Name: 探讨高密度功能蛋白微阵列来检测蛋白质 - 蛋白质相互作用 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-08-02T12:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 7 s
Description: 探索高密度功能蛋白微阵列技术，用于无偏倚地检测蛋白质-蛋白质相互作用。该方法利用全长功能蛋白库和荧光标记抗体，实现高通量筛选和生物信息学分析，为研究细胞信号网络提供可靠平台。

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本工作由美国国立卫生研究院（NIH）的资助支持。图1所示的实验由Joseph Fasolo博士完成。我们感谢Rui Chen博士提出的有益评论。

1. 探针制备
<ol>
	<li>培养并纯化用于检测与其他蛋白质相互作用的V5融合激酶探针，步骤如下：
	<ol>
		<li>使用新鲜划线的酵母菌株 Y258 (MATa pep4-3, his4-580, ura3-53, leu2-3,112)，该菌株含有 V5 融合蛋白（由 GATEWAY 载体 pYES-DEST52 表达）。将分离的蛋白用作微阵列的探针。将酵母接种于合成完全型-尿嘧啶（Sc-Ura）/2%葡萄糖/琼脂平板上，在 30 °C 培养。&#160;从冷冻培养物（-80 °C 甘油菌种）复苏培养3天。</li>
		<li>从单菌落接种起始培养物（5–20 ml），在Sc-Ura/2%葡萄糖培养基中，于30 °C在摇床（220–250 rpm）或旋转仪上过夜培养。</li>
		<li>次日早晨，接种400 ml&#160;Sc-Ura/2% 棉子糖培养液中加入足量的起始培养物，使终末OD600 0.1 的</li>
		<li>将接种物培养至OD600 0.6，随后通过加入3x溶液进行半乳糖诱导，表达V5-激酶融合构建体&#160;添加足量的6%半乳糖至酵母提取物/蛋白胨（YEP）培养基中，使诱导培养基稀释3倍，最终半乳糖浓度为2%。</li>
		<li>在30 °C条件下诱导细胞6小时&#160;在摇床上。使用 2 L&#160;锥形瓶，以确保适当的通气。</li>
		<li>使用JA-10（或相当型号）转子离心400 ml收集细胞&#160;在4 °C下以1,000 × g离心5分钟，收集细胞悬液。</li>
		<li>用50 ml洗涤细胞一次&#160;冰冷的PBS缓冲液&#160;并转移至 50 ml&#160;锥形管。用冰预冷的裂解用PBS缓冲液（不含去污剂或其他添加剂）再次洗涤沉淀，转移至2 ml&#160;用于裂解的带盖离心管</li>
		<li>在 4 °C 条件下以 20,000 x g 离心 1 分钟，使细胞沉淀，用移液器吸除上清缓冲液。</li>
		<li>将试管置于冰上，并进行裂解步骤。</li>
		<li>使用0.5 mm氧化锆珠，在细胞沉淀、珠子与磷酸盐缓冲液（PBS）裂解缓冲液按1:1:1体积混合的条件下裂解细胞（250–350 µl沉淀），并在4 °C下使用振荡平台以2分钟间隔涡旋振荡混合物3次。</li>
		<li>在4 °C条件下，使用台式微量离心机以20,000 x g离心裂解液10分钟。</li>
		<li>将上清液用移液器转移至聚碳酸酯高速离心管中，在4 °C、150,000 × g条件下超速离心30分钟以澄清。</li>
		<li>将澄清的裂解液转移至含有预洗涤Ni的离心管中2+ 亲和树脂（约100 µl），在旋转摇床中孵育2小时&#160;在 4 °C 下孵育以捕获带有六次组氨酸（His）标签的 V5 融合蛋白。</li>
		<li>用10分钟时间洗涤树脂三次&#160;在 4 °C 下用洗涤缓冲液洗涤。使用台式离心机在 4 °C、1,000 × g 条件下离心 5 分钟，使树脂沉淀，然后吸去上清液。每次洗涤均加入新鲜洗涤缓冲液，并将离心管放回旋转混合仪中进行洗涤时的振荡。</li>
		<li>洗涤步骤完成后，将洗涤后的树脂上样至新的G-25柱中进行洗脱。</li>
		<li>以100 mM咪唑开始，以50 mM为增量逐步增加至500 mM咪唑，共9个梯度，每个梯度加入25 µl洗脱缓冲液。</li>
		<li>使用十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）和考马斯亮蓝染色分析收集的组分，以确定富集程度最高的组分用于后续检测，并加入甘油至终浓度30%，于-80 °C保存&#160;直至用于检测。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 探测阵列
注意：在开始检测之前，请参见本节步骤 2.6 以配制抗体溶液。
<ol>
	<li>为了检测相互作用，稀释V5-荧光染料偶联抗体（即 AlexaFluor 647 至 260 ng/ml&#160;在探针缓冲液中充分振荡混匀。 
	注意：在30分钟前配制此抗体溶液&#160;使用前将试管置于振荡器或滚轴混合仪上，以确保抗体充分混合并形成均匀的悬浮液。</li>
	<li>将V5融合蛋白探针稀释至5–500 μg/ml的浓度范围。 
	注意：针对每种蛋白质-蛋白质相互作用检测，使用探针缓冲液进行优化。优化过程包括向探针缓冲液中添加更多探针。通常以10 µg/ml为起始浓度，根据信号强度相应调整。</li>
	<li>从−20 °C冰箱中取出蛋白微阵列，使用前置于4 °C冰箱中平衡。</li>
	<li>将封闭缓冲液直接加入含有蛋白质微阵列的载片架中，并用封口膜封住顶部以防止泄漏。在封闭缓冲液中封闭微阵列1小时。&#160;在4 °C条件下，以50 rpm的转速振荡。</li>
	<li>封闭后，将芯片转移至预冷至 4 °C 的湿盒中，并加入 90 μl&#160;将稀释的探针直接加到芯片表面。用带凸起的盖片覆盖芯片，并在加湿的孵育盒中于4 °C静置孵育（不振荡）。&#160;1.5 小时。</li>
	<li>用探针缓冲液在三个50 ml容器中各清洗芯片3次，每次1分钟&#160;锥形管。将玻片加入含有足量预冷探针缓冲液的锥形管中，确保缓冲液完全浸没玻片。让升举器垫片轻轻从蛋白质微阵列上滑落（切勿强行剥离，以免损伤阵列表面）。</li>
	<li>在完成洗涤步骤（步骤 2.5）后，立即将抗体溶液直接加到芯片上，并如前所述覆盖带有凸起的盖玻片。将芯片置于湿化 chamber 中，4 °C 孵育 30 分钟。</li>
	<li>重复之前的洗涤步骤（在探针缓冲液中洗涤3次，每次1分钟），并在50 ml离心管中离心&#160;在室温下，于台式离心机中以800 × g离心5分钟。将芯片置于载片架中，避光空气干燥30分钟，随后在647 nm波长下扫描芯片。</li>
</ol>

<ol><li>Fasolo, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diverse+protein+kinase+interactions+identified+by+protein+microarrays+reveal+novel+connections+between+cellular+processes%5BTitle%5D)+AND+%22Genes%22%5BJournal%5D)">Diverse protein kinase interactions identified by protein microarrays reveal novel connections between cellular processes.</a> Genes. 25, 767-778 (2011).</li>
<li>Zhu, X., Gerstein, M., Snyder, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ProCAT%3A+a+data+analysis+approach+for+protein+microarrays%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+biology%22%5BJournal%5D)">ProCAT: a data analysis approach for protein microarrays.</a> Genome biology. 7, R110(2006).</li>
<li>Breitkreutz, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+global+protein+kinase+and+phosphatase+interaction+network+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A global protein kinase and phosphatase interaction network in yeast.</a> Science. 328, 1043-1046 (2010).</li>
<li>Gavin, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+organization+of+the+yeast+proteome+by+systematic+analysis+of+protein+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Functional organization of the yeast proteome by systematic analysis of protein complexes.</a> Nature. 415, 141-147 (2002).</li>
<li>Jeong, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+identification+of+monospecific+monoclonal+antibodies+using+a+human+proteome+microarray%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Rapid identification of monospecific monoclonal antibodies using a human proteome microarray.</a> Mol Cell Proteomics. 11 (6), (2012).</li>
<li>Krogan, N. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+landscape+of+protein+complexes+in+the+yeast+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Global landscape of protein complexes in the yeast Saccharomyces cerevisiae.</a> Nature. 440, 637-643 (2006).</li>
<li>Popescu, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+binding+of+calmodulin-related+proteins+to+their+targets+revealed+through+high-density+Arabidopsis+protein+microarrays%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Differential binding of calmodulin-related proteins to their targets revealed through high-density Arabidopsis protein microarrays.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104, 4730-4735 (2007).</li>
<li>Zhu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+analysis+of+protein+activities+using+proteome+chips%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Global analysis of protein activities using proteome chips.</a> Science. 293, 2101-2105 (2001).</li>
<li>Ptacek, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+analysis+of+protein+phosphorylation+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Global analysis of protein phosphorylation in yeast.</a> Nature. 438, 679-684 (2005).</li>
<li>Haab, B. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibody+arrays+in+cancer+research.+Molecular+%26+cellular+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Antibody arrays in cancer research. Molecular & cellular proteomics.</a> Mol Cell Proteomics. 4 (4), 377-383 (2005).</li>
<li>Kopf, E., Zharhary, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibody+arrays--an+emerging+tool+in+cancer+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22The+international+journal+of+biochemistry+%26+cell+biology%22%5BJournal%5D)">Antibody arrays--an emerging tool in cancer proteomics.</a> The international journal of biochemistry & cell biology. 39, 1305-1317 (2007).</li>
<li>Berrade, L., Garcia, A. E., Camarero, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+microarrays%3A+novel+developments+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmaceutical+research%22%5BJournal%5D)">Protein microarrays: novel developments and applications.</a> Pharmaceutical research. 28, 1480-1499 (2011).</li>
<li>Balboni, I., Limb, C., Tenenbaum, J. D., Utz, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+microarray+surfaces+and+arraying+parameters+for+autoantibody+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Evaluation of microarray surfaces and arraying parameters for autoantibody profiling.</a> Proteomics. 8, 3443-3449 (2008).</li>
<li>Gelperin, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biochemical+and+genetic+analysis+of+the+yeast+proteome+with+a+movable+ORF+collection%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+development%22%5BJournal%5D)">Biochemical and genetic analysis of the yeast proteome with a movable ORF collection.</a> Genes & development. 19, 2816-2826 (2005).</li>
<li>Fasolo, J., Snyder, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+microarrays%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Protein microarrays.</a> Methods Mol. Biol. 548, 209-222 (2009).</li>
<li>Im, H., Snyder, M., et al. Preparation of recombinant protein spotted arrays for proteome-wide identification of kinase targets. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aIm%2C+H+%22Current+protocols+in+protein+science%22">Current protocols in protein science</a>. Coligan, J. E. 27, Unit 27 24(2013).</li>
<li>MacBeath, G., Schreiber, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Printing+proteins+as+microarrays+for+high-throughput+function+determination%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Printing proteins as microarrays for high-throughput function determination.</a> Science. 289, 1760-1763 (2000).</li>
</ol>

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

本方案最初使用85种独特的酵母蛋白激酶-V5融合蛋白，比较了不同且相关的酵母蛋白激酶家族之间的结合活性，从而在体内鉴定了新的激酶相互作用网络in vivo1。作为一种新兴的蛋白质组学分析技术，利用蛋白质微阵列进行高通量（HTP）筛选平台的开发，最初依赖于肽库以及真核和原核模式生物8,17；随后，该检测平台被应用于植物和人类等更高等的真核生物5,7。目前尚无商业化可获得的酵母蛋白质芯片，但已有多个资源可提供序列验证的cDNA文库
尽管该技术可能非常有效，但需要注意的是，该检测是在体外进行的 体外 和, 因此会产生假阳性结果。因此，优化检测条件并采用合理的过滤策略有助于获得有意义的数据。下一代蛋白质微阵列技术包含大量高度纯化的功能性蛋白质，可用于对多种生物体进行生化分析，包括 拟南芥，酿酒酵母，以及 智人.
新型蛋白质微阵列所具备的高度精密设计使其能够执行多种多样的生化分析。利...

进行蛋白质生物化学与结合活性的全局分析的需求 体内 已推动了用于分析蛋白质-蛋白质相互作用（PPIs）及全蛋白质组翻译后修饰的新方法的发展1,3-8蛋白质微阵列使用全长功能蛋白制备成功能性蛋白质微阵列4-6,8,9或含有抗体的分析型蛋白质微阵列10,11它们被设计为在显微镜载玻片上以高密度排列蛋白质，载玻片表面具有多种化学修饰，以适应广泛生化分析所需的各类实验条件。12硝酸纤维素和醛基表面化学法，用于通过赖氨酸进行化学偶联，或采用亲和偶联方法（如用于偶联带组氨酸标签蛋白的镍螯合载片，以及用于亲和偶联的谷胱甘肽）等其他方法13.
利用功能蛋白微阵列检测蛋白质-蛋白质相互作用需要获得高质量的功能蛋白文库14。S. cerevisiae 可通过高拷贝数的亲和标签蛋白构建体与高通量色谱纯化技术相结合，适用于构建此类文库。酵母基因组的绝大部分已被测序，几乎整个蛋白质组均可通过高拷贝质粒进行表达，用于纯化及生化分析12。一旦获得蛋白质并以384孔板格式排列，即可将其点样至显微镜载玻片上，从而实现快速、并行、多参数的生化分析以及生物信息学解析8,14-16。蛋白微阵列已被广泛应用于酶学检测，以及蛋白质、脂类、小分子和核酸等多种分子间的相互作用研究。蛋白质组微阵列表面的蛋白质具有良好的可及性，适用于多种分析检测方法，包括免疫亲和检测、表面等离子共振（Surface Plasmon Resonance）、荧光检测及其他多种技术。此外，该方法还可实现对实验条件的精细调控，而这些调控在体内（in vivo）实验中往往难以实现。
本实验方案的目的是展示如何正确使用功能蛋白微阵列来检测蛋白质-蛋白质相互作用。该应用能够利用高度纯化的目标分析物（蛋白质）对蛋白质结合活性进行高通量平行生化分析。目标C端（羧基端）带有V5标签的融合诱饵蛋白通过高拷贝质粒在一种优化用于蛋白质纯化的酵母菌株中表达。C端标记可确保全长蛋白已被翻译。本研究中使用的蛋白为Tda1-V5融合蛋白激酶，通过His6X标签利用镍亲和树脂进行纯化。Tda1-V5融合蛋白通过咪唑梯度进行连续洗脱，以获得高度富集的组分用于后续检测。

<table><tbody><tr><td>培养皿</td><td>VWR</td><td>NC-10747</td><td>或同类产品</td></tr><tr><td>酵母提取物（Bacto yeast extract）</td><td>Difco</td><td>0217-17</td><td></td></tr><tr><td>蛋白胨（Bacto peptone）</td><td>Difco</td><td>0118-17</td><td></td></tr><tr><td>琼脂（Bacto agar）</td><td>Difco</td><td>0140-01</td><td></td></tr><tr><td>葡萄糖（Dextrose）</td><td>Sigma</td><td>D9434</td><td></td></tr><tr><td>棉子糖（Raffinose）</td><td>Sigma</td><td>R0514</td><td></td></tr><tr><td>半乳糖（Galactose）</td><td>Sigma</td><td>G0750</td><td></td></tr><tr><td>Sc-Ura 缺陷型培养基（Sc-Ura drop out media）</td><td>MP Bio</td><td>114410622</td><td></td></tr><tr><td>小型培养管</td><td>VWR/Fisher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>大型锥形瓶</td><td>VWR/Fisher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>JA-10 转子离心机</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>离心管（500 ml）</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>50 ml Falcon 管</td><td>VWR/Fisher</td><td>21008-951</td><td></td></tr><tr><td>PBS 片剂</td><td>Sigma</td><td>P4417</td><td></td></tr><tr><td>FastPrep 管（2 ml 螺口管）</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>FastPrep 仪器</td><td>MP Biomedicals</td><td>116004500</td><td></td></tr><tr><td>氧化锆珠（Zircon Beads）</td><td>BioSpec</td><td>11079105</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>P4417</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>Sigma</td><td>D9779</td><td></td></tr><tr><td>MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma</td><td>M8266&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S3014&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>咪唑（Imidazole，pH = 7.4）</td><td>Sigma</td><td>I5513&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>PMSF</td><td>Sigma</td><td>93482</td><td></td></tr><tr><td>蛋白酶抑制剂混合物（无 EDTA）（Complete Inhibitor Cocktail (EDTA Free)）</td><td>Roche</td><td>11873580001</td><td></td></tr><tr><td>磷酸酶抑制剂混合物 1（Phosphatase inhibitor cocktail 1）</td><td>sigma</td><td>P2850</td><td></td></tr><tr><td>牛血清白蛋白（BSA）</td><td>Sigma</td><td>A2153&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma</td><td>P1379&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>ATP</td><td>Sigma</td><td>A1852&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>摇床培养箱（30 &amp;deg;C）</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>镍亲和树脂（Nickel Affinity Resin）</td><td>Life Technologies</td><td>R901-01</td><td></td></tr><tr><td>G25 柱</td><td>GE life sciences</td><td>27-5325-01&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>旋转混合仪（Nutator）</td><td>VWR/Fisher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SDS-PAGE 凝胶（NuPage）</td><td>Life Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>考马斯亮蓝染色液（Coomassie Blue Stain）</td><td>Life Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>单克隆 V5 抗体（Monoclonal V5 Antibody）</td><td>Life Technologies</td><td>R960-25</td><td></td></tr><tr><td>Alexa647 标记的单克隆 V5 抗体（Alexa647 Tagged monoclonal V5 Antibody）</td><td>Life Technologies</td><td>451098</td><td></td></tr><tr><td>蛋白微阵列试剂盒（Protein Microarrays Kit）</td><td>Life Technologies</td><td>PAH0525013</td><td></td></tr><tr><td>Genepix 扫描仪</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lifter Slips</td><td>Thomas Scientific</td><td></td><td>http://www.thomassci.com/Supplies/Microscope-Cover-Glass/_/LIFTER-SLIPS/</td></tr><tr><td>裂解缓冲液：0.1% Triton X-100，0.5 mM DTT，&lt;br/&gt; 2 mM MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;，500 mM NaCl，50 mM 咪唑（pH 7.4），无 EDTA 蛋白酶抑制剂混合物 &amp;ndash;，磷酸酶抑制剂混合物 1，1 mM PMSF &amp;nbsp;（使用前立即加入）</td><td></td><td></td><td>将试剂加入 1× PBS（0.01 M 磷酸盐缓冲液，0.0027 M 氯化钾，0.137 M 氯化钠；pH 7.4）中，配制所需体积的裂解液</td></tr><tr><td>封闭缓冲液：1% 牛血清白蛋白（BSA），0.1% Tween-20</td><td></td><td></td><td>将试剂加入 1× PBS 中，配制所需体积的封闭缓冲液</td></tr><tr><td>探针缓冲液：2 mM MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;，0.5 mM DTT，0.05% Triton X-100，50 mM NaCl，500 &amp;mu;M ATP（用于激酶），1% BSA</td><td></td><td></td><td>将试剂加入 1× PBS 中，配制所需体积的探针缓冲液</td></tr><tr><td>洗涤缓冲液：0.1% Triton X-100，500 mM NaCl，0.5 mM DTT，50 mM 咪唑（pH 7.4），2 mM MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td></td><td></td><td>将试剂加入 1× PBS 中，配制所需体积的探针缓冲液</td></tr><tr><td>洗脱缓冲液：0.1% Triton X-100，0.5 mM DTT，2 mM MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;，500 mM NaCl，50 &amp;ndash; 500 mM 咪唑（pH 7.4），无 EDTA 蛋白酶抑制剂混合物 &amp;ndash;，磷酸酶抑制剂混合物 1，1 mM PMSF（使用前立即加入）</td><td></td><td></td><td>开始实验前，需注意咪唑浓度梯度（50 &amp;ndash; 500 mM），并为每个浓度分别配制洗脱缓冲液（建议以 50 mM 为间隔递增）。将试剂加入 1× PBS 中，配制所需体积的探针缓冲液</td></tr><tr><td>3× YEP + 6% 半乳糖：将 30 g 酵母提取物和&amp;nbsp;60 g 蛋白胨溶于 700 ml H₂O 中，高压灭菌。加入 300 ml 过滤除菌的 20% 半乳糖溶液（质量/体积比）</td><td></td><td></td><td>&amp;nbsp;半乳糖不可高压灭菌</td></tr></tbody></table>

利用高密度功能性蛋白质微阵列检测蛋白质-蛋白质相互作用

Probing High-density Functional Protein Microarrays to Detect Protein-protein Interactions

使用含有约 4,200 种重组酵母蛋白的高密度功能蛋白微阵列，通过亲和纯化的酵母激酶融合蛋白检测激酶-蛋白相互作用，该融合蛋白带有 V5 表位标签用于信号检测。通过培养一种经过优化的高拷贝蛋白表达酵母菌株来获得纯化的激酶，该菌株携带一个质粒，其中包含受 GAL 诱导型启动子调控的激酶-V5 融合构建体。酵母在含有中性碳源的限制性培养基中培养 6 小时，随后用 2% 半乳糖诱导表达。接着收集菌体培养物，并采用标准的亲和层析技术纯化激酶，以获得高纯度的蛋白激酶用于后续检测。将纯化的激酶用激酶缓冲液稀释至适合检测的浓度范围，并在与蛋白微阵列杂交前对微阵列进行封闭处理。杂交完成后，使用单克隆 V5 抗体对微阵列进行探针孵育，以鉴定被激酶-V5 蛋白结合的靶蛋白。最后，利用标准的微阵列扫描仪对芯片进行扫描，并提取数据进行下游生物信息学分析1,2，以确定一组高置信度的蛋白相互作用，用于后续的体内验证 in vivo。

使用标准芯片读取仪观察蛋白质-蛋白质相互作用活性，以Tda1-V5蛋白激酶融合构建体作为诱饵蛋白，针对包含约4,200种独特S. cerevisiae GST融合蛋白的酵母功能蛋白微阵列进行检测。通过Genepix软件进一步分析，发现多种不同强度的结合事件。信号强度呈梯度变化，该信号来源于与靶标（V5-激酶）结合的单克隆V5-荧光染料偶联抗体，据此评估结合亲和力。采用ProCat评分算法2，对每种被检测蛋白在两个独立蛋白微阵列上的重复检测结果（每种蛋白在芯片上点样两次）进行蛋白质-蛋白质相互作用的识别，随后确定评分阈值以判定观察到的相互作用。
通过比较两个芯片阵列，可获得4个技术重复（n = 4），可用于通过相关性分析（R）评估不同批次检测间的变异程度2每个蛋白质在芯片上的两个点的信号强度。利用预设的阈值，通过微阵列共鉴定出Tda1-V5诱饵蛋白与阵列上其他蛋白质之间的9个蛋白质-蛋白质相互作用。1此外，为了评估可能引起假阳性的表面干扰因素，相同的蛋白质被点样在芯片的不同位置作为对照。通过比较不同激...

利用包含几乎整个S. cerevisiae蛋白质组的蛋白质微阵列，可并行快速、无偏倚地检测数千种蛋白质-蛋白质相互作用。该方法还可用于小分子-蛋白质、翻译后修饰及其他高通量检测。

包含约 4,200 种重组酵母蛋白的高密度功能性蛋白微阵列用于激酶-蛋白相互作用研究，采用一种……

本实验的核心目标是以平行且无偏倚的方式，在特定蛋白质组中鉴定蛋白质及其相互作用，而这是其他技术无法实现的。该目标通过以下步骤实现：首先将带有表位标签的目的蛋白与一个高度纯化、全长且具有功能的蛋白质文库进行杂交，该文库以坐标阵列形式固定在显微镜载玻片表面。当目的蛋白与芯片上相应的靶蛋白达到结合平衡后，洗去未结合的蛋白组分，然后使用标准的微阵列扫描仪，通过针对表位标签的荧光标记单克隆抗体来检测蛋白质间的相互作用。所得图像包含了每个特征点相对于结合蛋白和荧光信号强度的信息。借助微阵列分析软件，可将这些信息外推，生成阵列上每个特征点的强度值列表。有关蛋白质-蛋白质相互作用配对的信息可导出至下游生物信息学分析软件，用于对特征特异性数据进行评分，并鉴定目标蛋白质与微阵列上各蛋白质之间的蛋白质-蛋白质相互作用。通过两个或更多蛋白质微阵列整合原始信号强度数据，以消除实验间和实验内的变异影响，并对数据进行标准化处理，从而对每种相互作用进行评分。最终输出结果生成一个相互作用蛋白质的目标列表，可用于指导对蛋白质-蛋白质相互作用的进一步研究。体内功能蛋白质微阵列由Michael Snyder实验室在15年多前开发而成。自那时以来，由于该技术具有多功能性以及适用于生物化学蛋白质组学分析，已得到许多成功的应用。该技术有助于研究蛋白质相互作用和模块化信号网络，以及替代性连接关系和已知的信号级联通路。要培养和纯化V五融合激酶探针，请使用含有V五融合蛋白的 freshly streaked 酵母菌株 Y 2 58，在含尿嘧啶的合成完全培养基（2%葡萄糖琼脂平板）上于30°C培养三天（从冷冻保存的菌种开始）。挑取单菌落接种至起始培养液中，在含尿嘧啶的合成完全培养基中过夜培养。在30摄氏度的摇床或旋转平台上培养含2%葡萄糖的培养基。次日，接种400毫升含2%棉子糖的合成完全尿嘧啶培养基，加入适量的种子培养物，使600纳米处的最终光密度（OD 600）达到0.1。将接种物培养至 OD 600 为 0.6，然后通过加入足量的三倍酵母提取物-胰蛋白胨培养基（补充 6% 半乳糖）诱导 V 五激酶融合构建物的表达，使诱导培养基稀释三倍，或终浓度为 2% 半乳糖。在 30 摄氏度下于摇床中诱导细胞 6 小时。使用 2 升锥形瓶以确保充分通气。将400毫升细胞悬液在4°C下以1000 × g离心5分钟收集细胞。用50毫升预冷的PBS缓冲液洗涤细胞一次，并转移至50毫升锥形管中。再次用预冷的磷酸盐缓冲盐水或A PBS缓冲液洗涤细胞沉淀，并将沉淀转移至2毫升的扣盖管中进行裂解。在4°C条件下，以20,000 × g离心细胞1分钟，用移液器吸除上清缓冲液，将离心管置于冰上。使用0.5毫米氧化锆珠进行细胞裂解，裂解体系中细胞沉淀、珠子与PBS裂解缓冲液的体积比为1:1:1。随后，在4°C条件下，使用振荡仪对混合物进行涡旋振荡，共进行3次，每次2分钟。在4°C条件下，使用台式微量离心机以20,000 × g离心裂解液10分钟。将澄清的裂解液转移至含有约100 µL预洗镍亲和树脂的离心管中，在4°C下轻轻摇动孵育2小时。为捕获带有组氨酸六聚体标记的V5融合蛋白，使用台式离心机在1000 × g和4°C条件下离心5分钟，使树脂沉淀，随后弃去上清液。在突变仪上，用洗涤缓冲液在 4 摄氏度下洗涤树脂 10 分钟。更换新鲜的洗涤缓冲液，重复洗涤两次。用两份 100 微升的 200 毫摩尔 ole 溶液洗脱蛋白质。向样品中加入甘油，使其终浓度为30%，然后在负80摄氏度保存，直至用于检测。为检测相互作用，将V5-FITC偶联抗体用探针缓冲液稀释至260纳克/毫升，并通过振荡充分混匀。然后将V五融合蛋白探针稀释至5至500微克/毫升的浓度范围。接下来，将蛋白质微阵列从冷冻保存状态取出，并在使用前置于冰箱中4摄氏度环境平衡。直接将封闭缓冲液加入含有蛋白质微阵列的载片架中，并用帕拉膜封盖顶部以防止液体泄漏。在4°C条件下，于摇床上以50转/分钟的速度用封闭缓冲液封闭芯片一小时。封闭结束后，将芯片转移至预冷至4°C的湿盒中，并直接向芯片表面加入90微升稀释后的探针。用抬升式盖玻片覆盖芯片，于4°C湿盒中静置孵育一个半小时。孵育完成后，将芯片放入含有足量预冷探针缓冲液的50毫升锥形管中，确保缓冲液完全浸没芯片，使抬升式盖玻片轻轻脱落，从而从蛋白微阵列上分离。将芯片在三个锥形管中分别清洗三次，每次一分钟。完成清洗后，立即将抗体溶液直接加到芯片上，并覆盖已擦除的 lifter slip。同前，将芯片置于加湿孵育盒中，在4°C下孵育30分钟。重复之前的洗涤步骤，并在台式离心机中以800 ×g在15毫升锥形管中离心5分钟。在室温下，将芯片置于载片架中避光空气干燥30分钟，然后在647纳米波长下扫描芯片。本实验中，研究了TDA one V five的结合活性。将约4,200种全长GST融合蛋白以重复点样方式制备的酵母蛋白质微阵列，分别与空载体对照或TDA1-V5探针孵育。插图面板比较了两个阵列中的相同区域。值得注意的是RIM11，有趣的是，在此前已发表的一项研究中，RIM11也被鉴定为TDA1的磷酸化靶标。一旦确定了靶标，就可以在体内对其进行生物化学和功能活性的检测。如果您正在观看本视频，您应该能够更好地理解如何利用功能性蛋白质微阵列来鉴定候选的蛋白质-蛋白质相互作用，以便进一步进行体内验证和研究。

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科研

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Biology

生物学

探讨高密度功能蛋白微阵列来检测蛋白质 - 蛋白质相互作用

本视频展示了利用微图案化表面进行蛋白质-蛋白质相互作用实验及后续分析的方法。该方法能够在活细胞中检测蛋白质相互作用，兼具高通量能力与获取定量信息的优势。...

体内检测微图案化表面的蛋白质-蛋白质相互作用

本研究中，我们描述了一种改进的多重高通量抗体微阵列结合凝集素检测方法的实验方案，可用于特定蛋白质的糖基化谱分析。该方案采用了新的可靠试剂，与先前方法相比，显著缩短了实验时间，降低了成本，并减少了对实验室设备的需求。...

用于复杂样本中特定蛋白质糖基化多重高通量分析的化学封闭抗体微阵列

本视频展示了一种利用生物素标记的细胞穿透肽检测细胞内蛋白质-蛋白质相互作用的技术。细胞穿透肽可促进其偶联的肽段进入细胞，并特异性结合与其相互作用的蛋白质。在与亲和素结合后，生物素能够从细胞裂解液中纯化出相互作用蛋白质的复合物。...

生物素标记的细胞穿透肽探针用于检测蛋白质-蛋白质相互作用

本视频展示了利用邻近连接实验（Proximity Ligation Assay,...

蛋白质-蛋白质相互作用的检测 果蝇 使用邻近连接实验检测幼虫

多肽阵列筛选是一种用于鉴定蛋白质-蛋白质相互作用位点的高通量检测方法。该方法可实现对目标蛋白质多种相互作用的定位，也可用于发现靶向该蛋白质的抑制剂作用位点。本文中，我们描述了一种多肽阵列筛选与分析的实验方案。...

利用肽阵列鉴定蛋白质-蛋白质相互作用位点

蛋白质之间会相互作用，而这些相互作用在很大程度上决定了它们的功能。可通过基于二氢叶酸还原酶蛋白片段互补分析法（DHFR-PCA）的酵母适合度检测，在高通量条件下在活体（in...

活细胞中基于蛋白质片段互补分析法（PCA）的全基因组蛋白质-蛋白质相互作用筛选

本文介绍了蛋白质复合物的亲和纯化及其通过蓝色天然PAGE分离的实验方案，随后采用无标记定量质谱技术进行蛋白质相关性分析。该方法有助于将相互作用组解析为不同的蛋白质复合物。...

通过蓝色天然PAGE和蛋白质相关性分析解析亲和纯化蛋白质复合物

本文介绍了一种用于高通量筛选细胞外蛋白微阵列以鉴定新型受体-配体相互作用的实验方案。同时，我们还描述了一种通过使用蛋白-微珠复合物来增强瞬时蛋白质-蛋白质相互作用检测的方法。...

用于高通量检测低亲和力受体-配体相互作用的细胞外蛋白微阵列技术

同源J结构域蛋白与Hsp70分子伴侣协同作用，参与从蛋白质折叠到降解等多种生物学过程。本文介绍了一种原位邻近连接实验方法，可用于在细菌、酵母和人类细胞中监测这些短暂形成的分子伴侣复合物。...

原位监测细菌、酵母和人类细胞中瞬时形成的分子伴侣复合物

本文介绍了一种利用化学探针和质谱技术从原代细胞和组织中捕获并鉴定疾病特异性蛋白质-蛋白质相互作用的实验方案。通过专用的基于网络的分析平台对获得的相互作用数据集进行分析，以揭示与疾病相关的动态网络功能障碍及通路改变。...

绘制疾病中功能失调的蛋白质-蛋白质相互作用图谱

探索高密度功能蛋白微阵列技术，用于无偏倚地检测蛋白质-蛋白质相互作用。该方法利用全长功能蛋白库和荧光标记抗体，实现高通量筛选和生物信息学分析，为研究细胞信号网络提供可靠平台。

利用高密度功能性蛋白质微阵列检测蛋白质-蛋白质相互作用

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