结合母细胞和波动测试磁分选，以分析基因组不稳定性的过程中有丝分裂细胞衰老酿酒酵母

以下实验的总体目标是确定突变频率的变化是否随着复制性的增加而增加。酵母细胞的年龄仅仅是由于额外的细胞分裂轮次或突变积累速率的年龄特异性变化。这是通过首先测量年轻细胞中的突变频率和速率来实现的，方法是将细胞扩散到选择性和非选择性培养基上，以计算由于每轮细胞分裂的突变积累而增加的细胞的预测突变频率。

接下来，用液体培养物中生长的生物素标记酵母细胞群，并通过磁选回收原始标记的细胞，以获得经过多次细胞分裂的老年母细胞。然后，老化的母细胞要么重新生长以增加其年龄，然后再次分选或染色以获得臀部疤痕，然后扩散到选择性和非选择性培养基上，以确定它们的平均复制年龄和突变频率，获得结果，根据实验观察到的突变频率与预测突变频率的比较，显示积累突变是否存在任何年龄特异性的增加或减少观察到的平均年龄。这种方法可以帮助回答衰老领域的关键问题，例如遗传损伤积累速率的变化是否会导致正常衰老，或者各种遗传和环境因素的寿命改变影响是否部分是由于突变率的变化。

演示该程序的是我实验室的研究生 Melissa Patterson，使用在标准培养条件下生长的细胞的波动测试来确定每代细胞的基线突变率。对于每个重复培养物，将细胞稀释 1 到 2000 个，并将 1 到 4 微升涂抹在非选择性培养基上，以确定每毫升的菌落形成单位。在微量离心机中以 2， 400 G 的浓度沉淀剩余的细胞 1 分钟，并使用 100 μL 水重悬，然后铺展到选择性培养基上以鉴定突变体。

将板在 30 摄氏度下孵育三天后，根据随附的文本方案对菌落进行计数，以确定初始突变率和频率，以用生物素标记 CCI 首先将甘油原液中的培养物划线到 YPD 培养基上，并在 30 摄氏度下孵育一到三天。使用无菌移液器吸头将细胞从板中转移至至少 1 毫升水中。请记住，条纹的一到一厘米半厚实部分将使八个细胞大约有 10 个。

使用血细胞仪确定每种菌株或治疗条件的确切细胞密度。根据制造商的标准程序，使用 5 毫摩尔生物素试剂原液标记每个收集点 8 个细胞的 10 个细胞。最后一次洗涤后，在 4 摄氏度下执行所有离心步骤 5 分钟。

用水将标记的细胞悬浮至每毫升 10 至 8 个细胞的最终浓度，以检查细胞活力，在一个 XPBS 中用 23 微升水和 67 微升 0.4% 三胺蓝稀释 10 微升细胞，在室温下孵育细胞 40 分钟，然后使用血细胞计数器对活细胞或未染色细胞以及死细胞或染色细胞进行评分。在测量细胞年龄和突变频率的基线值后，根据文本方案，将生物素标记的细胞转移到 20 毫升 YPD 培养基中。假装八个牢房。

在 20 摄氏度下培养培养物 16 至 18 小时，至每毫升约 10 至 8 个细胞。不要让细胞达到固定期，如有必要，将细胞在 4 摄氏度下保持数小时，以优化生长期和收集的时间。确定细胞密度并在 4 摄氏度下沉淀细胞后，通过加入 30 毫升珠子标记、缓冲液和涡旋来洗涤细胞，然后旋转悬浮液并倒出上清液。

第二次洗涤后，我们将细胞悬浮在 50 μL 微珠标记缓冲液中。通过涡旋假装八个总细胞。加入 2 μL 磁珠，假装总共 8 个细胞，涡旋后在冰上短暂孵育 10 分钟，定期倒置。

接下来，使用 30 毫升磁珠标记缓冲液洗涤细胞 3 次。然后加入 0.5 毫升的微珠标记缓冲液。假装八个总细胞，并在培养基设置下短暂涡旋沉淀，直到细胞重悬。

将悬浮液通过 40 微米细胞过滤器倒入 50 毫升试管中，以去除任何残留的细胞团块。如果需要，在上样到色谱柱上之前，将细胞置于冰上 1 到 2 小时。遵循制造商推荐的磁柱方案，每次使用最多 2 个细胞的 10 到 9 个总细胞。

加载色谱柱时注意去除任何可通风物，并在两次洗涤之间取出并更换分离器上的色谱柱，以防止细胞被困在磁珠之间。当使用多柱分离器处理同一样品的多柱时，如果需要，请将它们全部洗脱到同一收集管中，以减少处理时间并减少细胞损失。通过在 4 摄氏度下以 3000 Gs 离心 5 分钟浓缩细胞，吸出除 1 mL 缓冲液外的所有缓冲液，节省结合和洗涤步骤的流出物，以分析母细胞产生的年轻细胞。

假装 8 个原始生物素标记的细胞。然后短暂涡旋以将细胞悬浮在剩余的缓冲液中。使用 Triam Blue 对等分试样的稀释细胞进行染色，并使用血细胞计数器测定细胞密度和活力。

然后计算回收的细胞总数。如果细胞数量明显高于预期，则将洗脱样品通过另一根色谱柱，尝试去除污染的年轻细胞。如果单元格数明显低于预期，则传递保存的流。

如果需要，通过另一根色谱柱进行采样，以尝试提高母细胞的产量。重新生长细胞以增加复制年龄，并在没有生物素标记的情况下遵循珠子标记和分选。为了确定复制年龄，将 25 微升回收的细胞转移到 1.5 毫升离心管中，并使用 1 毫升 1 XPBS 洗涤细胞两次，以标记细胞表面的芽痕。

使用 180 μL 的 One XPBS 和 20 μL 荧光偶联的 WGA 重悬细胞，用箔纸覆盖 1.5 mL离心管，并在孵育后在 30 摄氏度下轻轻摇动孵育 30 分钟。使用一个 XPBS 洗涤细胞 3 次。然后对于荧光显微镜检查，使用 Antifa 试剂将细胞安装在载玻片上，以避免细胞在成像过程中移动。

载玻片在黑暗中完全固化长达几天。对每个样品至少 50 个细胞的芽疤痕进行计数，以获得细胞年龄的代表性测量值。或者，将细胞悬浮在一个 XPBS 中后，使用文本协议中概述的设置进行流式细胞术，在 Y 轴上通过显微镜计数年轻细胞和老年细胞上的芽疤痕，对照 WGA 共轭物荧光的标准化几何平均值在 x 轴上。

最后，获得此关系的线性趋势线方程 对于后续的替代，WGA 的标准化几何平均值 WGA 共轭荧光强度在方程中 X 并求解 Y 以确定样品的平均细胞年龄。该图表明，生物素标记前后 can one 基因的突变率相似 在独立的年轻酵母种群中，当在 20 摄氏度或 30 摄氏度下生长时，生物素标记前后年轻细胞的突变频率也相似。此处显示的图表显示了在生物素标记后对回收的细胞进行计数，并对未处理的细胞或在第一次分选后用 1 毫摩尔过氧化氢处理的细胞进行分选时可能观察到的情况。

第一次排序后，单元格数可能高于预期，并且继续排序后，预计单元格会略有进行性损失。复制年龄是通过手动计数荧光标记的来确定的，但如图所示，细胞上的疤痕如此处所示。将流式细胞术的荧光但瘢痕信号与手动计数进行比较，以获得线性关系，从而允许通过流式细胞术确定母细胞群和对照细胞群的复制年龄。

这些图表显示了与根据母细胞的平均年龄以及为年轻细胞群获得的突变频率和速率计算的预测频率相比，观察到的老年母细胞突变频率相似或升高的示例。根据基因组位置的 can one 基因 遵循此程序。可以使用其他方法，如活性氧或细胞形态染色，以回答其他问题，例如细胞生理学的哪些变化与年龄相关的突变积累变化有关。