Name: 相干反斯托克斯拉曼散射（CARS）显微可视化药片剂溶出过程中 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-07-04T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 59 s
Description: 了解相干反斯托克斯拉曼散射显微技术用于实时可视化药片溶出过程的方法。该技术结合紫外吸收光谱，可观察茶碱晶体生长并关联溶出速率变化，为药物制剂优化提供实时数据支持。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

AF 由荷兰技术基金会 STW 提供支持，STW 是荷兰科学研究组织（NWO）的应用科学部门，以及荷兰经济事务部的技术项目（STW OTP 11114）。

<img alt="光学光谱实验装置示意图；包含激光器、显微镜、流动池；用于吸收研究。" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51847/51847fig1highres.jpg" width="500" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图1">
图1. CARS显微镜系统与内置流通式溶出装置的示意图。 该图改编自 Fussell et al13。
1. 系统启动
<ol>
	<li>开启20皮秒脉冲1,064纳米CARS激光器，并预热约1.5小时。</li>
	<li>开启氘灯紫外光源，并预热约10分钟。</li>
	<li>将氘灯紫外光源的快门开关设为“打开”状态，以开启快门。</li>
	<li>启动显微镜控制计算机，并打开显微镜控制软件。</li>
	<li>启动紫外光谱仪计算机，并打开光谱仪控制软件。</li>
</ol>
2. 显微镜设置
<ol>
	<li>选择所需的显微镜物镜。使用20倍/0.5数值孔径（20X/0.5 NA）的物镜以获得本文所示的实验结果。</li>
	<li>设置滤光片转轮中的滤光片，使其透射激发激光并反射CARS信号。选择775 nm长通二向色镜和650 nm带通40 nm滤光片，以复现本文所示的实验结果。</li>
	<li>在光电倍增管（PMT）探测器前放置适当的滤光片，以透射CARS信号并滤除不需要的光。使用750 nm短通滤光片和650 nm带通40 nm滤光片对光进行过滤，以重复本文所进行的实验。</li>
</ol>
3. 系统测试
<ol>
	<li>开启蠕动泵，使溶出介质以Z形紫外流通池循环数分钟，以清除管路中残留的液体。</li>
	<li>通过称量2分钟内泵出的溶出介质质量来确定泵的流速。调节泵速直至达到所需流速。本研究中报告的结果均在5 ml/min的流速下获得。</li>
</ol>
4. 紫外溶解度测定
<ol>
	<li>在紫外分光光度计控制软件中，单击“File”菜单，然后单击“New absorbance measurement”，打开列出所有可用分光光度计的窗口。</li>
	<li>单击正确的紫外分光光度计，然后单击“Next”，打开显示数据采集参数的窗口。</li>
	<li>设定积分时间和光谱平均次数。为重现本文所示结果，选择150 msec的积分时间并设置200次平均。</li>
	<li>单击标有“Next”的按钮，进入用于记录参考光谱的界面。</li>
	<li>单击显示为黄色灯泡的按钮以记录参考光谱。在此测量过程中持续泵送溶出介质。</li>
	<li>将氘灯紫外光源的快门开关设置为“closed”，关闭快门。</li>
	<li>单击标有“Next”的按钮，进入用于记录暗光谱的界面。</li>
	<li>单击显示为灰色灯泡的按钮以记录暗光谱。在此测量过程中持续泵送溶出介质。</li>
	<li>单击标有“Finish”的按钮，开始进行紫外吸光度测量。</li>
</ol>
5. CARS 溶解视频
<ol>
	<li>在CARS显微镜控制软件中，点击选择“XYT”测量模式的按钮。</li>
	<li>点击下拉框并选择以像素为单位的图像尺寸。为重现本文报道的图像，选择512 x 512像素的图像尺寸。</li>
	<li>拖动成像速度滑块至“快速”、“中速”或“慢速”位置。为获得本文所示结果，请使用快速扫描模式（每幅图像1.12秒）。</li>
	<li>点击标有“zoom”的箭头以调整放大倍数。选择“2x”放大倍数，以复制本实验结果所用的放大水平和视野范围（350 x 350 µm）。</li>
	<li>点击下拉框并选择所使用的物镜。</li>
	<li>点击输入框并输入CARS溶解视频所需的帧数（根据实验时长而定）。为重现本文所示结果，建议记录900帧，进行约15分钟的溶解过程。</li>
</ol>
6. CARS 波长调谐
<ol>
	<li>使用光参量振荡器（OPO）控制器调节OPO的参数，例如温度、压电位置和Lyot滤波器位置，直至在目标拉曼频率下达到最大激光输出。将OPO调谐至2,960 cm-1，以获得与本文所述相同的结果。</li>
</ol>
7. 溶解实验
<ol>
	<li>将一片药片放入自制的CARS流通池样品架中，拧紧样品架以防止泄漏。</li>
	<li>连接管路，将CARS流通池与盛有溶出介质的烧杯及蠕动泵相连。</li>
	<li>将装有药片的CARS流通池放置在显微镜载物台上。</li>
	<li>检查CARS流通池是否已正确连接至溶出介质烧杯、蠕动泵、Z形紫外流通池以及废液收集烧杯。</li>
	<li>点击“XY重复”按钮，启动显微镜系统进入连续扫描模式。</li>
	<li>调节显微镜焦距，移动物镜直至在显微镜控制计算机屏幕上看到药片表面处于视野范围内。</li>
	<li>在显微镜控制软件中点击标有“PMT”的滑块，通过调节PMT电压来调整探测器灵敏度，直至屏幕上显示的图像清晰（既不过暗也不过饱和）。注意：避免使用过高电压导致PMT过载。本研究中使用的PMT电压约为600 V，但具体数值可能因所用PMT型号而异。</li>
	<li>在显微镜控制软件中点击“停止”按钮，结束连续扫描。</li>
	<li>同时（或尽可能接近同时）启动溶出介质泵送、开始记录单次XYT扫描，并开始采集紫外吸收光谱。</li>
	<li>在溶出实验过程中，监控视频记录，并手动调节显微镜焦距，确保药片始终处于清晰对焦状态。</li>
</ol>
8. 溶解后处理
<ol>
	<li>关闭蠕动泵以停止运行。</li>
	<li>在显微镜控制软件中，单击“文件”菜单，然后单击“另存为视频”，将 XYT 扫描保存为视频。</li>
	<li>在光谱仪控制软件中，单击“文件”菜单，然后单击“保存”，再单击“停止导出”，以停止紫外吸收光谱的采集。</li>
	<li>从显微镜载物台上取下 CARS 流通池，并从 CARS 流通池中取出药片。</li>
	<li>使用水和乙醇清洗 CARS 流通池，然后用纸巾擦干。</li>
</ol>

<ol><li>Ku, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+the+Biopharmaceutical+Classification+System+in+Early+Drug+Development%5BTitle%5D)+AND+%22The+AAPS+Journal%22%5BJournal%5D)">Use of the Biopharmaceutical Classification System in Early Drug Development.</a> The AAPS Journal. 10, 208-212 (2008).</li>
<li>The United States Pharmacopeia. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22United+States+Pharmacopeial+Convention+32nd+ed%22">United States Pharmacopeial Convention 32nd ed</a>. , Rockville, MD. 1-8 (2009).</li>
<li>Florence, A. J., Johnston, A. Applications of ATR UV/vis spectroscopy in physical form characterisation of pharmaceuticals. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aFlorence%2C+AJ+%22Spectrosc.+Eur%22">Spectrosc. Eur</a>. 4, John Wiley & Sons Ltd. (2004).</li>
<li>Aaltonen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+measurement+of+solvent-mediated+phase+transformations+during+dissolution+testing%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Pharm.+Sci%22%5BJournal%5D)">In situ measurement of solvent-mediated phase transformations during dissolution testing.</a> J. Pharm. Sci. 95, 2730-2737 (2006).</li>
<li>Savolainen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Better+understanding+of+dissolution+behaviour+of+amorphous+drugs+by+in+situ+solid-state+analysis+using+Raman+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Pharmaceutics+and+Biopharmaceutics%22%5BJournal%5D)">Better understanding of dissolution behaviour of amorphous drugs by in situ solid-state analysis using Raman spectroscopy.</a> European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 71, 71-79 (2009).</li>
<li>Slipchenko, M. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vibrational+imaging+of+tablets+by+epi-detected+stimulated+Raman+scattering+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Analyst%22%5BJournal%5D)">Vibrational imaging of tablets by epi-detected stimulated Raman scattering microscopy.</a> Analyst. 135, 2613-2619 (2010).</li>
<li>Parekh, S. H., Lee, Y. J., Aamer, K. A., Cicerone, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Label-Free+Cellular+Imaging+by+Broadband+Coherent+Anti-Stokes+Raman+Scattering+Microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Label-Free Cellular Imaging by Broadband Coherent Anti-Stokes Raman Scattering Microscopy.</a> Biophys. J. 99, 2695-2704 (2010).</li>
<li>Kang, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+Situ+Visualization+of+Paclitaxel+Distribution+and+Release+by+Coherent+Anti-Stokes+Raman+Scattering+Microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">In Situ Visualization of Paclitaxel Distribution and Release by Coherent Anti-Stokes Raman Scattering Microscopy.</a> Anal. Chem. 78, 8036-8043 (2006).</li>
<li>Kang, E., Robinson, J., Park, K., Cheng, J. -X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paclitaxel+distribution+in+poly%28ethylene+glycol%29%2Fpoly%28lactide-co-glycolic+acid%29+blends+and+its+release+visualized+by+coherent+anti-Stokes+Raman+scattering+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Controlled+Release%22%5BJournal%5D)">Paclitaxel distribution in poly(ethylene glycol)/poly(lactide-co-glycolic acid) blends and its release visualized by coherent anti-Stokes Raman scattering microscopy.</a> J. Controlled Release. 122, 261-268 (2007).</li>
<li>Kang, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+coherent+anti-stokes+Raman+scattering+microscopy+to+image+the+changes+in+a+paclitaxel-poly%28styrene-b-isobutylene-b-styrene%29+matrix+pre-+and+post-drug+elution%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedical+Materials+Research+Part+A%22%5BJournal%5D)">Application of coherent anti-stokes Raman scattering microscopy to image the changes in a paclitaxel-poly(styrene-b-isobutylene-b-styrene) matrix pre- and post-drug elution.</a> Journal of Biomedical Materials Research Part A. 87A, 913-920 (2008).</li>
<li>Jurna, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coherent+anti-Stokes+Raman+scattering+microscopy+to+monitor+drug+dissolution+in+different+oral+pharmaceutical+tablets%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Innovative+Optical+Health+Sciences%22%5BJournal%5D)">Coherent anti-Stokes Raman scattering microscopy to monitor drug dissolution in different oral pharmaceutical tablets.</a> Journal of Innovative Optical Health Sciences. 2, 37-43 (2009).</li>
<li>Windbergs, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+Imaging+of+Oral+Solid+Dosage+Forms+and+Changes+upon+Dissolution+Using+Coherent+Anti-Stokes+Raman+Scattering+Microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Chemical Imaging of Oral Solid Dosage Forms and Changes upon Dissolution Using Coherent Anti-Stokes Raman Scattering Microscopy.</a> Anal. Chem. 81, 2085-2091 (2009).</li>
<li>Fussell, A., Garbacik, E., Offerhaus, H., Kleinebudde, P., Strachan, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+dissolution+analysis+using+coherent+anti-Stokes+Raman+scattering+%28CARS%29+and+hyperspectral+CARS+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Pharmaceutics+and+Biopharmaceutics%22%5BJournal%5D)">In situ dissolution analysis using coherent anti-Stokes Raman scattering (CARS) and hyperspectral CARS microscopy.</a> European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 85, 1141-1147 (2013).</li>
<li>Lua, Y. -Y., Cao, X., Rohrs, B. R., Aldrich, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surface+Characterizations+of+Spin-Coated+Films+of+Ethylcellulose+and+Hydroxypropyl+Methylcellulose+Blends.+%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Surface Characterizations of Spin-Coated Films of Ethylcellulose and Hydroxypropyl Methylcellulose Blends. </a> Langmuir. 23, 4286-4292 (2007).</li>
<li>Skoog,, Holler, F. J., Crouch, S. R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSkoog%2C++%22Principles+of+Instrument+analysis.+6+ed%22">Principles of Instrument analysis. 6 ed</a>. , Thomson Brooks/Cole. (2007).</li>
<li>Rodríguez-Hornedo, N., Lechuga-Ballesteros, D., Hsiu-Jean, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phase+transition+and+heterogeneous%2Fepitaxial+nucleation+of+hydrated+and+anhydrous+theophylline+crystals%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Pharm%22%5BJournal%5D)">Phase transition and heterogeneous/epitaxial nucleation of hydrated and anhydrous theophylline crystals.</a> Int. J. Pharm. 85, 149-162 (1992).</li>
</ol>

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

进行CARS显微溶解实验时，实验过程中有几个关键方面需要监测。首先，将溶解介质引入CARS流动池会导致焦平面移动，这意味着图像会立即丢失，需要对物镜进行数微米的调整才能重新找到样品表面。其次，如果实验过程中玻璃盖片破裂，CARS流动池存在液体泄漏的风险，这可能对光学元件造成液体损害，因此重要的是要注意是否有破裂声，以判断玻璃是否已破碎。最后，实验过程中系统内的颗粒物也可能导致管路堵塞，这种情况可通过紫外光谱出现突然异常变化以及定期检查实验中的流速来发现。
颗粒物堵塞管道主要出现在设计为在溶出过程中崩解的片剂中。这是该技术的局限性之一，因为此系统要求片剂表面在整个溶出过程中保持完整，以便进行成像。除了会崩解的片剂外，目前还无法对设计为在溶出过程中膨胀的片剂进行成像，因为这可能导致CARS流动池破裂。
在溶出过程中对片剂进行成像，有助于更深入理解片剂表面发生的动态变化。传统的药物溶出方法仅关注溶出介质中药物的溶解量，以此判断片剂是否符合规定标准。然而，当测试失败时，难以确定导致失败的具体原因。溶出试验失败的情况可能涉及 原位 使用CARS显微镜进行溶解分析可提供答案。
未来应用 原位 使用CARS显微技术进行溶出分析时，可包括在处方开发过程中对含有多种药物或辅料的更复杂片剂的研究，特别是非膨胀型缓释或控释制剂。此外，还可利用生物相关溶出介质对样品进行考察，以建立更接近生理条件的实验环境。 体内. 
综上所述，本研究表明，基于拉曼振动频率的相干反斯托克斯拉曼散射（CARS）显微技术能够实现化学特异性快速成像，从而在同时含有药物和辅料的片剂中选择性地对药物进行成像。此外，CARS显微技术结合在线紫外吸收光谱法是一种强大的工具，可用于监测片剂溶出过程中表面的变化，并将CARS观察到的表面变化与溶出速率的变化相关联。

在开发片剂和胶囊等口服药物剂型的过程中，溶出度测试受到高度重视。口服剂型必须在体内溶解后才能被吸收，从而发挥治疗作用。溶解性差的药物通常难以达到足够的浓度，因此溶出度测试尤为重要1。药典规定的溶出度方法是溶出度分析中最常用的方法。大多数情况下，该方法需要将药物制备成片剂或胶囊，然后将其置于盛有流动溶出介质的烧杯中。通过采用紫外吸收光谱等标准光谱技术分析溶出介质样品，测定药物的溶出浓度2。这些传统的药物溶出方法无法对样品本身或剂型溶解释放表面可能发生的改变进行直接分析。在溶出过程中对样品进行直接分析，可提供更多关于剂型溶出行为的信息，并有可能识别导致溶出度测试失败的问题所在。
直接分析溶解型剂型需要使用 原位 能够监测溶解过程的分析技术。用于记录 原位 在溶出过程中，分析技术不应受到溶出介质存在的干扰，且需要具有较高的时间分辨率，以可靠地测量溶出剂型在数秒量级内的变化。衰减全反射紫外光谱法已被证明适用于溶出过程中变化的测量，但缺乏成像技术所提供的空间分辨率。3传统的药物成像技术，如扫描电子显微镜（SEM）和自发拉曼成像，均存在一定的局限性，限制了其应用 原位 用于溶解。
扫描电镜成像是一种高分辨率的快速成像技术，能够对药物剂型的表面进行成像。然而，扫描电镜成像通常需在真空条件下进行，并需要对样品进行镀膜处理，因此不适用于 原位 溶解&#160;成像。采用光纤耦合的自发拉曼光谱技术，结合流通池和紫外流通吸收光谱，已用于监测多种药物体系。 原位 溶解过程中，包括茶碱4卡马西平和吲哚美辛5拉曼光谱能够识别溶解过程中发生的表面变化，但无法提供表面变化具体位置的空间信息。自发拉曼成像利用拉曼光谱，可提供样品表面的空间分布信息，但成像时间根据图像面积的不同，通常需要数分钟至数小时，因此不适用于 原位 溶解成像
相干反斯托克斯拉曼散射（CARS）显微技术是一种快速成像技术，结合在线紫外吸收光谱，使我们能够开发出一种具备以下能力的技术 原位 溶解度分析。CARS显微镜能够提供快速且具有化学选择性的成像，且不受溶解介质存在的影响，因此是一种适用于 原位 溶解度分析。根据激光脉冲持续时间的不同，CARS 技术大致分为两类：一类是窄带 CARS（皮秒脉冲激光器），另一类是宽带 CARS（飞秒脉冲激光器）。典型的 CARS 显微系统由两个脉冲激光源和一台倒置显微镜组成。为了产生 CARS 信号，其中一个脉冲激光器需要具备可调谐性，以便&#160;两束激光之间存在一个与拉曼振动相匹配的频率差。此外，这两束激光需要发生空间重叠。&#160;在空间（空间）和时间（时间）上，两束激光的脉冲同时到达样品的同一区域。由于拉曼振动具有化学特异性，且CARS信号仅在显微镜的焦体积内产生，因此CARS显微技术能够实现化学选择性成像，分辨率可达衍射极限。
窄带CARS显微镜&#160;使用单一拉曼振动模式可以&#160;约100倍&#160;相比自发拉曼成像技术，成像速度更快6宽带CARS显微成像覆盖更宽的光谱范围（600–3,200 cm⁻¹）-1 vs. 约 4 cm-1）但光谱分辨率较低（约10 cm⁻¹）-1 vs. 约 4 cm-1）以及较慢的成像速度（50毫秒/像素 vs. ~5 &#956;每像素秒）与窄带CARS显微镜相比7.
窄带CARS显微技术已被用于成像某些药物递送系统中的药物释放过程。在药物制剂领域，Kang et al.8-10 对载药聚合物薄膜进行了成像，首先成像了药物在薄膜中的分布，随后在静态溶出介质中对药物释放过程进行了成像。Jurna et al.11 和 Windbergs et al.12 更进一步，首先对茶碱在脂质制剂中的分布进行了成像，随后在动态溶出介质中对药物溶出过程进行了成像。
我们开发了一种新的分析方法，可利用窄带CARS显微镜同时监测片剂在溶出过程中表面的变化，并通过紫外吸收光谱法记录溶出药物的浓度。我们以茶碱与乙基纤维素组成的模型药物片剂在水中溶出为例，展示了该方法的应用。

<table><tbody><tr><td>Paladin 1,064 nm 激光器</td><td>Coherent</td><td></td><td>原型机，不对外销售</td></tr><tr><td>Levante Emerald 光学参量振荡器</td><td>APE Berlin</td><td></td><td></td></tr><tr><td>IX71 显微镜</td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fluoview 300 扫描单元</td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>光电倍增管 R3896</td><td>Hamamatsu</td><td></td><td></td></tr><tr><td>独立式光学元件 / 滤光片</td><td>Thorlabs 和 Chroma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Reglo 蠕动泵</td><td>ISMATEC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>USB2000+ 光谱仪</td><td>Ocean Optics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DT-MINI-2-GS 光源</td><td>Ocean Optics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FIA-Z-SMA-TEF Z 形流动池</td><td>Ocean Optics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>QP400-2-SR-BX 光纤</td><td>Ocean Optics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>塑料管路</td><td>ISMATEC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CARS 溶解片剂流动池</td><td></td><td></td><td>大学自制——设计用于容纳直径 12 mm、厚度 3 mm 的片剂。流动池通道深度约为 0.5 mm。</td></tr><tr><td>玻璃烧杯</td><td>VWR</td><td>D108980</td><td></td></tr><tr><td>无水茶碱</td><td>BASF</td><td>30058079</td><td></td></tr><tr><td>乙基纤维素</td><td>Colorcon</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

相干反斯托克斯拉曼散射（cars）显微镜在药物片剂溶出过程中实现可视化观察

Coherent anti-Stokes Raman Scattering (CARS) Microscopy Visualizes Pharmaceutical Tablets During Dissolution

传统的药物溶出度测试通过测定溶出介质中的药物含量来确定随时间变化的药物溶出量。该方法无法直接提供关于溶出片剂表面变化过程的信息。由于片剂表面的组成和结构在溶出过程中可能发生改变，因此在溶出测试期间对表面进行实时监测至关重要。本研究采用相干反斯托克斯拉曼散射显微技术，在溶出过程中对片剂表面进行成像，同时利用紫外吸收光谱法对含有50%无水茶碱与乙基纤维素混合物的片剂进行溶出药物浓度的在线分析。实验结果表明 原位 CARS显微镜能够在乙基纤维素存在下选择性成像茶碱。此外，在溶出过程中，无水茶碱转化为一水合茶碱，并在片剂表面生长出针状晶体。无水茶碱向一水合物的转化，结合药物与流动溶出介质接触面积的减少，导致溶出速率降低。我们的结果表明 原位 结合在线紫外吸收光谱的CARS显微技术能够监测药物片剂的溶出过程，并将表面变化与溶出速率的变化相关联。

原位溶解分析采用CARS显微镜对片剂（12 mm直径，平面）进行，片剂含有模型药物无水茶碱与乙基纤维素的50:50混合物，以蒸馏水作为溶出介质，流速为5 ml/min。在整个溶出实验过程中，每1.12秒在拉曼振动频率2,960 cm-1处采集一次CARS图像（512 × 512像素），该频率对片剂中的茶碱成分具有选择性。图2展示了溶出视频中的若干代表性帧。在溶出开始时（图2，0秒），可见显示片剂中茶碱含量的绿色区域，同时也存在深色区域，表明片剂表面仅含有乙基纤维素。在片剂表面的深色区域中，可微弱观察到乙基纤维素的存在。这是因为据报道，乙基纤维素的拉曼振动频率在约2,930和2,975 cm-114处有最大值。约60秒后，表面开始出现一水合茶碱晶体的生长迹象，表现为从画面中心至少一个晶核向外延伸的细长针状晶体（图2，60秒）。130秒后，一水合物晶体的生长更为清晰可见（图2，130秒）。此外，在130秒时间点可见，一水合物晶体并未完全覆盖片剂表面，似乎乙基纤维素区域的存在在物理上阻碍了一水合针状晶体的延伸。250秒后，表面一水合物的覆盖程度减弱，表明一水合茶碱晶体本身可能开始溶解。
<img alt="250秒内蛋白质结晶的时间推移显微镜图像；显微镜分析。" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51847/51847fig2highres.jpg" width="500" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图2"> 
图2. CARS溶解视频中的帧图像。 从无水茶碱与乙基纤维素片剂的溶解视频中选取的CARS图像（2,960 cm-1）。0秒图像采集于样品的某一区域，而60秒、130秒和250秒图像采集于样品的另一区域。该CARS视频作为补充信息提供。比例尺为50 µm。
紫外（UV）光谱法是一种吸收光谱技术，使用紫外光作为激发光源。紫外光谱法用于测量电子从基态到激发态的跃迁15。茶碱在约270 nm处具有一个宽峰，而乙基纤维素在溶出介质中几乎不溶，因此预计不会对记录的紫外光谱产生贡献。利用在线Z形紫外流通池对溶出介质进行分析，可定量测定溶出过程中溶解的药物量。图3展示了茶碱无水物与乙基纤维素片剂的溶出过程中的紫外-溶出曲线。紫外溶出曲线（图3）显示，茶碱无水物的溶出起始迅速，在120秒内即达到约90 µg/mL的最大浓度；此后，溶出速率开始下降。溶出速率的降低可能是由于茶碱一水合物晶体（在25 °C时溶解度为6 mg/mL16）在表面析出所致，该晶体比茶碱无水物（在25 °C时溶解度为12 mg/mL16）更难溶，并且在CARS溶出视频（图2）的相应时间点可明显观察到。溶出速率的逐渐降低也可能部分归因于茶碱暴露于流动介质中的面积减少。这种减少的发生是因为乙基纤维素在水中几乎不溶，随着茶碱的溶解，残留的乙基纤维素会阻碍茶碱与溶出介质的接触。
<img alt="浓度随时间变化的曲线图，显示峰值和衰减，适用于反应动力学分析。" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51847/51847fig3highres.jpg" width="500" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 3"> 
图3. 紫外溶出曲线。 茶碱无水物与乙基纤维素片剂在溶出实验过程中，溶出介质中茶碱浓度随时间变化的曲线图。

相干反斯托克斯拉曼散射（CARS）显微镜与内置流通式溶出装置相结合，以实现 原位 以及对正在溶解的药物片剂表面进行实时可视化。利用这一自行搭建的装置，可将CARS视频与通过在线紫外吸收光谱法记录的药物溶出曲线进行关联分析。

相干反斯托克斯拉曼散射（CARS）显微镜在药物片剂溶出过程中实现可视化观察

传统的药物溶出度测试通过测定溶出介质中的药物含量，来确定随时间变化的药物溶出量。

本实验的总体目标是利用原位共聚焦拉曼（car）溶解分析技术，对正在发生药物溶解的片剂表面进行化学选择性成像。该目标通过以下步骤实现：首先将car的激光系统调节至对片剂中目标化学成分具有选择性的频率，并设置紫外吸收光谱仪以记录光谱；第二步是将一片药片放入car的溶解流动池中，并旋紧封闭。接下来，将汽车的溶出流通池放置在显微镜载物台上，并通过管路将其连接至泵和溶出介质。最后一步是在泵送溶出介质的同时记录汽车溶出过程的视频，并同步采集紫外吸收光谱。最终，通过原位汽车溶出分析表明，溶出过程中表面的变化可以被可视化，并与溶出速率的变化相关联。与现有技术（如药典溶出度方法）相比，该技术的主要优势在于，红外成像溶出分析能够提供关于片剂表面的深入信息，而片剂表面在溶出过程中可能发生改变。首先，打开红外成像仪的激光器和氘灯紫外（UV）光源，并预热一段时间。通过将氘灯紫外光源的快门开关设置为“打开”，开启其快门。接下来，打开显微镜控制计算机并启动显微镜控制软件。打开紫外光谱仪计算机并启动光谱仪控制软件。选择所需的显微镜物镜。设置滤光片转轮中的滤光片，以透射激发激光并反射汽车的信号。在光电倍增管探测器前放置适当的滤光片，以透射汽车的信号并滤除不需要的光。为进行系统测试，启动蠕动泵，使溶出介质通过V形紫外流通池数分钟，以清除管路中残留的先前液体。通过称量泵送两分钟的溶出介质的量来确定泵的流速。调节泵速直至达到所需的流速。在紫外分光光度计控制软件中进行紫外溶出测定，点击文件菜单。然后点击“新建吸光度测量”以打开一个窗口，该窗口会列出所有可用的光谱仪。点击正确的紫外光谱仪，然后点击“下一步”以打开一个显示数据采集参数的窗口。在此定义积分时间和光谱平均次数。单击标有“下一步”的按钮，以调出用于记录参考光谱的界面。单击显示为黄色灯泡的按钮，以连续记录泵送溶出介质的参考光谱。在此测量过程中，通过将开关设置为关闭状态，关闭氘灯紫外光源的快门。单击标有“下一步”的按钮，以调出用于记录暗光谱的界面。单击显示为灰色灯泡图标的按钮，以连续记录暗光谱泵溶解介质。在此测量过程中，单击标有“完成”的按钮，以在 Cars 显微镜控制软件中开始紫外吸收测量，然后单击选择 XYT 测量模式的按钮。单击下拉框并选择以像素为单位的图像尺寸。拖动成像速度滑块至快速、中速或慢速位置。单击标有“缩放”的箭头以调整缩放级别。然后点击下拉框并选择所用的物镜。点击输入框，输入所需拍摄汽车溶解视频的帧数。使用光学参量振荡器（OPO）控制器，调节OPO的设置，例如温度、pazo位置和LEO滤光片位置，直至在目标拉曼频率下达到最大激光输出。将平板放入自制汽车流动池的样品架中，并将样品架拧紧封闭。为防止泄漏，将管路连接至载物台的流通池，再将载物台的流通池与盛有溶出介质的烧杯及蠕动泵相连。将装有药片的载物台流通池放置于显微镜载物台上。检查载物台流通池是否已连接至溶出介质烧杯。蠕动泵、V形紫外流动池和废液收集烧杯。点击XY重复按钮，以启动显微镜系统进入连续扫描模式。通过移动物镜调节显微镜焦距，直至在显微镜控制计算机屏幕上看到药片表面处于视野范围内。点击显微镜控制软件中标记为 PMT 的滑块。通过增加或降低 PMT 电压来调节探测器灵敏度，直至屏幕上显示满意的图像。在显微镜控制软件中点击停止，以同时终止连续扫描。开始泵入溶出介质。开始记录单个XYT扫描并开始收集紫外吸收光谱。在溶出实验过程中，监控视频记录并手动调节显微镜焦距。为确保平板始终处于对焦状态。关闭蠕动泵以停止其运行。在显微镜控制软件中，单击文件菜单，然后单击“另存为视频”，将XYT扫描保存为视频；在光谱仪控制软件中，单击文件菜单中的保存，然后单击停止导出。为停止收集紫外吸收光谱，需将流动池从显微镜载物台上取下，并将药片从流动池中取出。最后一步是用水和乙醇清洗流动池，然后用纸巾擦干。此处展示的是药片溶解开始阶段溶解视频中的部分帧图像。图中绿色区域显示了茶碱在片剂中的分布情况。深色区域表示片剂表面仅存在乙基纤维素。约60秒后，可观察到一水茶碱晶体开始在片剂表面生长，表现为从画面中心至少一个晶核处向外延伸的细长针状晶体。130 秒后可以明显观察到一水合物晶体的生长。此时，一水合物晶体尚未完全扩散至片剂表面。乙基纤维素区域的存在可能会在物理上阻碍一水合物针状晶体的延伸。250 秒后，可以观察到一水合物在表面的覆盖程度已不再显著，表明一水合物晶体开始溶解。茶碱无水物与乙基纤维素片剂的紫外溶出曲线显示，茶碱无水物的溶出在 120 秒内迅速达到约 90 微克/毫升的最大浓度。此后，溶出速率开始下降。观看本视频后，您应能够充分理解如何使用共聚焦显微镜进行原位溶出分析。该技术通过使用化学选择性成像监测溶解片剂的表面，从而加深对溶解过程的理解。

coherent-anti-stokes-raman-scattering-cars-microscopy-visualizes

Research

科研

JoVE Journal

Engineering

工程

相干反斯托克斯拉曼散射（CARS）显微可视化药片剂溶出过程中

采用三种单波长短脉冲激光的组合来产生相干反斯托克斯拉曼散射（CARS）和双共振CARS（DR-CARS）。这两种信号的差异可显著增强原本难以检测的相干拉曼信号的灵敏度，从而实现对弱拉曼散射体的成像。...

双共振相干反斯托克斯拉曼散射（CARS）对生物结构的差异成像

来源：Zhang, M. 等，通过受激拉曼散射成像检测单个细菌中氘掺入实现快速抗菌药物敏感性测试。J. Vis. Exp.

使用受激拉曼散射显微镜检测细菌对抗生素的敏感性

来源：McCullagh, E. A., 等。相干反斯托克斯拉曼光谱（CARS）在脑切片髓鞘成像中的应用。J. Vis. Exp.

利用相干反斯托克斯拉曼光谱成像小鼠脑组织中的髓鞘化神经元

基于分子键固有振动的相干反斯托克斯拉曼散射（CARS）显微技术，能够实现无需标记的化学选择性活细胞成像。本文介绍了在基于飞秒钛宝石激光器和OPO激光器的标准多光子激光扫描显微镜上，实现一种互补显微技术的方法。...

在基于钛宝石和光参量振荡器激光器的标准激光扫描显微镜上实现相干反斯托克斯拉曼散射（CARS）系统

受激拉曼散射（SRS）显微技术能够实现对特定化学基团的选择性、无标记成像，已被有效用于体内脂质分子的成像。本文简要介绍SRS显微技术的原理，并描述其在秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis...

无需标记的脂质储存动态成像：利用受激拉曼散射显微镜对秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）的研究

本方案通过单细胞刺激拉曼散射成像检测D2O代谢，可在2.5小时内完成快速抗菌药物敏感性试验（AST）。该方法适用于尿液或全血环境中的细菌，对临床快速单细胞表型抗菌药物敏感性试验具有变革意义。...

基于单个细菌中氘掺入的受激拉曼散射成像的快速抗菌药物敏感性测试

本文介绍了一种相干拉曼散射成像方法，用于可视化并定量皮肤中的药物化合物。文中描述了皮肤组织（人和小鼠）的制备及外用制剂的应用，图像采集以定量分析药物在空间和时间上的浓度分布，以及初步的药代动力学分析，以评估外用药物的递送效果。...

利用相干拉曼散射成像技术对皮肤内药物化合物进行可视化与定量分析

本文直接比较了集成在同一显微镜平台上的受激拉曼散射（SRS）和相干反斯托克斯拉曼散射（CARS）在分辨率、灵敏度和成像对比度方面的性能。结果表明，CARS 具有更高的空间分辨率，SRS...

高光谱受激拉曼散射与相干反斯托克斯拉曼散射显微成像在化学成像中的直接比较

我们提出了一种利用宽带受激拉曼散射（SRS）显微技术获取化学图像的实验方案。该方案基于采用多通道差分锁相检测的SRS显微镜，详细描述了样品制备、SRS仪器调节以及化学计量学方法，用于解析化学非均质样品中不同组分的成分信息。...

基于宽带受激拉曼散射显微技术的多重化学成像

可视化髓鞘化是许多研究神经系统研究人员的重要目标。CARS...

相干反斯托克斯拉曼光谱（CARS）在脑切片髓鞘成像中的应用

了解相干反斯托克斯拉曼散射显微技术用于实时可视化药片溶出过程的方法。该技术结合紫外吸收光谱，可观察茶碱晶体生长并关联溶出速率变化，为药物制剂优化提供实时数据支持。

相干反斯托克斯拉曼散射（CARS）显微镜在药物片剂溶出过程中实现可视化观察

探索更多视频