell adhesion.</a> J. Cell Biol. 195 (7), 1115-1121 (2011).</li>
<li>Biswas, S., Emond, M. R., Jontes, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+clustered+protocadherins+Pcdhalpha+and+Pcdhgamma+form+a+heteromeric+complex+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The clustered protocadherins Pcdhalpha and Pcdhgamma form a heteromeric complex in zebrafish.</a> Neuroscience. 219, 280-289 (2012).</li>
<li>Blevins, C. J., Emond, M. R., Biswas, S., Jontes, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+expression%2C+alternative+splicing%2C+and+adhesive+properties+of+the+zebrafish+delta1-protocadherins%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Differential expression, alternative splicing, and adhesive properties of the zebrafish delta1-protocadherins.</a> Neuroscience. 199, 523-534 (2011).</li>
<li>Morishita, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+the+cadherin-related+neuronal+receptor%2Fprotocadherin-alpha+first+extracellular+cadherin+domain+reveals+diversity+across+cadherin+families%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Structure of the cadherin-related neuronal receptor/protocadherin-alpha first extracellular cadherin domain reveals diversity across cadherin families.</a> J. Biol. Chem. 281, 33650-33663 (1074).</li>
<li>Wojtowicz, W. M., Flanagan, J. J., Millard, S. S., Zipursky, S. L., Clemens, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alternative+splicing+of+Drosophila+Dscam+generates+axon+guidance+receptors+that+exhibit+isoform-specific+homophilic+binding%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Alternative splicing of Drosophila Dscam generates axon guidance receptors that exhibit isoform-specific homophilic binding.</a> Cell. 118 (5), 619-633 (2004).</li>
<li>Drees, F., Reilein, A., Nelson, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-adhesion+assays%3A+fabrication+of+an+E-cadherin+substratum+and+isolation+of+lateral+and+Basal+membrane+patches%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Cell-adhesion assays: fabrication of an E-cadherin substratum and isolation of lateral and Basal membrane patches.</a> Methods Mol. Biol. 294, 303-320 (2005).</li>
</ol>

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

细胞黏附是多细胞生命的基本特征，由多种细胞表面蛋白介导。然而，其中仅有相对较少部分的黏附特性被深入理解。本文介绍了一种简单、快速的实验方案，用于研究分泌型胞外结构域与常用表位标签融合蛋白的同嗜性黏附能力。该方法具有多项重要优势：首先，无需构建稳定表达的细胞系14,20，因为通过瞬时转染100 mm培养皿即可获得足量的蛋白质。这使得能够对更大量的构建体进行筛选—— 例如， 定点或缺失突变体——而无需耗费大量资源构建和维持众多细胞系。其次，这些珠粒检测法可在简化体系中直接检验假定黏附分子的生化特性，从而将黏附效应直接归因于所研究的蛋白质，而非潜在的间接作用。第三，为研究可能的辅助因子效应，可将细胞共转染表达分泌型的假定黏附分子及其假定辅助因子，二者分别带有不同的表位标签。此外，该方法具有灵活性，可适配多种合适的表位标签。例如，已有商品化均一尺寸的磁珠，其表面偶联有Protein A或G（Fc标签）、链霉亲和素（Strep II标签）、谷胱甘肽（GST标签）或TALON/Ni:NTA（6x His标签）。最后，荧光珠粒的可获得性使得同一实验方案可进一步拓展为简单的分选检测，用于研究同嗜性特异性。在此情况...

细胞间黏附对于多细胞生物的发育和结构完整性至关重要，主要由多种细胞表面分子介导。尽管已有许多黏附分子被鉴定和表征，但仍有许多尚未被发现。目前有多种方法用于研究细胞黏附分子（CAMs）的特性，包括细胞分选实验、细胞聚集实验1-8以及生物物理方法，如原子力显微镜和表面力谱法9-12。
即使使用细胞系的简化体外（in vitro）系统也具有复杂性，这使得确定一种假定的细胞黏附分子（CAM）的黏附特性变得困难。通常，如果一个分子在转染到非黏附性细胞系后能够诱导细胞聚集，则被认为是一种CAM。然而，这显然并非黏附活性的直接证据。例如，促进CAM在细胞表面的递送或稳定性也会导致细胞聚集增加1,13。此外，如果细胞系缺乏细胞表面递送或稳定所必需的其他辅助因子，真正的CAM也可能无法介导细胞聚集。
为避免这些复杂因素，可采用更为直接的检测方法，其原理基于黏附相互作用应为细胞外结构域固有的生化特性。尽管最初使用微珠来表征Ng-CAM2，但此类检测方法已被拓展用于研究钙黏蛋白介导的黏附作用12,14,15。Gumbiner实验室通过C-钙黏蛋白胞外域与Fc片段的融合蛋白发现，多个钙黏蛋白重复序列均参与同嗜性相互作用14。利用类似的微珠聚集检测方法，E-钙黏蛋白和N-钙黏蛋白的黏附特性也已被表征12,15，此外还包括多种原钙黏蛋白1,15-18以及来自Drosophila19的Dscam异构体。本文中，我们描述了一种相对简单且快速的检测方法，用于表征分泌型、表位标签标记的假定同嗜性细胞黏附分子（CAMs）胞外域的黏附活性（图1）。我们主要利用该方法对钙黏蛋白超家族成员进行表征。

<table><tbody><tr><td>pFc-N1 质粒</td><td>Addgene</td><td>&lt;span style=&quot;颜色：红色&quot;&gt;&lt;强&gt;待提交&lt;/strong&gt;&lt;/span&gt;</td><td></td></tr><tr><td>HEK293细胞</td><td>美国典型培养物保藏中心</td><td>CRL-1573</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Mediatech - Corning</td><td>10-013-CV</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清（FBS）</td><td>Sigma</td><td>F2442</td><td></td></tr><tr><td>100倍青霉素-链霉素溶液（10,000 U/ml）</td><td>Life Technologies</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>0.05% 胰蛋白酶-EDTA</td><td>Life Technologies</td><td>25300054</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000</td><td>Life Technologies</td><td>11668030</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads &amp;ndash; Protein G</td><td>Life Technologies</td><td>10003D</td><td></td></tr><tr><td>牛血清白蛋白</td><td>Sigma</td><td>A3294</td><td></td></tr><tr><td>抑郁症幻灯片</td><td>电子显微镜科学公司</td><td>71878-06</td><td></td></tr><tr><td>Amicon Ultra-15 离心滤过装置（Ultracel-10 膜）</td><td>Millipore</td><td>UFC901024</td><td></td></tr><tr><td>0.45 mm 注射器滤器</td><td>Sarstedt</td><td>83.1826</td><td></td></tr><tr><td>Dynamag-2 磁铁</td><td>Life Technologies</td><td>12321D</td><td></td></tr><tr><td>Fiji（ImageJ）图像分析软件</td><td>&lt;a href=&quot;http://fiji.sc/Fiji&quot;&gt;http://fiji.sc/Fiji&lt;/a&gt;</td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">缓冲液/溶液表</td></tr><tr><td>培养基</td><td>DMEM + 10% FBS + 青霉素-链霉素</td><td>过滤除菌，4 ℃保存 &amp;deg;C.</td><td></td></tr><tr><td>培养基 &amp;ndash;FBS</td><td>DMEM + 青霉素-链霉素</td><td>过滤除菌，4 ℃ 保存 &amp;deg;C.</td><td></td></tr><tr><td>结合缓冲液</td><td>50 mM Tris，pH 7.4，100 mM NaCl，10 mM KCl，0.2% BSA</td><td>涡旋至溶解，置于冰上保存。</td><td></td></tr></tbody></table>

用于表征候选细胞黏附分子的微珠聚集实验

Bead Aggregation Assays for the Characterization of Putative Cell Adhesion Molecules

细胞间黏附对于多细胞生命至关重要，主要由多种细胞表面蛋白介导。然而，许多此类蛋白的黏附相互作用仍不清楚。本文介绍一种简单、快速的方法，用于表征假定的同嗜性细胞黏附分子的黏附特性。将编码细胞表面蛋白分泌型、表位标记的胞外域的DNA质粒转染至培养的HEK293细胞中。利用针对该表位标签的特异性功能化微珠，从培养基中捕获可溶性分泌的融合蛋白。包被后的微珠可直接用于微珠聚集实验或荧光微珠分选实验，以检测同嗜性黏附。如有需要，还可进一步通过定点突变技术解析介导黏附所必需的特定氨基酸或结构域。该方法仅需少量表达蛋白，无需构建稳定细胞系，可在4天内完成。

一个示例实验如下所示 图2，显示N-钙黏蛋白胞外域与Fc融合蛋白（NcadEC-Fc）介导的钙离子依赖性微珠聚集。在无钙离子条件下，微珠几乎不发生聚集，且随时间推移聚集体大小无明显增加（图1A、C）。在钙离子存在的情况下，包被有NcadEC-Fc的微珠表现出显著的聚集现象，且聚集体的尺寸随时间逐渐增大（图1B，C）。该实验重复进行了三次，每次实验包含五个非重叠视野的图像。对五个视野中每个聚集体的像素面积进行颗粒尺寸测定。对每次实验中每个时间点的数据进行平均。对三次实验的数据进行平均，以确定每个时间点的均值和测量标准误（图2C).
<img alt="用于受体分析的带有胞外域的蛋白质结构示意图。" src="/files/ftp_upload/51762/51762fig1highres.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 1"> 
图 1. 在磁珠聚集实验中使用...

本文介绍一种简单、快速的方法，用于表征假定细胞黏附分子的内在黏附特性。将细胞黏附分子分泌的、带有表位标签的胞外结构域从培养基中捕获至小型、均一的功能化微珠上。随后可立即利用这些微珠进行简单的微珠聚集实验。

细胞间黏附对于多细胞生命至关重要，由多种细胞表面蛋白介导。然而，这些黏附相互作用……

本实验的总体目标是检测蛋白质胞外域介导同嗜性黏附的能力。为此，将编码胞外域片段与人 IgG 的 FC 区域融合的质粒转染至 HEC 293 细胞中。分泌的 Odin-Fc 融合蛋白被偶联了蛋白 G 的磁珠捕获，经洗涤后，使包被的磁珠在溶液中相互作用。随后对磁珠进行成像，以评估其聚集程度，并最终通过简单的图像分析进行定量。所得数据可揭示被研究蛋白是否具有介导同嗜性黏附的能力。与现有的细胞聚集实验等方法相比，该技术的主要优势在于快速、简便，并且能够直接检测所选蛋白质的黏附活性。演示该技术的是来自实验室的高级科学家 Dr. Michelle Eman。在转染前两到三天，开始准备用于NCA实验的培养细胞（此处为ECFC）。使用含EDTA的0.05%胰蛋白酶消化液将HEC 293细胞从培养皿中分离。每种条件准备两个100毫米培养皿。按1:5比例传代细胞，然后进行培养。添加补充物的生长培养基。将细胞在37摄氏度、5%二氧化碳条件下孵育，直至细胞融合度达到60%至80%。在转染当天，使用脂质体转染试剂（如lipo）导入编码FC融合蛋白的质粒。转染后，将细胞放回培养箱中培养24小时。转染次日，将不含胎牛血清但含有青霉素-链霉素的DMEM预热至37摄氏度。用10毫升预热的培养基将每块培养皿清洗两次，然后将培养皿放回37摄氏度培养箱中继续孵育1小时。孵育结束后，再用10毫升不含胎牛血清的DMEM对培养皿清洗一次，共计清洗三次。随后，将转染后的细胞在37摄氏度下继续培养48小时，之后收集培养基。转染后第四天，使用血清移液管从每对培养皿中收集培养基，并转移至50毫升锥形管中。随后将培养基在500 × g条件下离心5分钟，以沉淀细胞碎片；离心后，将每支50毫升锥形管中的培养基倒入30毫升注射器中，并通过0.45微米的注射器滤器进行过滤。将滤液收集至超滤离心浓缩管中。离心过滤直至浓缩后的培养基体积减少至约500微升。此过程大约需要15分钟。重复此步骤，直至所有培养基均已被加入并浓缩。接下来，为每个样品准备一个1.5毫升的微量离心管，向其中加入1.5微升蛋白G磁珠和1毫升冰上预冷的结合缓冲液。该实验步骤中最困难的部分是磁珠的聚集。为确保成功，务必严格遵循操作流程。需迅速观察磁珠，但避免过于剧烈地操作。切勿让其在离心管管壁上干燥，或在磁铁上放置过久。将离心管置于磁铁上，用移液器吸除缓冲液，随后立即向蛋白G磁珠中加入浓缩培养基。将离心管在 4 摄氏度下旋转孵育两小时。将离心管置于磁力架上，迅速移除上清液。用一毫升冰预冷的结合缓冲液洗涤磁珠两次，然后将磁珠重悬于 300 微升结合缓冲液中。将重悬的磁珠均分至两个离心管中，每管150 µL。随后，分别向钙离子组和无钙组中加入1.5 µL的氯化钙或EDTA。从每种条件下转移100 µL至凹孔中。使用透射光显微镜观察多孔载玻片。在每次实验的每个所需时间点，采集五个视野的图像。使用 ImageJ 或类似的图像分析软件进行分析。在下拉菜单中，使用 ImageJ 打开五个图像数据集之一。在屏幕顶部，选择文件，然后选择导入，再选择图像序列。找到包含图像文件的文件夹，然后将其作为图像堆栈打开。接着在下拉菜单栏中，单击“image”，然后选择“properties”。以打开其中的属性窗口。将图像单位更改为像素，并将像素宽度和像素高度设置为 1.0。再次点击图像，选择“调整”，然后选择“阈值”以打开阈值窗口，使用滑块调整图像阈值。包含构成微珠的像素，排除小颗粒。将阈值应用于图像堆栈中的所有图像。接下来，在屏幕顶部的下拉菜单栏中，点击“analyze”。然后，选择“设置测量”以打开测量对话框，使用屏幕顶部的复选框选择“面积”和“堆栈位置”。单击“分析”，然后选择“分析颗粒”。这将生成一个已识别颗粒的列表，包括颗粒的大小以及识别出该颗粒的图像。针对每个实验和每种实验条件重复此过程，以确定斑马鱼钙黏蛋白的钙依赖性黏附能力。将含有NCAT herrin OD结构域与两个fc融合的质粒转染至HEC 2 9 3细胞中，随后进行钙依赖性微珠聚集实验，并按照本视频所述方法对细胞进行成像和分析，结果如图中所示。在无钙条件下，微珠几乎不发生聚集；而在有钙条件下，聚集物的尺寸随时间无明显增加。然而，此处涂有 NCAT 的磁珠与 ECFC 表现出显著的聚集现象，聚集物的尺寸随时间逐渐增大，可作为黏附能力的半定量指标。通过分析三次实验的透射光图像，确定了聚集物的平均尺寸。从该图中可以看出，在有钙离子和无钙离子条件下，ncoer ECFC 包被磁珠的聚集情况均以 15 分钟为间隔进行了测定。在一个小时内，这些数据表明斑马鱼N-钙黏蛋白的胞外结构域介导了钙依赖性的同亲性黏附。观看本视频后，您应能够充分理解如何验证黏附是否为您所关注蛋白的内在生化特性。

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生物工程

珠聚集测定假定的细胞粘附分子的表征

本文描述了一种用于测量当受体和配体均锚定在相互作用细胞表面时其相互作用动力学的黏附频率检测方法。该基于力学的检测方法以微管加压的人红细胞作为黏附传感器，并以整合素αLβ2和细胞间黏附分子-1作为相互作用的受体与配体进行示例说明。...

黏附频率检测 原位 细胞-细胞界面交叉连接分子相互作用的动力学分析

在本视频中，我们演示了通过HEK细胞聚集实验来检测突触细胞黏附分子之间跨细胞相互作用的技术。在该实验中，将表达目标突触前细胞黏附分子和一种荧光蛋白的HEK细胞，与表达突触后细胞黏附分子及另一种荧光蛋白的HEK细胞等量混合。细胞黏附分子之间的相互作用促使细胞发生聚集，可通过荧光显微镜进行观测和测量。...

检测细胞黏附分子间反式相互作用的细胞聚集实验

我们报告一种 体外 一种可定量内皮细胞单层中实际黏附细胞数量的方法。...

体外内皮细胞黏附性的定量分析 In Vitro

细菌附着于宿主细胞是宿主定植和感染过程中的关键步骤。本方案描述了制备聚合物偶联的重组黏附素作为仿生材料的方法，该材料可独立于其他细菌因子，用于分析单个黏附素在这些过程中所起的作用。...

用于表征细菌-宿主相互作用的仿生材料

该流动黏附实验为T细胞与上皮细胞相互作用提供了一个简单且高影响力的模型。通过注射泵产生剪切应力，并利用共聚焦显微镜采集图像以进行定量分析。这些研究的目标是在流动条件下有效量化T细胞的黏附情况。...

剪切应力下T淋巴细胞-黏附分子相互作用研究的黏附力检测方法

细胞表面黏附在机械转导过程中起核心作用，因其可传递机械张力并启动参与组织稳态与发育的信号通路。本文介绍一种利用配体包被的磁性微珠对黏附受体施加外力，以解析张力响应所激活的生化通路的实验方案。...

利用磁珠分析细胞表面黏附在机械张力作用下的重塑过程

本研究展示了定量测量细胞膜延伸的实用性和简便性，及其与细胞黏附能力的相关性。作为代表性示例，我们在此表明，Dickkopf 相关蛋白 3（DKK3）可促进肾上腺皮质癌细胞中 Lobopodia 的形成增加以及细胞黏附性的增强 体外.

细胞膜突起的表征及其在癌细胞黏附动力学中作用的研究

免疫细胞与血管壁的动态黏附是其归巢至肠道的前提条件。本文介绍了一种用于功能性研究的实验方案 体外...

用于炎症性肠病抗黏附疗法功能分析的动态黏附测定

本文介绍了一种优化的实验方案，利用荧光显微镜在异源细胞系统中快速、半定量地检测反式配体-受体相互作用。...

通过异源细胞系统中蛋白质聚集测量跨细胞相互作用

本文描述了从MCF7细胞融合单层的共聚焦图像中定量分析1）黏着斑的大小和数量，以及2）细胞形态指数及其分布。...

MCF7细胞单层中细胞-基质黏附面积与细胞形态分布的量化分析

本方案介绍了进行黏附足迹实验以成像快速细胞滚动黏附过程中黏附事件的实验步骤。...

成像细胞滚动过程中分子黏附的黏附足迹检测法

了解利用珠聚集测定法表征细胞粘附分子的快速方法。该技术通过捕获分泌型外结构域片段于功能化磁珠上，直接检测蛋白质的同型粘附活性，为研究细胞粘附提供简便可靠的生化分析手段。

用于表征候选细胞黏附分子的微珠聚集实验

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