Name: 管式膜网络在心肌细胞的心房和心室分析 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-10-15T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 30 s
Description: 学习使用荧光显微镜和定量图像分析技术，分析小鼠心房和心室心肌细胞的管状膜网络结构。该方法可揭示不同细胞类型间膜网络的差异，为心脏生理学和病理学研究提供重要见解。

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本工作获得了德国研究基金会SFB 1002（项目A05和B05授予S.E.L.）和KFO 155（子项目4授予S.E.L.）的支持，Halbach基金会向S.E.L.提供的奖项用于支持E.W.；德国心脏病学会向S.B.提供的资助；以及德国学术交流中心（DAAD）交流项目对T.K.在马里兰大学访学期间的支持。本研究工作所获得的成果得到了欧洲共同体第七框架计划FP7/2007-2013（资助协议号HEALTH-F2-2009-241526，EUTrigTreat，授予S.E.L.）的资助。S.E.L.是德国心血管研究中心（DZHK）的主要研究员。

<ol><li>Prosser, B. L., Ward, C. W., Lederer, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subcellular+Ca2%2B+signaling+in+the+heart+the+role+of+ryanodine+receptor+sensitivity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gen+Physiol%22%5BJournal%5D)">Subcellular Ca2+ signaling in the heart the role of ryanodine receptor sensitivity.</a> J Gen Physiol. 136 (2), 135-142 (2010).</li>
<li>Wehrens, X. H., Lehnart, S. E., Marks, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracellular+calcium+release+and+cardiac+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Physiol%22%5BJournal%5D)">Intracellular calcium release and cardiac disease.</a> Annu Rev Physiol. 67, 69-98 (2005).</li>
<li>Cheng, H., Cannell, M. B., Lederer, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Propagation+of+excitation-contraction+coupling+into+ventricular+myocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Pflugers+Arch%22%5BJournal%5D)">Propagation of excitation-contraction coupling into ventricular myocytes.</a> Pflugers Arch. 428 (3-4), 415-417 (1994).</li>
<li>Williams, G. S., Chikando, A. C., Tuan, H. T., Sobie, E. A., Lederer, W. J., Jafri, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+calcium+sparks+and+calcium+leak+in+the+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Dynamics of calcium sparks and calcium leak in the heart.</a> Biophys J. 101 (6), 1287-1296 (2011).</li>
<li>Sperelakis, N., Rubio, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((R.+orderly+lattice+of+axial+tubules+which+interconnect+adjacent+transverse+tubules+in+guinea-pig+ventricular+myocardium%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Cell+Cardiol%22%5BJournal%5D)">R. orderly lattice of axial tubules which interconnect adjacent transverse tubules in guinea-pig ventricular myocardium.</a> J Mol Cell Cardiol. 2 (3), 211-220 (1971).</li>
<li>Soeller, C., Cannell, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((B.+of+the+transverse+tubular+system+in+living+cardiac+rat+myocytes+by+2-photon+microscopy+and+digital+image-processing+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">B. of the transverse tubular system in living cardiac rat myocytes by 2-photon microscopy and digital image-processing techniques.</a> Circ Res. 84 (3), 266-275 (1999).</li>
<li>Song, L. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((et+al.+ryanodine+receptors+in+the+failing+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">et al. ryanodine receptors in the failing heart.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 103 (11), 4305-4310 (2006).</li>
<li>Oort, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disrupted+junctional+membrane+complexes+and+hyperactive+ryanodine+receptors+after+acute+junctophilin+knockdown+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Disrupted junctional membrane complexes and hyperactive ryanodine receptors after acute junctophilin knockdown in mice.</a> Circulation. 123 (9), 979-988 (2011).</li>
<li>Wagner, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stimulated+emission+depletion+live-cell+super-resolution+imaging+shows+proliferative+remodeling+of+T-tubule+membrane+structures+after+myocardial+infarction%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Stimulated emission depletion live-cell super-resolution imaging shows proliferative remodeling of T-tubule membrane structures after myocardial infarction.</a> Circ Res. 111 (4), 402-414 (2012).</li>
<li>Asghari, P., Schulson, M., Scriven, D. R., Martens, G., Moore, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axial+tubules+of+rat+ventricular+myocytes+form+multiple+junctions+with+the+sarcoplasmic+reticulum%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Axial tubules of rat ventricular myocytes form multiple junctions with the sarcoplasmic reticulum.</a> Biophys J. 96 (11), 4651-4660 (2009).</li>
<li>Lukyanenko, V., Ziman, A., Lukyanenko, A., Salnikov, V., Lederer, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+groups+of+ryanodine+receptors+in+rat+ventricular+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Functional groups of ryanodine receptors in rat ventricular cells.</a> J Physiol. 583 (Pt 1), 251-269 (2007).</li>
<li>Shacklock, P. S., Wier, W. G., Balke, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Local+Ca2%2B+transients+%28Ca2%2B+sparks%29+originate+at+transverse+tubules+in+rat+heart+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Local Ca2+ transients (Ca2+ sparks) originate at transverse tubules in rat heart cells.</a> J Physiol. 487 (Pt 3), 601-608 (1995).</li>
<li>Reynolds, J. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Junctophilin-2+is+necessary+for+T-tubule+maturation+during+mouse+heart+development%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovasc+Res%22%5BJournal%5D)">Junctophilin-2 is necessary for T-tubule maturation during mouse heart development.</a> Cardiovasc Res. 100 (1), 44-53 (2013).</li>
<li>Di Maio, A., Karko, K., Snopko, R. M., Mejia-Alvarez, R., Franzini-Armstrong, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T-tubule+formation+in+cardiac+myocytes+two+possible+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22J+Muscle+Res+Cell+Motil%22%5BJournal%5D)">T-tubule formation in cardiac myocytes two possible mechanisms.</a> J Muscle Res Cell Motil. 28 (4-5), 231-241 (2007).</li>
<li>He, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reduction+in+density+of+transverse+tubules+and+L-type+Ca%282%2B%29+channels+in+canine+tachycardia-induced+heart+failure%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovasc+Res%22%5BJournal%5D)">Reduction in density of transverse tubules and L-type Ca(2+) channels in canine tachycardia-induced heart failure.</a> Cardiovasc Res. 49 (2), 298-307 (2001).</li>
<li>Heinzel, F. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Remodeling+of+T-tubules+and+reduced+synchrony+of+Ca2%2B+release+in+myocytes+from+chronically+ischemic+myocardium%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Remodeling of T-tubules and reduced synchrony of Ca2+ release in myocytes from chronically ischemic myocardium.</a> Circ Res. 102 (3), 338-346 (2008).</li>
<li>Lyon, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+T-tubules+and+other+changes+to+surface+topography+in+ventricular+myocytes+from+failing+human+and+rat+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Loss of T-tubules and other changes to surface topography in ventricular myocytes from failing human and rat heart.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 106 (16), 6854-6859 (2009).</li>
<li>Crossman, D. J., Ruygrok, P. N., Soeller, C., Cannell, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changes+in+the+organization+of+excitation-contraction+coupling+structures+in+failing+human+heart%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Changes in the organization of excitation-contraction coupling structures in failing human heart.</a> PLoS One. 6 (3), e17901(2011).</li>
<li>Kemi, O. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+exercise+training+on+transverse+tubules+in+normal%2C+remodeled%2C+and+reverse+remodeled+hearts%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">The effect of exercise training on transverse tubules in normal, remodeled, and reverse remodeled hearts.</a> J Cell Physiol. 226 (9), 2235-2243 (2011).</li>
<li>Sachse, F. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subcellular+structures+and+function+of+myocytes+impaired+during+heart+failure+are+restored+by+cardiac+resynchronization+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Subcellular structures and function of myocytes impaired during heart failure are restored by cardiac resynchronization therapy.</a> Circ Res. 110 (4), 588-597 (2012).</li>
<li>Arakel, E. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tuning+the+electrical+properties+of+the+heart+by+differential+trafficking+of+KATP+ion+channel+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sciences%22%5BJournal%5D)">Tuning the electrical properties of the heart by differential trafficking of KATP ion channel complexes.</a> J Cell Sciences. 127 (Pt 9), 2106-2119 (2014).</li>
<li>Richards, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transverse+tubules+are+a+common+feature+in+large+mammalian+atrial+myocytes+including+human%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Heart+Circ+Physiol%22%5BJournal%5D)">Transverse tubules are a common feature in large mammalian atrial myocytes including human.</a> Am J Physiol Heart Circ Physiol. 301 (5), H1996-H2005 (2011).</li>
<li>Trafford, A. W., Clarke, J. D., Richards, M. A., Eisner, D. A., Dibb, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+signalling+microdomains+and+the+t-tubular+system+in+atrial+mycoytes+potential+roles+in+cardiac+disease+and+arrhythmias%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovasc+Res%22%5BJournal%5D)">Calcium signalling microdomains and the t-tubular system in atrial mycoytes potential roles in cardiac disease and arrhythmias.</a> Cardiovasc Res. 98 (2), 192-203 (2013).</li>
<li>Greiser, M., Schotten, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+remodeling+of+intracellular+Ca2%2B+signaling+during+atrial+fibrillation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Cell+Cardiol%22%5BJournal%5D)">Dynamic remodeling of intracellular Ca2+ signaling during atrial fibrillation.</a> J Mol Cell Cardiol. 58, 134-142 (2013).</li>
<li>Voigt, N., Zhou, X. B., Dobrev, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+human+atrial+myocytes+for+simultaneous+measurements+of+Ca2%2B+transients+and+membrane+currents%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Isolation of human atrial myocytes for simultaneous measurements of Ca2+ transients and membrane currents.</a> J Vis Exp. (77), 10-3791 (2013).</li>
<li>Kaestner, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+genetic+manipulation+of+adult+cardiac+myocytes+for+confocal+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Isolation and genetic manipulation of adult cardiac myocytes for confocal imaging.</a> J Vis Exp. (31), (2009).</li>
<li>Louch, W. E., Sheehan, K. A., Wolska, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+in+cardiomyocyte+isolation%2C+culture%2C+and+gene+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Cell+Cardiol%22%5BJournal%5D)">Methods in cardiomyocyte isolation, culture, and gene transfer.</a> J Mol Cell Cardiol. 51 (3), 288-298 (2011).</li>
<li>King, N. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+intact+cardiac+myocyte+mechanics+cross-bridge+and+titin-based+stress+in+unactivated+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gen+Physiol%22%5BJournal%5D)">Mouse intact cardiac myocyte mechanics cross-bridge and titin-based stress in unactivated cells.</a> J Gen Physiol. 137 (1), 81-91 (2011).</li>
<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%2C+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji, an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li>
<li>Arganda-Carreras, I., Fernandez-Gonzalez, R., Munoz-Barrutia, A., Ortiz-De-Solorzano, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+reconstruction+of+histological+sections+Application+to+mammary+gland+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Microsc+Res+Tech%22%5BJournal%5D)">3D reconstruction of histological sections Application to mammary gland tissue.</a> Microsc Res Tech. 73 (11), 1019-1029 (2010).</li>
<li>Liu, Z. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scale+space+approach+to+directional+analysis+of+images%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Opt%22%5BJournal%5D)">Scale space approach to directional analysis of images.</a> Appl Opt. 30 (11), 1369-1373 (1991).</li>
<li>Powell, T., Twist, V. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+technique+for+the+isolation+and+purification+of+adult+cardiac+muscle+cells+having+respiratory+control+and+a+tolerance+to+calcium%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">A rapid technique for the isolation and purification of adult cardiac muscle cells having respiratory control and a tolerance to calcium.</a> Biochem Biophys Res Commun. 72 (1), 327-333 (1976).</li>
<li>Watanabe, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibitory+effect+of+2%2C3-butanedione+monoxime+%28BDM%29+on+Na%28%2B%29%2FCa%282%2B%29+exchange+current+in+guinea-pig+cardiac+ventricular+myocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Inhibitory effect of 2,3-butanedione monoxime (BDM) on Na(+)/Ca(2+) exchange current in guinea-pig cardiac ventricular myocytes.</a> Br J Pharmacol. 132 (6), 1317-1325 (2001).</li>
<li>Kohl, T., Westphal, V., Hell, S. W., Lehnart, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Superresolution+microscopy+in+heart+-+cardiac+nanoscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Cell+Cardiol%22%5BJournal%5D)">Superresolution microscopy in heart - cardiac nanoscopy.</a> J Mol Cell Cardiol. 58, 13-21 (2013).</li>
</ol>

作者声明不存在利益冲突。

尽管数十年来心肌细胞已被分离并开展研究32，但最近的一项综述指出，获得一致的高质量心肌细胞分离仍具挑战性27。这反映出原代心肌细胞分离的方案相对复杂，且缺乏通用的标准方法、共享的元数据以及透明的细胞质量记录。细胞分离方案通常由各个研究团队自行定制，所得细胞分离物的结果存在差异，依赖于特定的模型设置（例如，物种、年龄、共存的心脏状况），并通常根据特定实验条件进行调整。在本文所介绍的关于TATS膜的定量研究及方案背景下，质量评估和记录的一个关键方面是对单个细胞膜结构进行共聚焦或超分辨率显微镜观察，这些结构在心房肌（AM）或心室肌（VM）中均易受代谢状态及分离方案相关因素的影响而发生改变。重要的是，即使细胞分离产量较高提示获得了健康完整的肌细胞，研究者仍需针对每个单个细胞，依据形态学标准，仔细记录并严格评估其表面膜和TATS膜的完整性，以区分由分离操作引起的非特异性损伤与相对于对照条件因不同干预措施导致的特异性变化。在心肌细胞分离过程中，一个重要的变量是特定批次胶原酶的酶活性。在选择新批次胶原酶时，应根据生产商的说明，通过评估不同胶原酶样品的心肌细胞得率和质量，相互比较其酶活性。理想情况下，应选用酶活性与先前成功使用过的批次相近的新批次胶原酶（有关可能的酶活性的进一步评估，请参见材料与方法表中的“胶原酶批次选择工具”）。&#160;综上所述，TATS膜的可视化定量分析在很大程度上依赖于细胞分离的质量；反之，若TATS显微镜观察显示细胞分离导致了非特异性膜损伤，则应促使研究者对分离方案进行严格审查和修正。由于细胞分离质量与TATS膜的可视化及定量分析本质上密切相关，本文讨论的方案涵盖了作为连续策略的各个主要方面。
心脏研究中的另一个挑战和常见问题是，由于代谢干扰性干预，会发生细胞损伤和/或细胞丢失 例如，心肌梗死后9，但仍需评估其可能造成的无意损害 例如在细胞分离过程中因未察觉的空气栓塞可能导致额外的细胞损失。从病变心脏中分离心肌细胞可能会导致进一步的显著细胞丢失和细胞得率降低。因此，若采用标准化的细胞分离与计数方案并保持操作一致，则在对照组与病变心脏之间比较所分离的完整细胞总数具有实际意义。因此，通过适当的对照组来评估细胞完整性至关重要，该对照组应反映心肌细胞分离所能达到的最佳质量。值得注意的是，单个细胞的质量以及健康心肌细胞、病变心肌细胞与因分离过程意外受损的心肌细胞在活细胞显微成像中的差异，可能显著影响对TATS膜网络的分析结果。因此，本文所介绍的实验方案强调在细胞分离及完整膜结构的活细胞显微观察过程中，维持生理膜组分的完整性与稳定性。整个工作流程被设计为连续策略，旨在获取并保持完整的TATS膜结构，同时排除受损细胞，因为这些细胞会表现出依赖于分离过程的膜假象，如膜小管断裂、膜出泡以及TATS网络异常，从而在对照条件下错误地干扰后续的定量分析。反之，对于可能破坏TATS膜结构的干预性研究，同样必须采用这些策略，以确保在真正健康与真正病变且存在TATS膜改变的心肌细胞之间进行有意义的对照比较。
此外，我们介绍了实现心房肌细胞（AM细胞）分离的技术方案，该过程在技术上更具挑战性。尽管已有进展并改进了相关实验方案，但需要强调的是，要重复获得高质量的心室肌细胞（VM细胞）分离结果并非易事，而心房肌细胞（AM细胞）的分离则更不可靠。这主要是由于AM细胞总体得率较低，因此在细胞分离过程中即使出现微小的误差或波动，也可能导致AM细胞分离完全失败；相比之下，由于VM细胞数量相对较多，即使存在轻度损伤，在细胞悬液中也不易察觉。由于AM细胞在分离后可能呈现弯曲形态，因此如步骤4.3所述，通过多个感兴趣区域（ROI）进行分析可能更具优势。在详细描述细胞分离步骤之后，我们提供了一种针对VM细胞和AM细胞的TATS网络进行直接全膜染色以及共聚焦或STED超分辨率成像的实验方案。这些方案可通过已建立的参数，实现对TATS膜特定组分的定量分析和区分。与心室肌细胞相比，目前对心房肌细胞中TATS网络的三维结构及其功能行为的理解仍较为有限。
在活细胞中成像TATS膜的实验步骤（步骤3.1至3.7）是使用商用共聚焦显微镜（材料/设备表）和定制的STED荧光显微镜9开发的。为了优化显微镜设置以生成荧光图像并进行定量TATS分析，以下几点具有普遍重要性：
<ul>
	<li>目标 
	为了分辨TATS膜结构的细微特征，需通过实验验证哪种物镜可在细胞内部数微米深度处提供最佳图像质量。某些共聚焦显微镜使用水镜或甘油镜时性能可能更优，而不同于本实验所用的63X 1.4 NA油镜。100X放大倍数的物镜常用于超分辨率STED显微技术，以视野范围缩小为代价实现纳米级分辨率34.</li>
	<li>激发与增益 
	激发光功率和探测器增益的最佳设置取决于显微镜光路、激光器性能以及样品特性。理想情况下，应调节激光功率和增益，以充分利用探测器的动态范围，同时避免图像饱和。商用显微成像软件通常提供查找表，用于显示动态范围的上下限。此外，为尽量减少染料漂白，应使用尽可能低的激光功率，同时仍能获得足够的TATS膜结构细节。激发功率还应足够低，以避免累积性光损伤导致心肌细胞收缩和死亡。</li>
	<li>像素大小 
	使用与奈奎斯特采样定理兼容的像素尺寸，约为当前设置下所达到分辨率的一半。对于共聚焦成像，100 nm × 100 nm 的像素尺寸是合适的，同时也有助于减少光漂白。对于超分辨率显微镜，则需使用显著更小的像素尺寸。 例如，用于STED显微镜的20 nm × 20 nm9.</li>
	<li>停留时间 
	共聚焦显微镜提供信号平均功能。通常，应使用尽可能短的像素驻留时间，结合信号平均，以避免光漂白 例如，线平均值 ≥ 8 以提高信噪比。</li>
	<li>通过元数据记录应用显微镜设置 
	一旦在特定共聚焦显微镜上优化了用于成像TATS膜结构细节的设置，应安全保存和/或记录这些设置（实验方案元数据）。在同一个（或多个）细胞组内采集所有图像时，须使用相同的目标物镜、激发光功率、增益、像素尺寸、像素驻留时间及平均扫描次数。采用一致的成像条件，可实现细胞组内（或组间）图像的直接比较与定量分析。</li>
	<li>有关共聚焦显微镜原理与应用的一般性指导及更多详细信息，请参阅《生物共聚焦显微镜手册》（Pawley J.B.，第3版）。rd 版次，2006，施普林格科学+商业媒体有限责任公司</li>
</ul>
与本文介绍的直接分析策略不同，以往描述TATS膜及其疾病相关变化的研究通常采用区域性汇总读数来定量T小管密度16,17，或基于条纹状膜信号的傅里叶变换分析进行间接区域评估，以衡量T小管组分的规则性7。相比之下，本文所述的定量方法直接关联单个TATS组分，并提供多个额外参数，包括膜网络特性以及特定组分（如A型小管所占百分比&#160;）。此外，TATS网络密度可被量化为每单位ROI面积内提取出的完整骨架的归一化长度。三个独立且连续连接的小管组分形成的三叉连接点数量可用于评估TATS膜网络的分支复杂性。需要注意的是，对最小TATS组分的任何分析均依赖于染色方法。根据我们的经验，使用800 µl浓度为50 µM的di-8-ANEPPS溶液足以对含有50,000个心室肌细胞（VM细胞）的细胞沉淀中的完整TATS网络进行染色9。然而，若细胞沉淀中包含的心肌细胞数量较少，或具备高灵敏度荧光检测器，且研究关注的是整体TATS网络分布而非最小膜结构细节或定量变化时，可根据经验测试使用较低的染料浓度。最后，为上述分析编写的软件宏可用于自动化图像处理步骤，从而便于大规模数据集的分析，这对于不同处理组（e.g.，药物）、细胞类型（e.g.，心房肌细胞AM与心室肌细胞VM）以及病理生理干预（e.g.，假手术组与心肌梗死组）之间的比较尤为有用。
对于TATS网络的图像分析，采用以下一系列基本步骤：1）滚球法背景扣除（4.5.1），以消除背景强度的空间变化；2）局部对比度增强（4.5.2）；3）图像平滑（4.5.3）；4）统计区域合并（4.5.4）；5）确定图像二值化的阈值（4.5.6）；以及6）骨架数据的计算（4.5.8）。在荧光TATS图像的骨架化过程中，一个关键步骤是如图6所示的图像二值化。相关的阈值设定步骤最终决定了哪些真实的膜结构被识别为TATS的基本组分，而哪些可能是由背景噪声引起的假阳性结构。正确的二值化图像分析阈值应与真实的TATS膜结构相对应，这取决于共聚焦显微镜和超分辨率显微镜成像方法各自具备足够高的信噪比（SNR）。因此，应首先确保足够的图像质量，并结合明场图像等所列方式对单个细胞质量进行严格评估。针对特定显微镜数据输出或生理学问题，可选用其他图像分割方案的替代方法，包括图像去卷积，以及作为ImageJ插件提供的“Otsu”或“Iso-data”等其他阈值分割方法。无论采用何种最终的分割流程，我们都认为将提取结果与原始数据通过图像叠加进行比较，是必不可少的质量控制步骤。总之，单个分离心肌细胞的形态学特征与膜完整性、细胞内TATS膜的充分染色、荧光成像参数的优化，以及提取骨架数据的叠加对照，均对荧光TATS图像的质量和定量分析结果具有重要影响。
如果使用比小鼠更大的物种进行细胞分离，可相应地对方案进行适当调整。对于体型稍大的下一个物种，大鼠心脏可用钝头14&#160;G型套管（外径2.1 mm）并以8 ml/min的速度灌注。明显更年老或病变的心脏可能需要更大的套管尺寸。通常，心脏灌注可通过恒定压力进行 例如，可通过储液器与主动脉之间1米高的水柱产生的恒定压力，或使用蠕动泵实现恒定流速灌注。对于从小型啮齿类动物（如小鼠和大鼠）心脏中分离细胞，恒定流速可能更具优势，因为胶原酶消化最终会破坏冠状动脉阻力血管，导致血管床渗漏而引起过高的灌注速率，而恒定流速方案可在一定程度上控制该现象。相比之下，当需要优先监测灌注流速并确保导管插入正确时，恒定压力灌注更为有利，这在研究血管阻力发生改变的干预模型以及在细胞分离操作技术培训中具有优势。
如上所述，细胞质量对于内源性膜系统的定量研究至关重要。然而，在心脏灌注和胶原酶消化过程中，众多因素可能严重影响细胞分离的质量，这些因素在方案优化或故障排查过程中绝不可忽视。27特别是，应针对特定目标组织确定给定批次胶原酶的活性 例如，在执行正式的实验研究之前，需对心房或心室进行处理，以建立并维持整个研究过程中所需的分离条件。此外，灌流系统的水质、pH值、温度、优化设置及清洁程度将有助于最大限度地降低污染物和栓塞造成意外损伤的风险；在细胞分离过程中，可能还需监测其他因素，以建立最佳的稳态环境。BDM（2,3-丁二酮单肟）是一种可逆性肌球蛋白ATP酶横桥抑制剂，常在组织解剖和消化过程中使用，以维持心肌的松弛状态，从而提高细胞分离的得率。然而，研究者需注意，BDM可能具有非特异性的磷酸酶活性，从而导致脱靶效应。 例如，Na⁺的抑制+/Ca2+ 在特定条件下的交换电流33对于某些实验，使用blebbistatin替代BDM作为心脏停搏液可能更具优势。blebbistatin在微摩尔浓度下对肌球蛋白具有高亲和力，但其具有毒性、相对昂贵，且可能存在其他脱靶效应。在无电刺激的情况下，静息状态的健康心肌细胞不应出现任何收缩，此类细胞应排除在后续分析之外。另一方面，在生理细胞外Ca²⁺浓度条件下，心肌细胞应能对电刺激产生收缩与舒张反应。2+ 可利用浓度来建立正常的收缩行为，作为评估细胞功能质量以及比较心脏病细胞与健康对照细胞是否存在异常行为的额外指标。
综上所述，本文所述的单细胞分离和定量图像分析方案已成功应用于心室肌细胞（VM9）和心房肌细胞（AM）中TATS膜网络的共聚焦显微镜和超分辨率显微镜研究21，以及固定心脏肌细胞中微管网络的定量分析（数据未显示）。这些方案及其未来的应用可能为多种实验问题提供研究途径，例如在不同发育阶段对TATS膜进行表征，或分析与TATS网络接触并发挥高度局部化、区域特异性信号功能的膜相关蛋白或细胞器结构。

在健康的横纹肌细胞中，存在大量与细胞主轴垂直的、具有“横向”走向的管状膜结构（T小管）。因此，T小管被认为是肌细胞主要“侧向”表面膜（肌膜）的连续延伸，深入细胞质并朝向细胞中心。T小管与细胞外表面膜连续的生理作用在于，通过电压门控L型Ca2+通道（Cav1.2）内向电流&#160;(ICa) 与邻近兰尼碱受体（RyR2）介导的肌浆网（SER）Ca2+释放之间在纳米级距离上的紧密耦合，实现由SER细胞器接触区域在整个相对较大的心肌细胞体积内形成的远端细胞内区室之间的快速电耦合。在心室肌细胞（VMs）中，连接型SER区域与T小管之间的非连续性膜接触（“连接结构”）被认为可调控每个细胞中成千上万个独立的细胞内Ca2+释放纳米结构域1。
对于任意给定的接触结构域，横管（T-tubule）与周围（连接性）肌浆网（SER）的相邻膜区域彼此相距约15 nm，因此被称为纳米结构域。这种结构分隔出非常微小的独立胞质亚空间，使其能够实现准细胞自主性的区室行为。当传入的动作电位激活心肌细胞（VMs）横管中的Cav1.2通道时，相对较小的Ca2+内向电流会迅速提高阿托升（attoliter）体积级纳米结构域中的亚空间Ca2+浓度[Ca2+]S1。随后，[Ca2+]S的升高会激活邻近SER膜连接区中纳米距离范围内的Ca2+门控兰尼碱受体（RyR2），该耦联过程在整个电耦联的心肌细胞纳米结构域中广泛发生。RyR2以密集的多通道簇形式存在，其化学计量比约为每1个Cav1.2通道对应5–10个RyR2通道2。由于肌浆网与胞质之间的[Ca2+]梯度极为陡峭（比例达104:1），且RyR2在功能耦联的簇中作为高导通性的Ca2+释放通道发挥作用，因此RyR2的激活可导致大量Ca2+从与横管相连的连接性肌浆网结构域中释放，在1–2毫秒内使局部亚空间[Ca2+]S升高至100 µM或更高3,4。这种心脏信号放大现象也被称为Ca2+诱导的Ca2+释放（CICR）。综上所述，横管是至关重要的膜结构，在兴奋-收缩（EC）耦联过程中，通过与连接性纳米结构域肌浆网的接触，快速触发Ca2+释放信号及全细胞范围的CICR。
除了横管（T-tubules）外，电子显微镜（EM）、共聚焦显微镜和双光子显微镜研究还记录到一种轴向小管（A-tubules），其走向明显不同，与细胞主轴（纵向）平行。例如，通过细胞外示踪剂和固定豚鼠心室肌细胞（VMs）的EM成像，发现肌原纤维之间存在一个贯穿全细胞的连续A-tubules晶格结构，并在肌节Z线附近与T-tubules相互连接5。利用细胞外葡聚糖连接荧光素染色及大鼠心室肌细胞的活体双光子成像，观察到一个复杂的网状三维小管网络，其中约60%为T-tubules，约40%为A-tubules6。该研究不仅实现了对大量A-tubules的三维可视化，还揭示了在分析诸如横轴向小管系统（TATS）这类复杂且动态的膜网络时，用于EM观察的切片方法本身存在局限性。因此，发展了使用di-8-ANNEPS直接染色TATS膜并进行活细胞共聚焦成像的技术。若对活细胞TATS网络进行傅里叶变换分析，则可通过条纹信号区域的集合功率谱反映出T-tubules组分在空间上、靠近肌节Z线处的规律排列特征7。这种间接分析策略已被用于检测疾病模型中心肌细胞全范围内TATS组分规律性的区域性变化7。例如，通过shRNA介导的junctophilin-2敲低导致心力衰竭，且该亚型特异性蛋白缺乏引起T-tubules重组，并伴随纳米结构域Ca2+释放功能障碍8。我们最近进一步拓展了对TATS膜网络的分析，采用直接定量方法，并结合使用受激发射损耗（STED）纳米显微镜对小鼠心室肌细胞中单个TATS组分进行活细胞超分辨率成像9。纳米级图像分辨率使得能够直接分析更小的单个TATS组分，其横向与轴向小管取向的比例约为50:50，从而在定量上证实健康小鼠心脏中存在两种丰富但取向不同的单个TATS组分9。这些策略将在下文的实验方案部分进一步阐述。
尽管成年心脏中丰富的A小管组分的生理作用仍不明确，但电镜研究已记录到与A小管相关的肌浆网膜结构，提示其可能存在内源性Ca2+ 豚鼠和大鼠VMs中的释放纳米结构域5,10Cav1.2与RyR2在A小管连接处的共定位具有高度重叠，经共聚焦分析发现10由于约20%的自发性Ca2+ 大鼠心室肌细胞中的钙火花起源于距离Z线纹较远的位置，而T小管通常位于Z线附近，因此有观点认为，A小管相关的纳米结构域可能确实存在，并可作为钙信号功能单位2+ 释放位点11,12有趣的是，T小管的形成与成熟仅在出生后发生，并且与心肌细胞的生长同步进行。 例如通过小鼠出生后第5天（P5）前体肌膜内陷的出芽，以及出生后第10天（P10）不成熟的分支TATS网络组装13Junctophilin-2 似乎对出生后TATS网络的成熟尤为重要，因为shRNA敲低会阻止T小管膜与肌浆网连接处的锚定，从而导致钙信号延迟2+ 释放及病理性TATS结构，符合以未成熟A型小管为主的心室肌细胞架构13这些观察结果最终可能证明，T小管通过膜内陷过程形成，而A小管则可能通过其他甚至不同的细胞内机制成形。14.
在心脏病理生理学研究中，对TATS膜结构改变的表征已成为一个重要研究领域。最初在 pacing 诱导的心力衰竭犬模型中的报告表明，T小管和Cav1.2电流（ICa）出现丢失15。在缺血性心肌病猪模型中，观察到T小管密度降低以及细胞内Ca2+释放同步性下降16。利用自发性高血压大鼠（SHR）心力衰竭模型，发现T小管丢失与Cav1.2和RyR2之间的纳米结构域耦合减弱相关，其提出机制为“RyR2失偶联”7。在来自缺血性、扩张型和肥厚型心肌病患者的心室肌细胞（VMs）中也观察到了T小管的丢失17。此外，在人类扩张型心肌病组织切片中报道了A小管的增加18。在心肌梗死后，我们在小鼠心室肌细胞中发现TATS重构存在差异性机制，表现为T小管显著减少，而A小管组分则增加9。重要的是，通过活细胞超分辨率STED显微镜实现的局部膜对比度提升，使得可通过直接测量进行详细的定量组分分析，结果显示A小管显著增殖，TATS网络总长度及分支复杂性均增加9。此外，已有研究表明，运动训练可逆转心肌梗死后大鼠的T小管重构19，而心脏再同步化治疗可能逆转房性快速起搏诱导心力衰竭犬的T小管重构20。综上所述，无论是在患病的人类及动物心室肌细胞中的研究，还是潜在治疗干预的探索，均将得益于高质量的细胞分离流程以及如下文方案与结果部分所述的详细定量分析策略。
此外，最近关于KATP通道亚型在侧膜与TATS膜之间转运的研究表明21，应将心房肌细胞（AMs）视为在生物学上具有显著差异的细胞类型，并将其作为与心室肌细胞（VMs）相比较的心脏细胞模型。近期已有研究记录到绵羊和人类AMs中存在T小管结构22。目前的证据表明，AM细胞中T小管数量较少，通常仅存在于绵羊和人类等较大哺乳动物中，而不存在于小鼠等小型啮齿类动物中23。与VMs不同，AMs中的细胞内Ca2+释放主要起始于细胞表面，并通过扩散向细胞中心传播，从而形成显著的空间和时间上的Ca2+梯度23。在此背景下，阐明诸如心房颤动等常见疾病状态下细胞内Ca2+信号不稳定机制显得尤为重要24。总之，健康与病变心脏的AM和VM细胞分离均为常用的实验方法。只有当细胞分离质量经显微镜评估达到足够标准时，AM和VM样本才可用于定量TATS分析。因此，以下各实验步骤均依赖于从小鼠或其他物种获得的高质量细胞样本，并通过活细胞显微镜观察来分析完整的TATS膜结构。如前所述，TATS膜的表征是一个具有挑战性的研究领域，容易受到固定和制备过程中的人工假象6、渗透压改变引起的膜结构变化，以及传统光学显微镜分辨率限制的影响9。我们注意到，本期刊此前已发表过关于人AMs用于Ca2+成像和膜片钳实验以及大鼠VMs用于细胞培养的最新标准分离方案25,26。

<table><tbody><tr><td colspan="4">&lt;强&gt;化学品与酶&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>2,3-丁二酮单肟</td><td>Sigma-Aldrich，德国慕尼黑</td><td>B0753</td><td></td></tr><tr><td>牛犊血清</td><td>赛默飞世尔科技，施韦尔特，德国</td><td>SH30073</td><td>三重 0.1 &amp;micro;m 无菌过滤。</td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich，德国慕尼黑</td><td>21115</td><td>用超纯水按1:10稀释，得到100 mM CaCl₂&lt;sub&gt;2 &lt;/sub&gt;储存浓度</td></tr><tr><td>II型胶原酶</td><td>Worthington via Cell Systems，特罗伊瑟多夫，德国</td><td>应要求</td><td>酶活性取决于不同批次的胶原酶。可对胶原酶II及其他酶活性（酪蛋白酶、梭菌蛋白酶、胰蛋白酶样活性）进行测定 &quot;胶原酶批次选择工具&quot;. 针对每一批新到的胶原酶，分别测定细胞产量和质量。</td></tr><tr><td>葡萄糖</td><td>Carl Roth，德国卡尔斯鲁厄</td><td>HN06.1</td><td></td></tr><tr><td>肝素</td><td>Rotexmedica，德国特里陶</td><td>PZN-03862340</td><td>用0.9% NaCl稀释后，皮下注射于腹部皮肤。</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Carl Roth，德国卡尔斯鲁厄</td><td>9105.4</td><td></td></tr><tr><td>Forene 100% (V/V)</td><td>Abbott，利伯蒂维尔，伊利诺伊州，美国</td><td>B506</td><td>活性物质：异氟烷，250 ml。在空气/氧气输送装置中使用，浓度约为 2 Vol%。</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Carl Roth，德国卡尔斯鲁厄</td><td>6781.3</td><td></td></tr><tr><td>KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Carl Roth，德国卡尔斯鲁厄</td><td>3904.2</td><td></td></tr><tr><td>层粘连蛋白（2 mg/ml）</td><td>BD 生物科学，德国海德堡</td><td>354232</td><td>层压步骤在2.1步中描述。</td></tr><tr><td>MgCl₂&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;&amp;middot;6H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Carl Roth，德国卡尔斯鲁厄</td><td>2189.2</td><td></td></tr><tr><td>MgSO₄&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;&amp;middot;7H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Carl Roth，德国卡尔斯鲁厄</td><td>8283.2</td><td></td></tr><tr><td>Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;&amp;middot;2H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Carl Roth，德国卡尔斯鲁厄</td><td>4984.2</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO₃&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;</td><td>Carl Roth，德国卡尔斯鲁厄</td><td>HN01.1</td><td></td></tr><tr><td>牛磺酸</td><td>Carl Roth，德国卡尔斯鲁厄</td><td>4721.2</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;强&gt;染料&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Di-8-ANEPPS</td><td>Molecular Probes，Life Technologies，德国达姆施塔特</td><td>D-3167</td><td>2 mM DMSO 储存液</td></tr><tr><td>台盼蓝</td><td>Sigma-Aldrich，德国慕尼黑</td><td>T8154</td><td>台盼蓝通过剪去尖端的1 ml塑料移液器与细胞悬液以1:1比例轻轻混匀，随后在Neubauer血细胞计数板中进行细胞计数。</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;强&gt;朗根多夫灌流装置&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>循环恒温器</td><td>劳达，劳达-K&amp;ouml;尼格斯霍芬，德国</td><td></td><td>请参阅 Louch &lt;em&gt;等&lt;/em&gt; (JMCC 2011)。将灌流管路中的恒温器和缓冲液加热至37 &amp;deg;使用前将 C 预冷 15 分钟。</td></tr><tr><td>用于蠕动泵的柔性硅胶管路 Tygon</td><td>VWR，德国达姆施塔特</td><td>224-2252</td><td>导管需要定期更换。</td></tr><tr><td>用于恒温器的柔性硅胶管路 Tygon</td><td>VWR，德国达姆施塔特</td><td>228-4340</td><td></td></tr><tr><td>环绕灌流管路的加热线圈</td><td>Rettberg, G&amp;ouml;德国蒂宾根</td><td>定制</td><td>加热丝和管路在使用后需用MQ水彻底清洗，切勿使用洗涤剂。玻璃组件应定期浸泡清洗&amp;nbsp; 在10 mM NaOH中过夜。</td></tr><tr><td>蠕动泵</td><td>Ismatec，德国韦尔泰姆</td><td>ISM830</td><td></td></tr><tr><td>三通旋塞阀 Discofix C 鲁尔锁 10 cm</td><td>Braun，德国美尔松根，瑞士</td><td>16500C</td><td></td></tr><tr><td>三通旋塞阀 Discofix 3SC</td><td>Braun，美尔松根，瑞士</td><td>4095146</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;强&gt;仪器&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>42 mm 玻璃盖玻片</td><td>Menzel Gl&amp;auml;赛默飞世尔科技，德国施韦尔特</td><td>应要求</td><td>0.13–0.16 mm 厚度</td></tr><tr><td>21 G 套管针</td><td>Becton, Dickinson and Company，美国新泽西州富兰克林湖</td><td>304432</td><td>切成约5 mm长，用砂纸打磨粗糙。</td></tr><tr><td>Neubauer血球计数板盖玻片 24 x 24 mm</td><td>门策尔 Gl&amp;auml;赛默飞世尔科技，德国施韦尔特</td><td>应要求</td><td>0.38–0.42 mm 厚度</td></tr><tr><td>格劳费镊子，0.5 mm 尖端，轻微弯曲</td><td>Fine Science Tools，德国海德堡</td><td>11151-10</td><td></td></tr><tr><td>LSM 710 NLO</td><td>卡尔·蔡司，耶拿，德国</td><td></td><td>63倍，数值孔径1.4，油镜物镜</td></tr><tr><td>改进型纽鲍尔计数板</td><td>Labor Optik，德国弗里德里希斯多夫</td><td>1100000</td><td>计数步骤：用70%乙醇擦拭计数室及其配套的盖玻片。轻轻将盖玻片压在计数室上，使两片玻璃表面接触并可观察到牛顿环。随后，加入10–20 &amp;micro;可将细胞悬液滴加至盖玻片边缘，通过毛细作用吸入空隙中。利用血细胞计数板网格中的方格（每个方格对应100 nl）计数完整与有缺陷的心肌细胞。在血细胞计数板上的第二个网格重复计数过程。结合任何稀释倍数及计数区域的换算，计算原始细胞悬液中的细胞密度。</td></tr><tr><td>POC-R2 成像室</td><td>Pecon，德国埃尔巴赫</td><td></td><td>细胞悬液体积：800 &amp;micro;l；理想的铺板密度：约1,000个AM和约10,000个VM</td></tr><tr><td>弹簧剪，8 mm刀片，直型，钝头</td><td>Fine Science Tools，德国海德堡</td><td>15025-10</td><td></td></tr><tr><td>学生型 Dumont #7 镊子，不锈钢</td><td>Fine Science Tools，德国海德堡</td><td>91197-00</td><td></td></tr><tr><td>学生用虹膜剪，弯型，11.5 cm</td><td>Fine Science Tools，德国海德堡</td><td>91461-11</td><td></td></tr><tr><td>学生用虹膜剪，直型，11.5 cm</td><td>Fine Science Tools，德国海德堡</td><td>91460-11</td><td></td></tr><tr><td>学生用外科剪，直型，锋利，12 cm</td><td>Fine Science Tools，德国海德堡</td><td>91402-12</td><td></td></tr><tr><td>组织镊，1×2齿，细长型，10 cm</td><td>Fine Science Tools，德国海德堡</td><td>11023-10</td><td></td></tr></tbody></table>

心房与心室心肌细胞中管状膜网络的分析

Analysis of Tubular Membrane Networks in Cardiac Myocytes from Atria and Ventricles

在心肌细胞中，复杂的膜小管网络——即横轴小管系统（TATS）——调控着深层细胞内的信号传导功能。尽管细胞外表面膜及其相关的TATS膜组分在形态上看似连续，但它们在脂质和蛋白质组成上存在显著差异。在心室肌细胞（VMs）中，某些TATS组分含量丰富，有助于形成规则的直线状小管网络及有序分支的三维结构。目前认为，外周TATS组分可将动作电位从细胞表面传导至数千个远端的肌浆内质网（SER）膜接触区域，从而激活细胞内Ca2+释放单位（CRUs）。与心室肌细胞不同，心房肌细胞（AMs）中TATS膜的组织结构和功能作用存在显著差异，且目前了解甚少。综上所述，对健康与病变心肌细胞中TATS膜网络进行定量结构表征，是深入理解其功能可塑性及病理生理重构的必要前提。本文介绍了一套策略性组合方案，可用于对活体心室肌细胞和心房肌细胞中的TATS膜网络进行直接定量分析。为此，我们在分离小鼠心室肌细胞和/或心房肌细胞的原代细胞后，结合关键的质量控制步骤，并采用直接膜染色方法，对TATS膜进行荧光成像。通过优化共聚焦或超分辨率TATS图像处理流程，生成二值化和骨架化数据，用于对TATS网络及其组分的定量分析。与以往发表的间接区域聚合图像分析策略不同，本方案能够直接表征特定组分，并利用高通量及开源软件工具，解析活体心肌细胞中TATS膜网络的复杂生理特性。总之，该组合方案可广泛应用于生理条件下心肌细胞适应过程或疾病状态变化中的TATS网络定量研究、不同类型心肌或骨骼肌细胞的比较、转基因模型的表型分析，以及药理学或治疗干预研究。

在心肌细胞中，管状膜结构形成细胞内网络。本文描述了以下优化方案：i）从小鼠心脏分离心肌细胞（包括质量控制），ii）用于先进荧光显微镜成像的活细胞染色，以及 iii）直接图像分析，以量化细胞内膜网络的组分复杂性与可塑性。

在心肌细胞中，一个复杂的膜小管网络——横轴小管系统（TATS）——调控着深层细胞内的信号传导功能。

本实验的总体目标是分析心房和心室肌细胞中的管状膜网络。首先从成年小鼠心脏中分离出心房和心室肌细胞，以实现这一目标。第二步，在完整存活的分离心脏肌细胞中对横轴索小管系统（TATS）进行染色。接下来，通过共聚焦或稳态荧光显微镜对触膜网络进行可视化，然后对网络的各个组分进行定量分析。最终，通过定量的触膜图像分析，可以揭示不同细胞类型之间或假手术组与处理组之间的膜网络差异。该细胞分离与分析技术的主要优势在于，其完整的分离流程可实现心肌细胞的直接荧光成像，从而允许对触膜网络进行定量数据分析。该方法可用于研究活体健康心肌细胞中复杂膜网络的结构，也可应用于疾病模型或转基因动物的心肌细胞。初次操作本方案的研究人员应接受额外的入门培训，以掌握高质量心肌细胞的稳定分离技术，这是成功实施该技术的重要前提。分离心肌细胞时，首先在器官取出后尽快用37°C含氧灌注缓冲液对12周龄或更年长小鼠的心脏进行灌注，持续4分钟。接着，用37°C消化缓冲液对心脏进行灌注，持续8至10分钟，并在整个心脏表面观察组织消化的进展，包括浑浊度、柔软度和酸性的逐渐增加。消化完成后，拨开右心耳，沿房室瓣上方解剖右心房。随后继续解剖左心房，接着解剖并弃去纤维性瓣膜装置。根据需要，进一步游离左、右心室游离壁及室间隔和较小的组织部分，完成解剖。接下来，将整个心室组织转移至含有2.5毫升消化缓冲液的60毫米培养皿中，然后将组织切成约1立方毫米大小的组织块。使用移液管缓慢吹打组织块，轻柔地将心室肌细胞解离为单细胞悬液，注意避免产生气泡或液体射流对细胞造成损伤。随后向细胞悬液中加入7.5毫升终止缓冲液。同时，在60毫米的培养皿中，将已消化的心房组织在1毫升消化缓冲液中切成约1立方毫米大小的组织块，然后像刚才演示的那样轻轻吹打心房心肌细胞。机械振荡后，加入4毫升终止缓冲液，以终止心房心肌细胞悬液中残留的胶原酶活性。随后将细胞悬液转移至15毫升锥形管中，静置15秒，使剩余的组织块沉淀，再收集上清液部分中的分离心肌细胞。经过一次洗涤步骤后，将心房心肌细胞轻轻重悬于5毫升灌注缓冲液中，并将细胞悬液分装至1.5毫升微量离心管中，每管约含1×10³个细胞，用于心室心肌细胞的TAT膜染色。首先，将细胞在1.5毫升反应管中静置8分钟，使其依靠重力沉降，以对心房心肌细胞进行染色；随后，在室温下以20×g离心2分钟，去除任一类型细胞的上清液。接下来，小心移除上清液，注意避免对细胞沉淀造成不必要的扰动。然后，在 800 微升膜特异性 Tyle 染料染料八和 EPS 中轻轻重悬细胞，并在避光孵育 15 分钟后，立即将心肌细胞转移至成像室中预先包被了层粘连蛋白的盖玻片上。用灌流缓冲液洗涤盖玻片一次，然后加入一毫升灌流缓冲液覆盖。采集心肌细胞中央胞内区域的样本图像，随后使用裁剪功能调整裁剪窗口，将最终像素大小设为 100 乘以 100 纳米。为选择最终成像平面，使用单帧图像手动选取Z方向中最合适的成像平面。确认TA膜网络包含T小管和A小管成分，并在焦平面上清晰可见。注意，典型的细胞内成像平面可能包含细胞核作为细胞内的中心参考点。为了分析 TATS 膜网络及其组分，现在使用适当的图像分析软件打开图像文件。使用多边形选择工具勾画感兴趣区域，排除细胞外表面膜，同时包含 TATS 膜网络的细胞内部分，如本图所示。接下来，使用编辑和清除外部命令生成选定的 ROI，使所选的细胞内区域仅包含 TATS 网络的细胞内膜部分，而不包含任何表面膜部分。现在点击“处理”并减去背景，将滚动球半径设置为5像素。然后选择“处理”并增强局部对比度，将块大小设置为49，直方图区间数设置为256，最大斜率设置为3，掩膜设置为无。单击“Process”（处理）并选择“Smooth”（平滑）插件，选择“Segmentation”（分割）和“Statistical Region Merging”（统计区域合并），并将参数设置为 Q 100。然后单击“Show Averages”（显示平均值）。接下来，选择图像类型为 8 位，然后选择“Image”（图像）→“Adjust”（调整）→“Threshold”（阈值），起始阈值设为 40。请注意，正确选择阈值应仅产生特异性的膜结构信号，避免因背景噪声导致的假阳性信号。然后在插件菜单中选择骨架化（skeleton）和二维/三维骨架化（skeletonized 2D 3D），并将骨架化的二维图像保存为自适应文件。接着再次选择插件，运行骨架分析（analyze skeleton 2D 3D），以对骨架化图像文件进行定量数据分析并输出结果。然后为剪枝周期方法选择“无”，并确认自动生成结果数据表。现在使用 Fiji 插件 Directionality，基于骨架化图像数据来分析适当血管网络组分的各个取向。在“方法”下选择傅里叶组分，结束分组为 180，直方图起始角度为 -45 度。最后，检查显示表格并生成方向性直方图。在第一幅图中，展示了健康心室肌细胞中T小管的代表性骨架化图像，该图像由垂直于图像X轴的横向元件和与X轴平行的轴向元件组成；应用方向性插件后，得到心室T小管的取向直方图，在0度处出现显著峰，代表轴向成分，而在90度处出现相近的峰，代表横向成分。相比之下，心房肌细胞中T小管的代表性骨架化图像主要由与图像X轴平行的轴向元件构成。因此，相应的取向直方图在零度区间附近表现出一个主导峰，代表轴向tats的比例，而在90度处仅有一个小峰，代表横向tats的比例。在执行该操作过程中，重要的是在细胞分离后的每一步、成像过程中，以及最重要的是在图像分析之前，都要检查细胞的质量。观看本视频后，您应能充分理解复杂的膜结构、tes网络以及可能的膜相关蛋白是如何被完全区分的。成年心肌细胞可通过共聚焦显微镜成像，并进行定量分析。请注意，操作脂溶性膜眼、消化酶以及可能具有传染性的心脏病患者样本时存在风险，因此在进行这些操作时，应始终采取铁质皮肤防护等预防措施。

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