利用胶体探针纳米显微技术对颗粒-颗粒相互作用进行定量与定性分析

本实验的总体目标是获取基于液体的胶体系统中粒子间纳米尺度相互作用的定量信息。首先，通过将单个粒子固定在原子力显微镜悬臂探针尖端，制备功能化的胶体探针；第二步是将该探针安装到原子力显微镜上，并准备含有胶体粒子基底的液体池。

接下来，使用显微镜软件通过热噪声法对胶体探针的弹簧常数和灵敏度进行校准。最后一步是利用该胶体探针，在液体中测量其与胶体颗粒基底之间的相互作用以完成校准。同时，也将在液体中使用云母（MICA）基底直接测量探针灵敏度，从而最终确定胶体探针的性能。

显微镜可用于测量可能导致所研究液相胶体系统絮凝动力学和物理不稳定的颗粒间作用力。该方法通过精确测量两种固体材料之间的吸引力、内聚力和分离力，有助于确定和量化影响多种液相胶体系统物理稳定性及絮凝动力学的关键参数，例如加压定量吸入器、药物制剂、静脉注射配方、生物系统及其他多种系统中的胶体。该方法可深入揭示这两种固体之间在非尺度层面的化学与物理相互作用。

这些知识可用于预测药物制剂的稳定性，也可应用于截然不同的生物系统，以研究颗粒或不同固体与细胞或细菌之间的亲和力。首先使用原子力显微镜探针尖端（不带悬臂）制备胶体探针，并将悬臂固定在如图所示的45度角支架上。该支架使悬臂在水平面上方呈45度角固定。

下一步是在载玻片上涂抹环氧树脂。环氧树脂制备完成后，使用洁净的刮刀将其均匀涂抹成一层薄层。接着使用临时性粘合剂，将载玻片的另一侧固定在一个特制的支架上，该支架设计为可滑入显微镜物镜外壳中。

完成操作后，将载玻片和支架组件放回显微镜，将支架滑入镜头外壳。带有环氧树脂的载玻片应位于样品台悬臂的上方。待所有部件就位后，通过显微镜观察悬臂，并将样品台和悬臂缓慢靠近载玻片上的环氧树脂。

当悬臂吸附少量环氧树脂后，将带有环氧树脂的悬臂移出。采用相同技术，将一个直径为2至5微米的脂质颗粒固定在悬臂的尖端。现在准备原子力显微镜的基底。

使用直径35毫米的圆形盖玻片和热塑性封片胶。将盖玻片置于配有温度探针的加热板上加热。当加热板温度达到约120摄氏度时，涂布热塑性封片胶，关闭加热板，并等待其与盖玻片冷却至40摄氏度。

此时，将少量胶体颗粒撒在盖玻片上。当盖玻片冷却至室温后，将其转移至样品 holder 中，并通过移液方式进行清洗。此处使用少量液体介质，即二氢三氟戊烷或 HPFP。

重复此步骤数次，以去除未附着的颗粒。下一步是将基底安装至原子力显微镜或荧光显微镜中使用；为此，请使用液体池的下半部分，将带有胶体颗粒的盖玻片安装在液体池的下半部分。确保O形圈正确就位，以防止泄漏。

使用原子力显微镜时，需采取防泄漏措施。用透明疏水膜保护显微镜载物台，然后将液体池放置到载物台上。

将胶体探针安装到扫描头上后，将其组装到原子力显微镜（A FM）上。启动原子力显微镜（A FM）及仪器软件，使用扫描头调节旋钮将悬臂针尖调至焦点位置并校准激光。校准激光时，监测激光强度并使其达到最大值。让系统在空气中平衡，然后使用偏转调节旋钮将偏转值调至零或略负的数值。

接下来，从软件的主面板窗口进入热力学面板。为确定胶体探针的灵敏度，选择“计算逆光杠杆灵敏度”，然后采集热数据。当出现明显的峰值时，停止数据采集。

单击以放大主峰，然后选择“初始化拟合”。接着拟合热数据，将计算出一个灵敏度值。按照类似的步骤确定胶体探针的弹簧常数。

确定灵敏度和弹簧常数后，即可向液体池中加入介质。使用含有至少两毫升 HPFP 的注射器，缓慢加入两毫升液体，同时确保悬臂周围无气泡产生。加入介质后，需重新调整激光位置，以校正折射率变化带来的影响。

在高压流体池（HPFP）中让偏转值平衡5到10分钟，然后将其重新调整至零。准备在主控面板上扫描时，将初始扫描尺寸设为20微米。

扫描速率为1赫兹，扫描角度为90度，设定点为0.2伏。接近样品并开始扫描。当发现目标颗粒时，立即对其进行放大，以避免探针与基底长时间相互作用，继续扫描以获得足以定位颗粒在基底上位置的图像，或明确其主要特征的高度。

然后切换到软件中的力控面板，将红色位置条移动至最高位置。将力作用距离设置为5微米，扫描速率为0.1赫兹，触发通道设置为无。

进行一次单力测量，并确保根据获得的曲线图显示探针未接触基底。在图表窗口上单击右键，然后选择计算虚拟偏转线。系统将自动计算并更新垂直偏转值。

现在将触发通道更改为偏转，并将触发点设置为20纳米。将力-距离设置为1微米。根据与此颗粒相关的力，将扫描速度调整为每秒200纳米。

然后在完成测量后，进行两到三次单次力测量中的第一次。进入力测量面板并点击“查看”。要打开主力测量面板，需高亮显示最近的一次力测量，并确认仅在“轴”标题下被选中。

此外，将 x 轴输入字段更改为分离距离。然后点击“生成图表”。转到主力面板上的参数选项卡，并调节逆光杠杆灵敏度的数值，直到图表的接触区域完全垂直。

记录返回至主控力面板的数值。打开力选项卡，然后进入校准子选项卡。在偏转逆光杠杆灵敏度字段中输入逆光杠杆灵敏度的倒数值。

重复进行两到三次力测量和灵敏度调整，以确保在设定参数下该数值无明显变化，检查液体介质液位和悬臂偏转的稳定性。随后进行力曲线或力图的测量。测量完成后，确定探针的真实灵敏度。

取出带有基底的液体池，并更换为新的液体池。对于云母（MICA）或其他硬质表面，将 MICA 浸入相同的液体介质中。随后使用胶体探针进行力测量，采用相对较大的偏转量，使力曲线具有较长的接触区域。

软件通过接触区域的斜率来确定灵敏度。在分析使用探针获得的曲线时，应采用软件计算出的灵敏度。该颗粒基底的形貌图像是在二氢三氢全氟戊烷中使用胶体探针获得的。

该图像的清晰度低于使用 sharpened conical tip 获得的图像。然而，目标是找到一种基底颗粒，用于评估颗粒间的相互作用。扫描可进一步聚焦于单个颗粒表面，利用脂质基颗粒在 two H three H per fluoro 条件下进行力图谱映射。

戊烷可提供样品高度的形貌图以及反映每条力曲线最大极力的黏附力图。这两种原始数据图均可呈现为三维图示。将两者叠加后，可生成一幅黏附力分布随形貌变化的三维图示。

停留力测量可用于研究接触力学和接触时间对粘附力的影响。实验中使用了固体脂质颗粒，测量结果表明，粘附力随时间的延长而增加。在采用压痕停留模式时，粘附力达到稳定；而在尝试使用偏转停留模式时，观察到不同的结果。

在开始测量之前，必须对液体培养基进行平衡，以确保获得最准确的结果。