Name: 小鼠角膜移植模型，研究实体器官移植的最常见形式 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-11-17T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 3 s
Description: 了解小鼠角膜移植模型用于研究急性同种异体移植排斥反应。该模型通过评估角膜透明度来检测排斥程度，帮助研究人员测试治疗策略并识别影响移植成功的重要因素。

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作者谨向众多致力于完善该技术并在本实验室及其他实验室中推动大量论文产出的研究人员表示感谢。本研究得到了美国国立卫生研究院基金项目 EY12707（PMS）以及防盲研究组织向眼科系提供的无限制性基金资助。

注意：本实验所使用的所有动物均依照眼科与视觉研究中动物使用声明（由视力研究协会制定）以及圣路易斯大学动物监管委员会制定的指南进行处理。 
注意：所有手术器械和溶液在手术前均已灭菌，以减少眼部微生物感染的风险。&#160;需要指出的是，尽管动物在该操作过程中会经历一定程度的疼痛，但我们并未使用镇痛剂。&#160;原因是所有镇痛剂均具有抗炎作用，而角膜移植反应涉及炎症过程，使用抗炎药物将影响我们对角膜移植物失败相关因素的判断。
1. 麻醉
<ol style="margin-left: 40px;">
	<li>通过腹腔注射氯胺酮（86.98 mg/kg）和赛拉嗪（13.04 mg/kg），使供体和受体小鼠进入全身麻醉状态。</li>
	<li>在整个手术过程中保持受体小鼠处于麻醉状态，手术通常持续30分钟至1小时。因此，需持续监测小鼠是否出现恢复意识的迹象。</li>
	<li>动物麻醉后，向不进行手术的一侧眼睛涂抹Puralube眼膏，以防止角膜干燥。</li>
</ol>
2. 角膜移植
<ol style="margin-left: 40px;">
	<li>获取供体角膜片。
	<ol>
		<li>动物完全麻醉后，滴入几滴1%托吡卡胺和2.5%盐酸去氧肾上腺素眼药水，以实现充分的散瞳。</li>
		<li>将供体动物的头部水平固定在置于稳固可移动支架上的板上，用一条胶带穿过颈部固定头部，确保在整个操作过程中眼睛保持水平位置。</li>
		<li>使用直径为2 mm的角膜刀（其刀尖已用甲基蓝染色），标记中央角膜移植物区域的轮廓。</li>
		<li>用锋利的刀片刺入角膜，并向眼前房注射海伦（healon），以加深前房，减少对供体角膜内皮细胞及下方晶状体造成损伤的风险。&#160;</li>
		<li>使用Vannas剪刀切除供体移植物，并将其置于含有Hanks’平衡盐溶液的培养皿中备用。</li>
		<li>在供体移植物被取出后，通过吸入CO2对供体小鼠实施安乐死。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>准备移植物床。
	<ol>
		<li>对受体动物重复步骤2.1.1至2.1.2中的相同操作。</li>
		<li>使用直径为1.5 mm的角膜刀，标记受体角膜上的移植物区域轮廓。</li>
		<li>用锋利的刀片刺入角膜，并向眼前房注射海伦（healon），以加深前房，减少对下方晶状体造成损伤的风险。</li>
		<li>使用Vannas剪刀将受体角膜上已标记的中央角膜片切除并丢弃。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>缝合移植物。
	<ol>
		<li>将供体角膜覆盖于受体角膜的移植物床上。确保供体角膜下方有足够的海伦（healon），以防止供体角膜内皮细胞因直接接触晶状体而受损。</li>
		<li>使用超细尖显微镊，将11-0尼龙缝线的第一针从供体侧进入，穿透供体组织至全层厚度的90%，再穿至受体侧，然后打结固定。</li>
		<li>一旦角膜被固定到位，进行中位间断缝合，使角膜总共缝合8至10针，确保供体角膜与受体角膜移植物床准确对齐并牢固附着。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>加深前房。
	<ol>
		<li>通过向眼前房注射HBSS或空气泡来加深前房，并用纤维素海绵轻轻检查角膜移植物是否漏液。 
		注：如果无法重建前房，则发生白内障的概率较高，这将使后续对移植角膜的评估变得非常困难，并可能导致供体角膜内皮功能障碍，从而引起移植物失败。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>最终评估。
	<ol>
		<li>观察眼睛，确认瞳孔呈圆形，前房深度正常。 
		注：如果瞳孔不呈圆形，表明在缝合过程中虹膜受到损伤，该移植物被视为技术性失败。</li>
		<li>在眼部涂抹抗生素软膏。可选：使用7-0丝线缝合眼睑。</li>
		<li>观察小鼠直至其完全清醒，然后将其单独饲养，术后至少两天内不得合笼。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 拆线
<ol style="margin-left: 40px;">
	<li>若使用眼睑缝线，按上述方法麻醉小鼠，并在48小时时拆除眼睑缝线。</li>
	<li>术后第7天对小鼠进行麻醉，拆除固定角膜移植物的缝线。缝线拆除且动物完全苏醒后，将其放回笼中。</li>
</ol>
4. 临床评估
<ol style="margin-left: 40px;">
	<li>检查眼睛是否存在手术并发症的迹象，包括白内障（晶状体混浊）、前房积血（前房内出血）、前房深度异常或角膜明显混浊。将出现上述并发症的动物视为“受损”个体，并通过吸入 CO2 实施安乐死。
	<ol>
		<li>所有检查均应在未麻醉的小鼠上进行。用一只手固定小鼠，使其保持稳定，以便另一只手可轻柔地突出眼球，从而更清晰地观察眼部结构。完成观察后，将动物放回笼中。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>安排对治疗分组不知情的观察者每周 2 至 3 次评估移植角膜，以检测角膜移植物排斥反应或角膜移植物失败的迹象。可使用手术显微镜或水平裂隙灯生物显微镜进行这些观察。
	<ol>
		<li>使用 0 至 5 的评分标准评估每个角膜的混浊程度。评分标准定义如下：
		<ol>
			<li>若角膜无任何混浊迹象，则评分为 0。</li>
			<li>若角膜仅显示轻微表层混浊，则评分为 1。</li>
			<li>若角膜呈现轻度且较深层的混浊，但下方的瞳孔和虹膜仍可辨认，则评分为 2。</li>
			<li>若角膜出现基质层混浊，无法清晰观察虹膜细节，仅能分辨瞳孔边缘，则评分为 3。</li>
			<li>若角膜呈现致密的基质层混浊，且无法观察到任何下方结构，则评分为 4。</li>
			<li>若角膜呈现完全混浊并伴有严重的基质水肿，瞳孔和虹膜完全不可见，则评分为 5。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>同时使用 1 至 8 的评分标准评估每个角膜的血管浸润程度（新生血管形成）。具体方法为：将角膜分为四个相等的象限，分别评估每个象限内的血管分布情况，评分范围为 0（无血管）至 2（该象限内血管广泛增生）。将四个象限的评分相加，得出最终的新生血管化总评分。</li>
		<li>若角膜在术后 5 周内连续两次观察评分均为 3 分，则将其归类为急性排斥。</li>
		<li>若小鼠在术后 5&#160;周时角膜清晰，但在移植后 &#62;45&#160;天出现混浊，并在连续两个时间点评分达到 3 分，则将其归类为晚期角膜同种异体移植物排斥。采用 Kaplan-Meier 生存曲线分析移植物存活率。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. 模型的操控
<ol style="margin-left: 40px;">
	<li>从脾脏制备单细胞悬液。
	<ol>
		<li>为制备单细胞悬液，首先处死供体小鼠，然后取出脾脏。</li>
		<li>将脾脏置于细胞滤器中，用3 ml注射器的活塞研磨破坏组织。</li>
		<li>洗涤细胞，并重悬于10 ml的Hanks平衡盐溶液中。</li>
		<li>取10 μl细胞悬液加入10 μl 0.4%台盼蓝溶液，混匀。取混合液滴加至血细胞计数板，计数中央方格内的细胞数。试管中细胞总数为：细胞计数值 × 104 × 2（台盼蓝稀释倍数）× 10（试管中液体体积，单位为ml）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>前房注射。
	<ol>
		<li>按前述方法麻醉小鼠。</li>
		<li>在解剖显微镜下进行注射操作。每次前房内注射使用106个脾细胞，注射体积为0.005 ml，采用装有33 G&#160;针头的0.25 ml微量注射器。 
		注意：可通过给予动物特定试剂（作为激动剂或拮抗剂）来对模型进行其他干预，以确定某一特定因子在原位角膜异体移植术后可能发挥的作用。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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</ol>

作者没有竞争性财务利益。

本文所述的小鼠角膜移植模型使研究者能够在预测与角膜同种异体移植物排斥15,17,18,20,26-30和接受21-25最相关因素方面，开展具有预测价值的研究。与人类角膜移植不同，在人类角膜移植中，患者通常接受局部或全身性皮质类固醇治疗以治疗或预防排斥反应31，而该模型通常用于确定在无此类治疗情况下与同种异体移植物排斥相关的因素。除了急性角膜同种异体移植物排斥模型（通常发生在移植后30至40天内）外，我们还提供一种晚期排斥模型，该模型在小鼠移植后45&#160;天发生，模拟了晚期和慢性排斥反应的多种特征32,33，而此类特征迄今为止在动物模型中尚未得到成功复制。
该模型的优势在于，可以剖析导致角膜异体移植接受率相对较高的各种机制，同时也能确定哪些机制是导致角膜异体移植失败的主要原因。该模型还允许在具有与人类免疫系统非常相似的免疫系统的动物体内测试多种治疗策略。此外，由于存在大量可与小鼠因子发生反应的试剂，以及转基因和基因靶向小鼠品系，使得能够评估的影响因素远多于其他物种。这种能够评估众多与角膜异体...

角膜移植是人类实施的最成功且最常见的移植类型之一。实施该手术的原因包括外伤、感染性疾病1或其他形式的非感染性角膜疾病2。美国眼库协会的数据显示，2011年实施的角膜移植手术超过46,000例（参见网站：restoresight.org/eye_banks/eye_banks.html）。其成功的一个指标是，同种异体角膜移植物的一年失败率在10%至15%之间，而五年成功率超过70%3-8。大量研究表明，角膜同种移植物的成功直接与眼部具有免疫豁免地位这一事实相关。角膜具有免疫豁免地位的因素包括角膜中缺乏血管和淋巴管、抗原呈递细胞相对缺失、角膜产生的抑制免疫效应功能的因子9-15、主要组织相容性复合物（MHC）抗原表达水平较低16，以及Fas配体（FasL）的表达17-20。
然而，尽管存在这些有利于移植成功的因素，这些移植物仍会发生排斥反应3-7。因此，阐明介导这种排斥反应的机制，并测试各种预防排斥的治疗方法，具有极其重要的意义。为此，本文介绍了一种已使用超过20年的鼠类角膜移植模型，用于在可控的实验环境中研究角膜移植。由于移植反应涉及多种不同因素的协同作用，最终决定移植组织的成功或失败，因此无法通过任何体外（in vitro）模型来充分理解这些因素的作用。因此，必须利用完整的动物模型来确定哪些因素对移植组织的成功或失败具有重要意义。
尽管其他动物物种已被用于角膜移植研究，但与使用其他物种相比，小鼠模型具有多项优势。首先，存在多种小鼠品系，它们表达特定的转基因，或经过基因靶向处理而缺失某些免疫因子的表达，从而可更深入地研究这些因子在移植过程中的功能。此外，目前有大量针对小鼠的试剂（包括重组因子和可中和因子的抗体），而这些试剂在许多其他动物物种中并不存在。由于上述因素的存在，该模型已被广泛用于鉴定参与急性角膜同种异体移植物反应的相关因子15,17,18,20-29。此外，已知参与角膜移植的许多因子在其他组织移植中也具有功能。

<table><tbody><tr><td>蔡司手术显微镜</td><td>Zeiss</td><td>翻新</td><td></td></tr><tr><td>1 ml 注射器</td><td>BD</td><td>305122</td><td></td></tr><tr><td>3 ml 注射器</td><td>BD</td><td>309657</td><td></td></tr><tr><td>10 ml 注射器</td><td>BD</td><td>309602</td><td></td></tr><tr><td>Vannus 剪刀</td><td>Stortz</td><td>E-3387</td><td></td></tr><tr><td>11-0 缝合线</td><td>Alcon</td><td>717939M</td><td></td></tr><tr><td>2.0 mm 角膜环钻</td><td>Katena</td><td>K 2-7520</td><td></td></tr><tr><td>1.5 mm 角膜环钻</td><td>Katena</td><td>K 2-7510</td><td></td></tr><tr><td>0.5% 盐酸三卡因</td><td>Alcon</td><td>NDC 0065-0741-12</td><td></td></tr><tr><td>Healon</td><td>Abbott</td><td>Healon OVD</td><td></td></tr><tr><td>镊子</td><td>FST</td><td>11251-20</td><td></td></tr><tr><td>7-0 缝合线</td><td>Alcon</td><td>8065</td><td></td></tr><tr><td>2.5% 盐酸去氧肾上腺素</td><td>Alcon</td><td>NDC 61314-342-02</td><td></td></tr><tr><td>1% 托吡卡胺</td><td>Bausch &amp;amp; Lomb</td><td>NDC-24208-585-59</td><td></td></tr><tr><td>Hamilton 注射器</td><td>Hamilton</td><td>7654-01</td><td></td></tr><tr><td>33 号针头</td><td>Hamilton</td><td>90033</td><td></td></tr><tr><td>细胞筛（100 &amp;mu;m 尼龙）</td><td>BD Falcon</td><td>352360</td><td></td></tr><tr><td>血细胞计数板</td><td>Cardinal Health</td><td>B3175</td><td></td></tr><tr><td>台盼蓝</td><td>Sigma</td><td>T8154</td><td></td></tr></tbody></table>

小鼠角膜移植：研究最常见实体器官移植形式的模型

Murine Corneal Transplantation: A Model to Study the Most Common Form of Solid Organ Transplantation

角膜移植是美国最常见的器官移植形式，每年进行的手术数量在45,000至55,000例之间。目前已有多种该手术的动物模型，其中小鼠是最常使用的物种。选择小鼠的原因包括使用该物种的相对成本较低、存在大量基因型明确的品系可用于研究免疫反应，以及有丰富的试剂可用于进一步界定该物种中的免疫应答。该模型已被用于确定角膜中导致该组织具有相对免疫豁免状态的因素，从而使角膜同种异体移植物在不使用免疫抑制治疗的情况下能够避免急性排斥反应。该模型还被用于鉴定在同种异体移植物排斥反应中起关键作用的因素。因此，目前我们对角膜同种异体移植物接受与排斥机制的大部分认识，均源于采用小鼠角膜移植模型的研究。除了描述急性角膜同种异体移植物排斥反应模型外，我们还首次提出了一种晚期角膜同种异体移植物排斥反应模型。

角膜移植的小鼠模型已被成功用于研究角膜同种异体移植物排斥19-23和角膜同种异体移植物接受13,15,16,18, 24-27的机制，应用历史已超过20年。该模型曾用于确立FasL表达在角膜同种异体移植物接受中的重要性，缺乏FasL的动物无法接受角膜同种异体移植物15。该模型还被用于证明，血管内皮生长因子受体1的吗啉代（morpholino）处理可显著提高角膜移植物的存活率28。在最近的一篇报道中，该模型被用于检测小鼠在角膜移植前使用皮质类固醇预处理是否具有治疗益处29。作者发现此类预处理确实可提高角膜同种异体移植物的存活率29。这些研究明确表明，该模型的主要优势在于可在活体动物中研究那些被认为对人类角膜移植成功至关重要的因素。
本实验室先前的研究报道，角膜同种异体移植物排斥的主要机制之一是针对角膜移植物所表达的特异性同种异体抗原而建立的全身性迟发型超敏反应（DTH）19,20...

小鼠已被用作研究多种移植形式的模型，包括角膜移植。本文报道了一种用于急性期和远期角膜移植研究的小鼠模型。

角膜移植是美国最常见的器官移植形式，每年进行的手术数量在45,000至55,000例之间...

以下操作的总体目标是建立急性角膜同种异体移植排斥反应模型。该模型的建立首先需要摘除供体角膜，随后进行受体植床的准备，并将供体角膜缝合固定于适当位置。然后评估移植物的完整性，若无渗漏，则缝合闭合眼睑。一周后，评估角膜移植物的混浊程度，以衡量同种异体移植物的排斥反应。最终，该模型可用于测试多种治疗策略，以确定与实体器官移植中同种异体移植物排斥反应相关的关键因素。角膜移植在美国是最常见的手术。目前已有多种适用于该手术的动物模型，但小鼠是最常用的。该模型已被用于确定参与角膜移植排斥与接受过程的多种因素。在对供体和受体小鼠进行麻醉，并通过脚趾夹捏确认其麻醉状态后，将纯润滑软膏涂抹于非手术眼的眼睛表面。然后用一条胶带穿过颈部，将头部固定，使供体眼保持水平于一个坚固且可移动的支撑物上。现在使用直径为2毫米、尖端经甲基蓝染色的齿状器械，勾画出中央角膜移植区域的轮廓。然后使用15度眼科刀片刺入角膜，以避免损伤下方的晶状体。将粘弹性溶液注入前房，使前房加深。现在用威尼斯剪刀切除供体移植物，并将移植物转移至盛有冰上HBSS的培养皿中备用。为达到散瞳效果，向受体眼滴加数滴1%托吡卡胺和2.5%肾上腺素盐酸盐溶液。然后使用1.5毫米的齿状标记器勾勒出移植区域，如前所述，用15度眼科刀片刺入角膜，并向前房内注射粘弹性溶液以加深前房。此操作旨在维持供体角膜与晶状体之间的空间，从而降低对下方晶状体及供体角膜内皮损伤的风险。使用Vannas剪刀将受体上已标记的中央角膜片剪下并弃去。加入黏弹性介质至角膜圆片被移除后的区域，以保护角膜内皮细胞免受晶状体直接接触造成的损伤。现在使用超细尖显微镊将供体角膜放置于植床之上。将11-0尼龙缝线的第一针穿过供体角膜，深度约为角膜全厚度的90%。然后在受体侧相同深度处打结固定。继续使用中位间断缝线固定移植的角膜。总共需要8到10针即可。现在用生理盐水注射重新形成并冲洗前房。或者，向前房内注射空气以使其复位。注射后，使用纤维素海绵轻轻测试移植物的完整性。最后，评估眼部情况。确定瞳孔是否圆形，前房是否正常。如果移植片外观良好，涂抹抗生素眼膏，并可根据需要在术后用连续的7.0丝线缝合闭合眼睑。持续监测小鼠直至其完全清醒，然后在其饲养笼中继续观察两天。在手术后4至7天内，对麻醉的小鼠进行拆线。拆线后，再观察小鼠数天。使用混浊度评分标准，对每只角膜进行0到5分的评分。0分表示无混浊；1分表示轻微的表层混浊。评分为2分表示角膜轻度至较深的混浊，但仍可辨认出下方的瞳孔。评分为3分表示角膜基质混浊，虹膜无法清晰观察，仅能分辨瞳孔边缘。若出现致密的基质混浊，且无法看到任何下方结构，则应将移植物评为4分。如果存在严重间质性水肿导致完全不透明，且瞳孔和虹膜均完全无法观察，则将移植物评分为5分。文本方案还建议采用0到8的评分标准来评估血管浸润程度。利用该移植物模型可进行多种多样的操

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小鼠角膜移植模型，研究实体器官移植的最常见形式

小鼠颈部心脏移植模型非常适合用于免疫学以及缺血再灌注损伤的研究。我们采用了一种无缝线套管技术对该手术方法进行了改良，并利用该技术成功完成了1000多例移植手术。<br...

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本文介绍了一种研究排斥反应免疫学机制的实验方案。所采用的手术模型具有手术时间短、操作步骤简洁的特点。根据供体与受体小鼠品系的组合不同，移植肾脏可能出现急性细胞排斥反应或慢性移植物损伤，后者以间质纤维化和肾小管萎缩为特征。...

小鼠肾移植：同种异体移植物排斥模型

为了研究联合实体器官与血管化复合异体移植，我们描述了一种新的小鼠异位整块胸壁、胸腺和心脏移植模型，该模型采用颈部无缝合套管技术。...

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小鼠全层皮肤移植是一种研究同种免疫环境下排斥反应的成熟模型。本文中，我们将详细介绍进行BALB/c--&gt;C57BL/6全层皮肤移植的每一步操作流程。...

小鼠全层皮肤移植

本文介绍了一种猪角膜瓣的制备与培养的逐步操作方案。由于该类器官型培养的器官培养模型在15天内的细胞死亡率与人供体角膜相当，因此成为首个无需添加有毒右旋糖酐即可实现非人角膜长期培养的模型。...

一种利用分割角膜瓣构建的猪角膜内皮器官培养模型

本文介绍了一种改良的异位血管化心脏移植技术，并更新了无菌操作、镇痛和麻醉方法。...

一种改良的小鼠异位心脏移植方案，符合当代无菌技术、麻醉与镇痛标准

本方案介绍了一种经瞳孔视觉引导的经巩膜入路，可安全、精确地向患有或不患有视网膜变性的受体小鼠递送视网膜下细胞移植物，且手术并发症发生率较低。...

视网膜变性小鼠模型中经瞳孔引导的经巩膜下视网膜下移植术

本研究建立了两种标准化的小鼠异种移植模型，可特异性地模拟急性细胞性排斥反应和急性抗体介导的排斥反应。这些模型为研究移植物免疫排斥机制、评估免疫抑制策略以及推进异种移植的临床前研究提供了可靠的平台。...

一种用于研究异种移植中急性细胞和抗体介导排斥反应的标准化小鼠模型及三人工作流程

本方案介绍了一种简化的、端对侧缝合吻合技术，用于小鼠颈部心脏移植，为研究移植免疫学提供了一个稳定且可重复的模型。...

采用端侧吻合技术进行颈部异位小鼠心脏移植以研究移植免疫学

了解小鼠角膜移植模型用于研究急性同种异体移植排斥反应。该模型通过评估角膜透明度来检测排斥程度，帮助研究人员测试治疗策略并识别影响移植成功的重要因素。

小鼠角膜移植：研究最常见实体器官移植形式的模型

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