通过分离线粒体的流式细胞术对外膜蛋白进行免疫检测

本实验的主要目的是利用您选择的抗体对内质网-线粒体膜上感兴趣的蛋白质进行免疫标记，并同时分析线粒体功能。该目标首先通过采集大鼠的脑、脊髓或肝脏等目标组织来实现。第二步是从组织（本例中为脊髓）中分离线粒体。

使用匀浆器对脊髓组织进行匀浆处理。通过一系列离心步骤去除匀浆液中的其他细胞器和细胞碎片，直至获得粗线粒体组分。中枢神经系统组织中的主要污染物——髓鞘，可通过将线粒体与12% OptiPrep 溶液混合后再次离心的方法予以去除。随后，分离得到的线粒体首先用选定的一抗进行标记，再用偶联了荧光染料的二抗进行孵育。

最后一步是加入荧光染料，以确认线粒体的身份或功能参数。最终，通过流式细胞术来展示在线粒体在正常生理状态或疾病状态中内外膜的相对丰度。与显微镜等现有方法相比，该技术的主要优势在于能够对成千上万个单独的线粒体进行高通量、快速的定量分析。

本研究中使用的动物均严格按照蒙特利尔大学医院研究中心（C-R-C-H-U-M）动物保护机构委员会批准的方案进行处理，该方案遵循加拿大动物护理委员会（Canadian Council on Animal Care）所规定的国家标准。开始此操作时，将从大鼠获取的完整脊髓组织放入含有五倍体积匀浆缓冲液的5毫升玻璃匀浆器中。将玻璃匀浆器置于冰上，手动匀浆组织直至无可见大块组织残留，大约需要8次上下研磨。

将匀浆转移至两到三个微量离心管中，在4°C条件下以1,300 × g离心10分钟，随后用移液器将上清液转移至5毫升超速离心管中。向沉淀中加入750微升匀浆缓冲液，轻轻重悬沉淀。然后对悬液进行离心，并再次重悬沉淀。

再重复两次以去除小碎片，将所有上清液收集至同一个5 mL超速离心管中，然后将离心管放入配备摆动桶转子的超速离心机中，在4°C条件下以17,000 × g离心15分钟。离心结束后，若需获取胞质组分，请保留上清液用于后续处理。

接下来，将沉淀物（即粗线粒体组分）重悬于含有50毫摩尔氯化钾的4毫升匀浆缓冲液中，并进行离心。在4°C条件下，使用摆桶转子以17,000 × g离心15分钟，重新悬浮该沉淀物，然后弃去上清液，并在新的5毫升超速离心管中，用800微升匀浆缓冲液轻轻重悬沉淀物，精确调整体积至800微升重悬液。随后，向800微升重悬液中加入200微升碘密度梯度介质（iodixanol），使最终碘密度梯度介质浓度为12%。

用 P 1000 移液器轻轻但充分地混匀离心管中的内容物，然后在 4°C 下以 17,000 × g 离心 15 分钟（使用摆桶转子），吸去管顶部的髓鞘层，并小心弃去上清液，因为沉淀物可能较为松散。将沉淀重悬于 4 毫升匀浆缓冲液中。随后，再次在 4°C 下以 17,000 × g 离心 15 分钟（使用摆桶转子）。

弃去上清液并重新悬浮沉淀物于 4 毫升匀浆缓冲液中。然后再次重复离心，并移除上清液。

将最终沉淀重悬于100至200微升匀浆缓冲液中，并转移至1.7毫升微量离心管中。使用标准蛋白质定量检测方法（如双缩脲酸法或BCA法）测定每个样品中的蛋白质含量。在准备定量样品时，用2%硫酸钠稀释样品和标准曲线，以确保线粒体充分溶解。

针对每种待检测的染色混合物，将25微克分离的线粒体用移液器加入1.7毫升微量离心管中。每次实验均需设置未染色样本，并为每种检测的抗体设置相应的同型对照。在台式微量离心机中，以17,000 × g于4°C离心两分钟。随后弃去上清液，并将分离的线粒体重悬于50微升线粒体缓冲液中。

加入10%无脂肪酸BSA后，在4摄氏度孵育溶液15分钟，然后每毫升溶液中加入20微克的一抗。将分离的线粒体与一抗在4摄氏度孵育30分钟，以洗去未结合的抗体，离心每个样品并弃去上清液。接着，将沉淀物轻轻重悬于200微升线粒体缓冲液中，重复离心步骤，弃去上清液，再将沉淀物重悬于50微升线粒体缓冲液中。

每毫升样品中加入 0.5 微克的二抗。然后将样品在 4 摄氏度避光孵育 30 分钟。孵育结束后，离心每个样品，并弃去上清液，上清液中含有未结合的二抗。Reese。

将沉淀重悬于200微升线粒体缓冲液中，再次离心样品。然后弃去上清液并重新悬浮沉淀。将沉淀重悬于500微升线粒体缓冲液中，以确保所观察到的事件确实来自线粒体。

使用线粒体特异性荧光染料（如 Invitrogen 的 MIT tracker green）在避光条件下染色 15 分钟。如果无需进一步染色以检测其他功能参数，则将标记后的样品转移至适合上机的流式管中。将样品置于冰上，并立即进行流式细胞仪检测，以确认分离的线粒体具有完整的跨膜电位。作为四乙基罗丹明甲酯染色的对照，在室温避光条件下用 100 纳摩尔的四乙基罗丹明甲酯染色 15 分钟。

甲基酯染色：在含有100微摩尔/升羰基氰化物-间-氯苯腙（carbonyl cyanide m-chlorophenyl hydrazone）的条件下，用100纳摩尔/升的四乙基罗丹明甲基酯对分离的线粒体进行染色。该化学物质是一种线粒体解偶联剂，可使线粒体去极化。为验证分离的线粒体是否产生超氧阴离子，使用适当的超氧阴离子指示剂（如Invitrogen公司的MitoSOX Red）在室温避光条件下染色15分钟，作为线粒体超氧阴离子生成的对照。随后，在含有10微摩尔/升抗霉素A的条件下，用染料对分离的线粒体进行染色。

抗霉素A是呼吸链复合物III的抑制剂，在开始采集前会增强线粒体超氧化物的产生。按照随附的文字版实验方案设置仪器。然后通过轻轻敲击离心管混匀样品，但不要涡旋振荡。

在门控期间以较低压力开始收集初始事件。确保对总细胞群进行门控。随后，相应调整直方图的电压。

未染色样本的峰通常对应于第二个十进制区间。在设定好门控并开始处理样本后，切换至高压力流式细胞术。对脊髓组织制备物的分析表明，94%的事件对线粒体特异性染料呈阳性。

在本实验中，30% 的线粒体阳性事件被一种特异性针对 MIT 融合蛋白 2 的抗体标记，该蛋白参与线粒体外膜的融合过程。使用四乙基罗丹明甲酯对线粒体膜电位进行分析发现，95% 的分离线粒体具有完整的跨膜电位。该染色具有特异性，因为在存在线粒体解偶联剂的情况下染色显著减弱。利用膜通透性染料检测发现，功能正常的线粒体可产生基础水平的超氧阴离子。

这会与超氧化物发生荧光P反应。用抗霉素A处理线粒体可使超氧化物的产生量大约增加10%。一旦掌握，若操作得当，该技术可在六到七小时内完成。