新生小鼠脑侧脑室注射病毒的持续和广泛的神经元传导

该程序的总体目标是在整个大脑中病毒转导神经元。这是通过对新生儿幼崽进行冷冻麻醉，然后将新生儿转移到冷却阶段进行注射来实现的。接下来，确定针对 Lambda 缝合线和每只眼睛之间的侧脑室或 Lambda 和 Bgma 之间中间矢状缝线的侧脑室的注射部位。

最后一步是将针头插入正确的深度，然后缓慢地将最多 2 微升的病毒溶液注入每个半球的侧脑室。最终，使用目标基因的荧光标签或免疫荧光来显示脑室内注射产生的转基因表达模式。一般来说，刚接触这项技术的人会很难准确定位侧脑室。

这项技术通过徒手颅内注射和立体定向注射来演示，证明徒手技术将成为我实验室的另一个博士后。首先，为一般产后第 0 天新生儿准备一个 10 微升注射注射器，带有 32 号针头。然后将一个小铝板放在冰上冷却，并在板顶部放一块干燥的任务擦，以保护幼犬皮肤免受冰冷金属的伤害。

这用作麻醉和注射幼崽的平坦冷表面。接下来，准备一个适合在注射前后保持新生小鼠温暖的加热垫。一旦新生幼崽开始吃奶，就从笼子中取出大约一半，将另一半留给母亲。

将收集的幼崽放在加热垫上，同时等待注射。将一只幼犬从加热垫转移到冰冷的金属板上以诱导体温过低。麻醉。等待两到三分钟，让幼犬完全麻醉。

通过非常轻柔地挤压爪子来确认麻醉，并免费监测是否有运动或呼吸。手颅内注射将 5 μL 稀释的腺相关病毒或含有 0.05% Trian 蓝的 A V 注入注射注射器中。用浸泡在 70% 乙醇中的棉签轻轻擦拭麻醉幼犬的头部。

确定从 lambda 缝合线到每只眼睛的五分之二距离处的注射部位，替代注射部位位于 Lambda 和 Bgma 之间矢状缝线的外侧约 0.8 至 1 毫米处。这些标志在出生后第 0 天通过皮肤可见。用无毒的实验室笔标记注射部位。

握住注射器，让可见的刻度监测分配的溶液量。确保拇指可以到达柱塞的顶部。然后在定位针头时从柱塞上取下拇指。

为避免意外喷出病毒，请将幼犬侧放，头部直接位于注射器下方。转动 P'S 头部，使标记的注射部位朝上，轻柔而牢固。张开手保持这个位置。

将注射器垂直于颅骨表面，并将针头插入标记的注射部位，深度约为 3 毫米。注射针头直到阻力略微降低，表明针头已穿透侧脑室。开始缓慢注射病毒，同时监测从注射器分配的体积。

心室注射最大 2 微升的剂量。慢慢抽出针头。在注射另一个半球之前，让第一个注射部位关闭。

如果针头位于正确的位置，染料将扩散以充满心室。通过向储液器中添加 100% 乙醇和干冰，将新生儿阶段冷却至 4 到 8 摄氏度之间。在块锁的前端。

将温度保持在 1 摄氏度以上，以免幼崽冻伤。将 5 微升稀释的 A a V 和 0.05% trian 蓝装入立体定位纵器固定的注射注射器中。稍后，轻轻地将幼犬的头部放在新生儿框架的耳杆之间。

通过检查 lambda 和 Bgma 之间的线是否与载物台平行，确保头部在 Y 轴上处于水平状态。通过检查耳朵之间想象的线或眼睛之间的线是否与载物台平行，确保头部在 x 轴上水平。用浸泡在 70% 乙醇中的棉签轻轻擦拭麻醉幼犬的头部。

然后使用立体定位机械手将注射器定位在 Lambda 和 0 上方。x 和 Y 坐标。将立体定位臂移动到 lambda 缝合线或标准出生后第 0 天幼崽外侧 0.8 毫米和前方 1.5 毫米的位置，缓慢地将针头放入注射部位。

颅骨表面会凹陷，然后松开。针头穿透皮肤后，缩回针头，直到颅骨恢复正常的凹形，但将针头在皮肤下的斜面保持在零。此时的 Z 坐标。

插入针头，直到 Z 等于负 1.7 毫米，然后缩回至负 1.5 毫米。慢慢注射病毒。每个半球最多可容纳 2 微升溶液。

完成注射后，将注射器保持在原位 30 到 60 秒，然后在 1 到 2 分钟内慢慢缩回针头。对对侧半球使用注射部位 x 轴上的负坐标重复此作。完成对两个半球的注射后，将幼犬放回保温垫上，直到其体温和肤色恢复正常并且幼犬开始移动。

接下来，将剩余的注射的 unin 幼崽移到加热垫上，并在注射的幼崽恢复正常运动后将其放回笼子。重复该过程，直到注射完所有小鼠。成功的脑室内病毒注射产生广泛而稳健的成果。

将神经元表达、YFP 或 TD 番茄荧光基因构建体包装到 a V 8 中，注射到新生小鼠的侧脑室中。高病毒滴度导致嗅球、纹状体、大脑皮层、海马体和小脑的密集标记。标记在小脑浦肯野神经元中也很明显，但在小脑颗粒神经元中明显缺失，在出生后第 0 天注射较少的病毒颗粒时尚未大量存在，导致标记稀疏和表达强度较低。

在 10 到 7 和 10 到 10 之间的浓度范围内使用 AA V 8 是控制注射产生的转基因嵌合度的一种简单可靠的方法。多个转基因可以通过共同注射两种或多种病毒来表达。将包装成相同血清型的两种病毒共同注射，使所得转导偏向于重叠的神经元群，因此许多细胞以较低浓度表达两种转基因。

表达模式变得更加独立，共标记细胞的百分比降低。也可以通过注射不同的 a a v 血清型同时注射 AAV 1 和 AAV 8 来实现非重叠表达。编码不同的荧光报告基因一旦掌握，就会产生一个在很大程度上独立的双重嵌合体模式。

如果作得当，每个新生儿可以在 5 到 10 分钟内完成这项技术。