外层膜蛋白的分离线粒体的流式细胞仪免疫检测
September 18th, 2014
这里描述的是这样一种方法来检测并通过免疫标记线粒体分离从啮齿动物的组织和通过流式细胞仪分析的量化线粒体外膜蛋白质。该方法可以被扩展以评估线粒体亚群的功能方面。
该程序的首要目标是使用您选择的抗体对 ER 线粒体膜上的目标蛋白质进行免疫标记，并与线粒体功能同时进行分析。这是通过首先从大鼠收集感兴趣的组织（例如大脑、脊髓或肝脏）来实现的。第二步是将线粒体与组织分离，在本例中为脊髓。
脊髓通过舞蹈同质化。通过一系列离心步骤去除匀浆器和其他细胞器和细胞日碎片，直到获得粗的线粒体上颚髓鞘，通过将线粒体与 12% Opti prep 溶液混合并再次离心来去除中枢神经组织的主要污染物髓鞘。接下来，用选择的一抗标记分离的线粒体，然后用与 Fluor 偶联的二抗标记。
最后一步是添加荧光染料以确认线粒体身份或功能参数。最终，流式细胞术用于显示线粒体中层膜在整个正常生理或疾病中的相对丰度。与显微镜等现有方法相比，该技术的主要优点是它允许对数千个单独的线粒体进行高通量和快速定量。
本研究中使用的动物严格按照 C-R-C-H-U-M 动物保护机构委员会批准的方案进行处理，该方案遵循加拿大动物护理空气委员会概述的国家标准。要开始此过程，将从大鼠收集的整个完整脊髓放入含有 5 体积匀浆缓冲液的 5 毫升玻璃匀浆器中。将玻璃匀浆器放在冰上，用手匀浆组织，直到没有较大的组织残留，这大约需要八次冲程。
将匀浆转移到两个或三个微量离心管中，并以 1， 300 倍 G 离心 10 分钟，4 摄氏度，然后移液 S 上清液放入 5 毫升超速离心管中。向沉淀中加入 750 微升匀浆缓冲液，然后轻轻重悬沉淀。然后离心悬浮液并重悬沉淀。
再抽除两次小碎片，将所有上清液拉入同一个 5 ml 超速离心管中，然后将试管放入超速离心机转子中。配备摆动桶，将试管以 17， 000 倍 G 离心 4 摄氏度 15 分钟。离心完成后，如果对胞质部分感兴趣，请保存上清液以供进一步处理。
接下来，复苏将沉淀悬浮在含有 50 毫摩尔氯化钾离心机的 4 毫升均质缓冲液中的粗线粒体部分。将重悬沉淀在 4 摄氏度下在 4 摄氏度下在摆动桶转子中重悬沉淀 15 分钟，然后弃去旋囊，将沉淀轻轻重悬于 800 微升匀浆缓冲液中，放入新的 5 毫升超速离心管中，正好加入 800 微升重悬的沉淀。接下来，将 200 微升碘木豆移液到 800 微升重悬的沉淀中，以产生 12% 碘木豆的最终浓度。
用 P 1000 移液管轻柔但彻底地混合试管的内容物，然后在摆动的桶式转子中以 17， 000 倍 G 的离心力在 4 摄氏度下离心 15 分钟，吸出试管顶部的髓鞘层，并小心丢弃旋芽液，因为调色板可能松散。Resus 将沉淀悬浮在 4 毫升均质缓冲液中。然后在 4 摄氏度下将增益物在 4 摄氏度下离心 15 分钟。
丢弃旋后和复苏。将沉淀悬浮在 4 mL 均质缓冲液中。然后再次重复离心并去除仰卧位 reus。
将最终沉淀在 100 至 200 μL 匀浆缓冲液中弯曲，然后转移到 1.7 mL 微量离心管中。使用标准蛋白质定量测定法（如仿生酸测定法或 BCA）测定每个样品中的蛋白质量。在制备用于定量的样品时，在 2% 硫酸钠中稀释样品和标准曲线，以确保线粒体充分溶解。
对于要测试的每种染色混合物，将 25 微克分离的线粒体移液到 1.7 毫升微量中心管中。确保在每个实验中包括一个未染色的样品，以及每个抗体测试的适当同型对照，每个样品在 4 摄氏度下以 17， 000 倍 G 离心两分钟。然后去除脊髓突起物，并将分离的线粒体重悬于 50 微升线粒体缓冲液中。
补充 10% 不含脂肪酸的 BSA，在 4 摄氏度下孵育溶液 15 分钟，然后每毫升溶液添加 20 μg 一抗。将分离的线粒体与一抗在 4 摄氏度下孵育 30 分钟，以洗出未结合的抗体，离心每个样品并丢弃仰卧纳特。接下来，将沉淀轻轻重悬于 200 微升线粒体缓冲液中，然后重复离心步骤，弃去仰卧位纳脱剂，将沉淀重悬于 50 微升线粒体缓冲液中。
每毫升样品添加 0.5 μg 二抗。然后将样品在 4 摄氏度下避光孵育 30 分钟。孵育完成后，离心每个样品并丢弃含有未结合二抗的旋芽液。里斯。
将沉淀悬浮在 200 微升线粒体缓冲液中并离心样品。再。然后去除 supinate 和 Reese。将沉淀悬浮在 500 微升线粒体缓冲液中，以确保观察到的事件实际上是线粒体。
用线粒体特异性荧光染料（如 In Vitrogen 的 MIT 追踪器绿）在黑暗中对样品进行 15 分钟的染色。如果不需要进一步染色来研究其他功能参数，则将标记的样品转移到适合加载到流式细胞仪中的试管中。将样品放在冰上，然后进行流式细胞仪进行采集，以验证分离的线粒体是否具有完整的跨膜电位，在室温下用 100 纳摩尔四乙基棒 domine 甲酯对线粒体进行染色 15 分钟，在室温下在黑暗中作为对照用四乙基棒 domine 染色。
甲酯在 100 微摩尔羰基氰化物 m 氯苯酚 HydroOne 存在下，用 100 纳摩尔四乙基棒胺甲酯对分离的线粒体进行染色。这种化学物质是线粒体解偶联的，将使线粒体去极化以验证分离的线粒体是否产生超氧化物，用适当的超氧化物指示剂（如有丝分裂、袜子、红色）对线粒体进行染色，在室温下在黑暗中作为线粒体超氧化物产生的对照。在 10 微摩尔抗霉素存在下用染料留在分离的线粒体中。
抗霉素 A 是呼吸链复合物 3 的抑制剂，将在采集开始之前增加线粒体超氧化物的产生。按照随附文本协议中的说明设置仪器。然后通过轻轻敲击试管来混合样品，但不要涡旋。
在门控期间，开始在低压下收集初始事件。确保对总人口进行门控。接下来，相应地调整直方图的电压。
未染色样品的峰值通常对应于第二个十年。然后，一旦建立门并处理样品，将压力切换到高流式细胞术。对脊髓制剂的分析发现，94% 的事件对线粒体特异性染料呈阳性。
在该实验中，30% 的线粒体阳性事件用 MIT 融合 2 特异性抗体标记，MIT 融合二是一种与线粒体外膜融合有关的蛋白质。使用四乙基反刍甲酯对线粒体跨膜电位进行分析发现，95% 的分离线粒体具有完整的跨膜电位。这种染色被证明是特异性的，因为在线粒体存在下进行染色时观察到染色显着减少，发现功能性线粒体产生基础量的 SUP 氧化物，如使用膜渗透性染料测量的那样。
这与 SUP 氧化物发生荧光 P 反应。一旦掌握，用抗霉素 a 治疗线粒体会导致超氧化物产生增加约 10%。如果执行得当，这项技术可以在 6 到 7 小时内完成。
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概述
本文描述了一种通过对啮齿动物组织（特别是脊髓）中分离的线粒体进行免疫标记来检测和定量线粒体外膜蛋白的方法。该方法允许同时分析线粒体功能。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 细胞生物学
- 生物化学
背景
- 线粒体在细胞能量代谢中起着关键作用。
- 了解线粒体功能对于研究各种神经系统疾病至关重要。
- 免疫标记技术可以增强特定蛋白质的检测。
- 流式细胞术为分析标记的细胞提供了强大的方法。
研究目的
- 开发一种可靠的方法来分离和标记线粒体蛋白。
- 评估线粒体亚群的功能方面。
- 提供一个可以适应各种组织的协议。
使用的方法
- 啮齿动物组织的收集（例如，脊髓）。
- 通过均质化和离心来分离线粒体。
- 使用密度梯度离心去除髓磷脂等污染物。
- 使用连接荧光标记物的一抗和二抗进行免疫标记。
主要结果
- 成功从脊髓组织中分离线粒体。
- 有效地标记线粒体外膜蛋白。
- 流式细胞术分析证明了该方法的灵敏度。
- 在各种疾病中研究线粒体功能的潜在应用。
结论
- 所描述的方法是线粒体研究的宝贵工具。
- 它允许同时评估蛋白质存在和线粒体功能。
- 这种方法可以适应不同的组织和实验条件。
常见问题
Executive Industry Relevance
This method enables high-throughput, quantitative assessment of mitochondrial outer membrane proteins in rodent tissues, supporting target validation in neurodegenerative and metabolic disease research. By combining immunodetection with functional readouts, it provides mechanistic de-risking for early discovery programs focused on mitochondrial pathophysiology. The approach enhances predictive confidence in target selection by linking protein localization to organelle function in a scalable format.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses regarding mitochondrial protein mislocalization under pathological conditions.
- Operational Value: Supports functional target validation by correlating outer membrane protein signals with mitochondrial health metrics.
- Predictive Value: Facilitates portfolio triage through quantitative, reproducible readouts of target engagement in isolated organelles.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Generates standardized, quantitative mitochondrial preparations suitable for downstream screening campaigns.
- Reproducibility: Employs rigorous contamination removal (e.g., myelin depletion) to ensure consistent starting material across experiments.
- Scalability: Enables analysis of hundreds of thousands of mitochondria per sample, supporting high-throughput screening formats.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Applicable to studying mitochondrial dysfunction in neurodegenerative disorders where outer membrane protein alterations are implicated.
- Translational Continuity: Links target protein detection to functional outcomes (e.g., membrane potential, superoxide production) for mechanism-based biomarker alignment.
- Risk-Adjusted Advancement: Enables go/no-go decisions based on concordant changes in target localization and organelle health.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target hypothesis testing to preclinical validation, particularly for mitochondrial-focused programs in neuroscience and metabolism.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by detecting novel or disease-altered proteins at the mitochondrial surface.
- Screening: Delivers assay-ready, quantifiable mitochondrial samples with built-in functional controls for compound evaluation.
- Analytics: Provides multiplexed readouts (protein labeling, membrane potential, ROS) enabling comparative analysis across conditions.
- Translational Research: Connects target validation to preclinical continuity through functional mitochondrial readouts that predict pathophysiological relevance.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for mitochondrial target assessment across multiple disease areas and tissue types.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity by directly linking target protein detection to mitochondrial function in intact organelles.
- Operational Value: Ensures standardization and reproducibility through contaminant removal steps and internal functional controls.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision quality and reduces late-stage biological risk by validating targets in a disease-relevant organelle context.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of mitochondrial targets based on concordant localization and functional data.
Implementation Considerations
- Requires expertise in mitochondrial isolation, antibody validation, and flow cytometry setup.
- Depends on access to centrifugation equipment, fluorophores, and mitochondrial-specific dyes for quality control.
- Necessitates standardization of isolation and staining protocols across teams to ensure data comparability.
- Must account for tissue-specific variables (e.g., myelin content in neural tissue) when adapting to new models.
- Limited by the need for fresh tissue and the inability to assess dynamic protein trafficking in real time.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
1:54
Isolation of Spinal Cord Mitochondria
5:34
Immunolabeling of Isolated Mitochondria for Flow Cytometry
8:06
Assaying Mitochondrial Transmembrane Potential and Superoxide Production by Flow Cytometry
9:30
Acquisition of Immunolabeled Isolated Mitochondria by Flow Cytometry
10:21
Results: Flow Cytometry Analysis of Isolated Mitochondria
11:34
Conclusion
