结合母细胞磁性分选与波动试验分析有丝分裂细胞衰老过程中 Saccharomyces cerevisiae 的基因组不稳定性

以下实验的总体目标是确定酵母细胞复制性年龄增加时突变频率的变化，究竟是单纯由于细胞分裂次数的增加所致，还是由于细胞年龄特异性地改变了突变累积速率所引起。为此，首先通过将细胞涂布于选择性与非选择性培养基上，测定年轻细胞的突变频率和突变速率，从而计算出在每一轮细胞分裂过程中突变逐步累积所导致的、随年龄增长而预期达到的突变频率。

接下来，将酵母细胞群体在液体培养基中用生物素标记，并通过磁性分选回收初始标记的细胞，以获得经历多次细胞分裂的老化母细胞。随后，将老化母细胞重新培养以进一步增加其年龄，再进行分选，或对其进行芽痕染色，然后将其涂布于选择性与非选择性培养基上，以测定其平均复制年龄和突变频率。通过将实验观察到的突变频率与相应平均年龄细胞的预测突变频率进行比较，可得出突变积累是否存在年龄特异性的增加或减少。该方法有助于回答衰老研究领域中的关键问题，例如：遗传损伤积累速率的变化是否参与了正常衰老过程，或各种遗传与环境因素对寿命的影响是否部分归因于突变率的改变。

进行该实验操作的是我实验室的研究生 Melissa Patterson。通过在标准培养条件下进行的波动试验，确定每细胞传代的基准突变率。对于每个重复培养物，将细胞按1:2000稀释，并取1至4微升涂布于非选择性培养基上，以测定每毫升的菌落形成单位数。将剩余细胞在微量离心机中以2,400 ×g离心1分钟收集沉淀，加入100微升水重悬细胞，随后涂布于选择性培养基上以鉴定突变体。

在30摄氏度下孵育平板三天后，计数菌落，根据随附的文字方案确定初始突变率和突变频率。为用生物素标记charmy CCI，首先将甘油保存菌种划线接种至YPD培养基，并在30摄氏度下孵育一至三天。使用无菌移液器吸头将菌落中的细胞转移至至少一毫升水中。需注意，取生长密集区域约一至一点五厘米长的菌苔，可获得约10的8次方个细胞。

使用血细胞计数板确定每种菌株或处理条件下细胞的精确密度。使用5毫摩尔的生物素试剂储备液，按照制造商的标准操作流程，对每个收集点的10的8次方个细胞进行标记。在最后一次洗涤后，所有离心步骤均在4摄氏度下进行，持续5分钟。

使用水将标记的细胞重悬，使其最终浓度为每毫升10的8次方个细胞，以检测细胞活力。取10微升细胞与23微升水和67微升0.4%台盼蓝混合，在XPBS中于室温孵育40分钟，然后使用血细胞计数板对活细胞（未染色）和死细胞（染色）进行计数。根据文本方案，在测定细胞年龄和突变频率的基础值后，将生物素标记的细胞转移至20毫升YPD培养基中。假定为10的8次方个细胞。

在20摄氏度下培养菌液16至18小时，使细胞密度达到约每毫升10的8次方个细胞。切勿让细胞进入稳定期；如有必要，可将细胞在4摄氏度下保存数小时，以优化生长期和收集时间。测定细胞密度后，在4摄氏度下离心收集细胞，加入30毫升珠标记缓冲液，涡旋混匀，然后离心悬浮液并弃去上清液。

第二次洗涤后，将细胞重悬于50 µL磁珠标记缓冲液中。涡旋振荡以充分混匀全部8个细胞。加入2 µL磁珠，再次涡旋振荡混匀全部8个细胞，短暂孵育于冰上10分钟，期间定期颠倒混匀。

接下来，用 30 毫升珠标记缓冲液洗涤细胞三次。然后加入 0.5 毫升珠标记缓冲液。按每 8 个总细胞计，将细胞沉淀在中等速度下短暂涡旋，直至细胞完全重悬。

将悬浮液通过40微米细胞筛网过滤至50毫升离心管中，以去除任何残留的细胞团块。如有需要，可在上柱前将细胞置于冰上孵育1至2小时。使用磁性柱时，请遵循制造商推荐的操作步骤，每柱最多可上样2×10⁹个总细胞。

加样至层析柱时需注意去除任何气泡，并在每次洗涤之间将层析柱从分离器上取下并重新安装，以防止细胞被困在磁珠之间。当使用多柱分离器处理同一样本的多个层析柱时，可根据需要将所有洗脱液收集至同一收集管中，以减少操作时间并降低细胞损失。保存结合和洗涤步骤中的流穿液，用于分析母细胞产生的子代细胞；将细胞在4°C条件下以3000 ×g离心5分钟浓缩后，吸除除1毫升以外的所有缓冲液。

对八种原始的生物素标记细胞进行处理。然后短暂涡旋，使细胞悬浮于剩余缓冲液中。取一部分稀释后的细胞，用台盼蓝染色，并使用血细胞计数板测定细胞密度和活力。

然后计算回收的细胞总数。如果细胞数量显著高于预期，可将洗脱样品再次通过另一根柱子，以尝试去除污染的年轻细胞。如果细胞数量显著低于预期，则将之前保存的流穿液通过柱子。

如有需要，可将样品再次通过另一根柱子，以尝试提高母细胞的得率。重新培养细胞以增加其复制年龄，并进行珠标记和分选，但无需进行生物素标记。为确定复制年龄，取25 µL回收的细胞加入1.5 mL离心管中，用1 mL 1×PBS洗涤细胞两次，以标记细胞表面的出芽瘢痕。

使用 180 微升 1×PBS 和 20 微升荧光标记的 WGA 重悬细胞，用锡箔纸包裹 1.5 毫升离心管，在 30 摄氏度下轻轻摇动孵育 30 分钟。孵育结束后，用 1×PBS 洗涤细胞三次。随后进行荧光显微镜观察时，使用抗荧光淬灭剂将细胞封片于载玻片上，以避免成像过程中细胞移动。

将载玻片在避光条件下完全固化，持续数天。每份样品至少统计 50 个细胞的出芽痕，以获得具有代表性的细胞年龄测量结果。或者，在将细胞重悬于一份 XPBS 后，根据文本方案中所述的设置进行流式细胞术分析，以横轴表示相同细胞群体中 WGA 偶联物荧光的归一化几何平均值，纵轴表示通过显微镜计数得到的年轻细胞和年老细胞的出芽痕数量。

最后，获得该关系的线性趋势线方程。在后续计算中，将细胞群体WGA偶联物荧光强度的归一化几何平均值代入方程中的X，求解Y以确定样本的平均细胞年龄。该图显示，can1基因的突变率在生物素标记前后相似。在独立的年轻酵母群体中，当细胞在20摄氏度或30摄氏度下培养时，年轻细胞在生物素标记前后的can1突变频率也相似。此处所示的图展示了在第一次分选后，对未经处理的细胞或经1毫摩尔过氧化氢处理的细胞进行生物素标记并分选后，计数回收细胞时可能观察到的结果。

首次分选后，细胞数量可能高于预期，随着持续分选，细胞数量会逐渐少量减少。复制年龄通过手动计数荧光标记的细胞芽痕来确定，如本图所示。将流式细胞术检测到的荧光芽痕信号与手动计数结果进行比较，获得线性关系，从而可通过流式细胞术确定母细胞和对照细胞群体的复制年龄。

这些图表展示了与年轻细胞群体的突变频率和速率以及母细胞平均年龄计算出的预测频率相比，老年母细胞观察到的突变频率相似或升高的示例。根据 can1 基因的基因组位置，可按照此流程进行操作。也可采用其他方法，例如活性氧物种染色或细胞形态学观察，以回答其他问题，例如细胞生理学的哪些变化与年龄相关的突变累积变化相关。