利用高密度功能性蛋白质微阵列检测蛋白质-蛋白质相互作用

本实验的核心目标是以平行且无偏倚的方式，在特定蛋白质组中鉴定蛋白质及其相互作用，而这是其他技术无法实现的。该目标通过以下步骤实现：首先将带有表位标签的目的蛋白与一个高度纯化、全长且具有功能的蛋白质文库进行杂交，该文库以坐标阵列形式固定在显微镜载玻片表面。当目的蛋白与芯片上相应的靶蛋白达到结合平衡后，洗去未结合的蛋白组分，然后使用标准的微阵列扫描仪，通过针对表位标签的荧光标记单克隆抗体来检测蛋白质间的相互作用。

所得图像包含了每个特征点相对于结合蛋白和荧光信号强度的信息。借助微阵列分析软件，可将这些信息外推，生成阵列上每个特征点的强度值列表。有关蛋白质-蛋白质相互作用配对的信息可导出至下游生物信息学分析软件，用于对特征特异性数据进行评分，并鉴定目标蛋白质与微阵列上各蛋白质之间的蛋白质-蛋白质相互作用。

通过两个或更多蛋白质微阵列整合原始信号强度数据，以消除实验间和实验内的变异影响，并对数据进行标准化处理，从而对每种相互作用进行评分。最终输出结果生成一个相互作用蛋白质的目标列表，可用于指导对蛋白质-蛋白质相互作用的进一步研究。体内功能蛋白质微阵列由Michael Snyder实验室在15年多前开发而成。

自那时以来，由于该技术具有多功能性以及适用于生物化学蛋白质组学分析，已得到许多成功的应用。该技术有助于研究蛋白质相互作用和模块化信号网络，以及替代性连接关系和已知的信号级联通路。要培养和纯化V五融合激酶探针，请使用含有V五融合蛋白的 freshly streaked 酵母菌株 Y 2 58，在含尿嘧啶的合成完全培养基（2%葡萄糖琼脂平板）上于30°C培养三天（从冷冻保存的菌种开始）。挑取单菌落接种至起始培养液中，在含尿嘧啶的合成完全培养基中过夜培养。

在30摄氏度的摇床或旋转平台上培养含2%葡萄糖的培养基。次日，接种400毫升含2%棉子糖的合成完全尿嘧啶培养基，加入适量的种子培养物，使600纳米处的最终光密度（OD 600）达到0.1。

将接种物培养至 OD 600 为 0.6，然后通过加入足量的三倍酵母提取物-胰蛋白胨培养基（补充 6% 半乳糖）诱导 V 五激酶融合构建物的表达，使诱导培养基稀释三倍，或终浓度为 2% 半乳糖。在 30 摄氏度下于摇床中诱导细胞 6 小时。使用 2 升锥形瓶以确保充分通气。

将400毫升细胞悬液在4°C下以1000 × g离心5分钟收集细胞。用50毫升预冷的PBS缓冲液洗涤细胞一次，并转移至50毫升锥形管中。再次用预冷的磷酸盐缓冲盐水或A PBS缓冲液洗涤细胞沉淀，并将沉淀转移至2毫升的扣盖管中进行裂解。

在4°C条件下，以20,000 × g离心细胞1分钟，用移液器吸除上清缓冲液，将离心管置于冰上。使用0.5毫米氧化锆珠进行细胞裂解，裂解体系中细胞沉淀、珠子与PBS裂解缓冲液的体积比为1:1:1。随后，在4°C条件下，使用振荡仪对混合物进行涡旋振荡，共进行3次，每次2分钟。

在4°C条件下，使用台式微量离心机以20,000 × g离心裂解液10分钟。将澄清的裂解液转移至含有约100 µL预洗镍亲和树脂的离心管中，在4°C下轻轻摇动孵育2小时。为捕获带有组氨酸六聚体标记的V5融合蛋白，使用台式离心机在1000 × g和4°C条件下离心5分钟，使树脂沉淀，随后弃去上清液。

在突变仪上，用洗涤缓冲液在 4 摄氏度下洗涤树脂 10 分钟。更换新鲜的洗涤缓冲液，重复洗涤两次。用两份 100 微升的 200 毫摩尔 ole 溶液洗脱蛋白质。

向样品中加入甘油，使其终浓度为30%，然后在负80摄氏度保存，直至用于检测。为检测相互作用，将V5-FITC偶联抗体用探针缓冲液稀释至260纳克/毫升，并通过振荡充分混匀。

然后将V五融合蛋白探针稀释至5至500微克/毫升的浓度范围。接下来，将蛋白质微阵列从冷冻保存状态取出，并在使用前置于冰箱中4摄氏度环境平衡。直接将封闭缓冲液加入含有蛋白质微阵列的载片架中，并用帕拉膜封盖顶部以防止液体泄漏。

在4°C条件下，于摇床上以50转/分钟的速度用封闭缓冲液封闭芯片一小时。封闭结束后，将芯片转移至预冷至4°C的湿盒中，并直接向芯片表面加入90微升稀释后的探针。用抬升式盖玻片覆盖芯片，于4°C湿盒中静置孵育一个半小时。孵育完成后，将芯片放入含有足量预冷探针缓冲液的50毫升锥形管中，确保缓冲液完全浸没芯片，使抬升式盖玻片轻轻脱落，从而从蛋白微阵列上分离。

将芯片在三个锥形管中分别清洗三次，每次一分钟。完成清洗后，立即将抗体溶液直接加到芯片上，并覆盖已擦除的 lifter slip。同前，将芯片置于加湿孵育盒中，在4°C下孵育30分钟。

重复之前的洗涤步骤，并在台式离心机中以800 ×g在15毫升锥形管中离心5分钟。在室温下，将芯片置于载片架中避光空气干燥30分钟，然后在647纳米波长下扫描芯片。本实验中，研究了TDA one V five的结合活性。

将约4,200种全长GST融合蛋白以重复点样方式制备的酵母蛋白质微阵列，分别与空载体对照或TDA1-V5探针孵育。插图面板比较了两个阵列中的相同区域。值得注意的是RIM11，有趣的是，在此前已发表的一项研究中，RIM11也被鉴定为TDA1的磷酸化靶标。

一旦确定了靶标，就可以在体内对其进行生物化学和功能活性的检测。如果您正在观看本视频，您应该能够更好地理解如何利用功能性蛋白质微阵列来鉴定候选的蛋白质-蛋白质相互作用，以便进一步进行体内验证和研究。