探讨高密度功能蛋白微阵列来检测蛋白质 - 蛋白质相互作用
August 2nd, 2015
使用含有几乎整个S.蛋白质芯片酵母蛋白质组被探查以十万计的蛋白质-蛋白质相互作用中并行快速无偏询问。这种方法可以用于蛋白质 - 小分子，翻译后修饰，并在高通量其它测定。
该程序的总体目标是以平行无偏倚的方式识别给定蛋白质组内的蛋白质、蛋白质相互作用，这是其他技术无法实现的。这是通过首先将目标蛋白质和表位标记的蛋白质与沉积在显微镜载玻片表面坐标平面中的高度纯化的全长功能性蛋白质文库杂交来实现的。一旦蛋白质与阵列上的每个靶蛋白达到平衡，未结合的组分就会被洗去，并使用标准微阵列扫描仪用与荧光基团偶联的表位单克隆抗体检测蛋白质相互作用。
生成的图像与有关每个特征的强度（相对于结合蛋白和荧光信号）的信息交织在一起。该信息在微阵列分析软件的帮助下进行推断，以生成阵列上每个特征的强度值列表。有关蛋白质-蛋白质相互作用对的信息可以导出到下游生物信息学分析软件，以对特征特异性数据进行评分并识别目标蛋白质与微阵列上的蛋白质之间的蛋白质相互作用。
原始信号强度数据在两个或多个蛋白质微阵列上编译，以考虑分析间和分析内的变化，并将数据标准化以对每个相互作用进行评分。所得输出生成相互作用蛋白质的靶标列表，可用于指导进一步询问蛋白质蛋白质相互作用。体内功能蛋白微阵列芯片是 Michael Snyder 的实验室于 15 年前开发的。
从那时起，由于其多功能性和生化蛋白质组学分析，该技术已经取得了许多成功的应用。该技术有助于研究蛋白质相互作用和模块化信号网络，以及替代连接和先前已知的信号级联 为了培养和纯化 V 5 融合激酶探针使用新鲜划线的酵母菌株 Y 2 58，含有 V 5 融合蛋白板，酵母在合成完全尿嘧啶上，2% 葡萄糖琼脂，并在 30 摄氏度下从冷冻培养物中生长三天。接种来自单个菌落的起始培养物，并在合成完全尿嘧啶中生长过夜。
2% 葡萄糖在 30 摄氏度的摇动平台或轮子上。第二天早上，接种 400 毫升合成完全尿嘧啶。2% 棉子糖培养物与足够的发酵剂培养物，以达到 600 纳米的最终光密度或 OD 600 为 0.1。
将接种物生长至 OD 600 为 0.6，然后通过添加足够的 3 x 酵母提取物诱导 V 5 激酶融合构建体表达。Pep tone 补充 6% 半乳糖，将诱导培养基稀释 3 倍或最终半乳糖浓度为 2%在 30 摄氏度下在摇动平台上诱导细胞 6 小时。使用 2 升锥形瓶确保适当通气。
通过在 4 摄氏度下以 1000 倍 G 旋转 400 毫升细胞悬液 5 分钟来收获细胞。用 50 毫升冰冷的 PBS 缓冲液洗涤细胞一次，然后转移到 50 毫升锥形管中。在冰冷的磷酸盐缓冲盐水或 A PBS 缓冲液中再次洗涤沉淀，然后转移到两毫升卡口盖管中进行裂解。
在 4 摄氏度下以 20， 000 倍 G 离心细胞 1 分钟后，用移液管除去缓冲液并将试管置于冰上。用 0.5 毫米氧化锆珠溶出细胞，将细胞沉淀以 1 比 1 的比例溶出，以珠子的形式裂解至 PBS 裂解、缓冲。然后使用搅拌平台在 4 摄氏度下涡旋混合物 3 次，间隔 2 分钟。
将裂解物在 4 °C 的台式微量离心机中以 20， 000 倍 G 离心 10 分钟。将澄清的裂解物转移到含有约 100 μL 预洗镍亲和树脂的试管中，并在 4 摄氏度下在章动物上孵育 2 小时。为了捕获组胺 6 x 标记的 V 5 融合蛋白，在去除上清液后，使用台式离心机在 1000 倍 G 和 4 摄氏度下沉淀树脂 5 分钟。
在 mutator 上用洗涤缓冲液在 4 摄氏度下洗涤树脂 10 分钟。用新鲜的洗涤缓冲液再重复洗涤两次。用两个 100 微升体积的 200 毫摩尔 ole 洗脱蛋白质。
加入甘油至最终浓度为 30% 的样品，并储存在零下 80 摄氏度直至用于测定。检测交互。在探针中将 V 5 氟 4 偶联抗体稀释至 260 ng/mL，缓冲并通过摇动充分混合。
然后将 V 5 融合蛋白探针稀释到每毫升 5 至 500 微克的浓度范围内。接下来，从冰箱中取出蛋白质微阵列，并在使用前将冰箱加热至 4 摄氏度。将封闭缓冲液直接添加到含有蛋白质微阵列的载玻片架上，并用 Paraform 覆盖顶部以防止泄漏。
通过在 4 摄氏度的载物台上以 50 RP 摇动，将阵列在封闭缓冲液中封闭一小时。封闭后，将阵列转移到加湿室中，平铺至 4 摄氏度，并将 90 微升稀释的探针直接添加到阵列表面。用凸起的升降滑片覆盖阵列，并在 4 摄氏度的加湿室中不摇晃地孵育一个半小时孵育孵育孵育后，将载玻片加入 50 毫升锥形管中，该锥形管含有足够的预冷探针缓冲液以完全包裹载玻片，让升降滑片轻轻地从蛋白质微阵列上滑落。
将阵列芯片洗净 3 次，每次 1 分钟，放入 3 个锥形管中。完成洗涤后立即将抗体溶液直接涂抹在阵列上，并覆盖擦除的升降片。和以前一样，将阵列在 4 摄氏度下在加湿室中孵育 30 分钟。
执行与之前相同的洗涤步骤，并在台式离心机中以 800 倍 G 的 15 mL 锥形管离心 5 分钟。在室温下，将芯片在载玻片架中避光风干 30 分钟，然后在 647 纳米处扫描芯片。在本实验中，研究了 TDA one V five 的结合活性。
将酵母蛋白微阵列与大约 4， 200 个全长 GST 融合蛋白一式两份点样，与空载体对照或 TDA one V 5 探针一起孵育。插图面板比较两个数组中的相同区域。特别值得注意的是 RIM 11，有趣的是，在之前发表的研究中，它也被确定为 TDA 1 的磷酸化靶标。
一旦确定了靶标，就可以在体内测试它们的生化和功能活性。如果您正在观看此视频，您应该更好地了解如何使用功能性蛋白质微阵列作为识别候选蛋白质蛋白质相互作用的手段，以便进一步进行体内验证和研究。
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概述
本研究提出了一种使用蛋白质微阵列在蛋白质组中识别蛋白质-蛋白质相互作用的方法。该方法允许并行快速且无偏见地询问数千种相互作用，这是传统技术无法实现的。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 生物化学
- 蛋白质组学
背景
- 蛋白质-蛋白质相互作用对于理解细胞过程至关重要。
- 研究这些相互作用的传统方法在范围上可能有限。
- 蛋白质微阵列提供了一种高通量的替代方案。
- 该技术利用全长功能蛋白库。
研究目的
- 开发一种无偏见识别蛋白质相互作用的方法。
- 利用蛋白质微阵列进行高通量测定。
- 促进相互作用数据的下游生物信息学分析。
所用方法
- 在显微镜载玻片上将表位标记的蛋白质与蛋白质库杂交。
- 在达到平衡后洗去未结合的蛋白质。
- 使用连接荧光标记物的单克隆抗体检测结合的蛋白质。
- 分析荧光信号以生成相互作用数据。
主要结果
- 成功以高通量方式识别蛋白质-蛋白质相互作用。
- 生成对应每种相互作用的强度值。
- 导出相互作用数据以供进一步的生物信息学分析。
- 展示该方法适用于各种测定。
结论
- 该方法为研究蛋白质相互作用提供了一个强大的平台。
- 它增强了高通量生物测定的能力。
- 该方法可以适应各种类型的分子相互作用。
常见问题
Executive Industry Relevance
Protein-protein interaction mapping is a critical early step in target validation and mechanistic de-risking for biopharma discovery programs. High-density functional protein microarrays enable unbiased, proteome-wide screening to identify direct binding partners, supporting hypothesis generation and pathway elucidation. This approach enhances predictive confidence in target selection by providing quantitative interaction data prior to costly downstream validation.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by mapping direct protein-protein interactions across a functional proteome.
- Operational Value: Provides a parallel, unbiased platform to identify binding partners without prior bias toward known pathways.
- Predictive Value: Generates high-confidence interaction datasets that inform target prioritization and pathway analysis.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated protein libraries for reproducible screening campaigns using purified kinase probes.
- Operational Value: Standardizes hybridization and detection workflows to ensure assay consistency across replicates.
- Scalability: Supports screening of ~4,200 full-length proteins in duplicate, enabling robust statistical analysis.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Identifies candidate interactions for downstream in vivo functional validation in disease-relevant models.
- Mechanistic De-risking: Clarifies signaling network connectivity by detecting both known and novel interaction partners.
- Pathway Alignment: Supports biomarker discovery by linking kinase activity to phosphorylated substrates in cellular contexts.
Pipeline & Workflow Integration
This method fits within the early discovery continuum, supporting target identification through proteome-wide interaction screening before lead identification and preclinical validation.
- Discovery Biology: Facilitates hypothesis testing by revealing direct binding partners of kinases or other proteins of interest.
- Screening: Enables assay-ready protein microarrays with blocked surfaces and standardized hybridization conditions.
- Analytics: Generates normalized intensity values from duplicate arrays to score interactions and account for technical variation.
- Translational Research: Connects microarray hits to in vivo validation through follow-up functional assays.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable proteome screening platform applicable to multiple kinases or protein families.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases target validation confidence through direct, quantitative measurement of protein-protein interactions.
- Operational Value: Ensures reproducibility via standardized purification, hybridization, washing, and detection steps.
- Strategic Value: Reduces biological risk in target selection by providing early interaction landscape data.
- Portfolio Impact: Informs risk-adjusted advancement decisions by highlighting interaction networks relevant to disease mechanisms.
Implementation Considerations
- Requires expertise in yeast protein expression, affinity purification, and microarray handling.
- Dependent on access to high-density protein microarray slides and fluorescence scanning instrumentation.
- Necessitates standardization of blocking, hybridization, and antibody probing conditions across batches.
- Involves optimization of kinase probe concentration and incubation times for specific targets.
- Limited to soluble, functional proteins that maintain activity post-purification and array immobilization.
