Name: 转基因的产生水润通过胚胎显微注射 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-09-11T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 10 s
Description: 学习通过胚胎显微注射技术制备转基因水螅的方法，利用质粒DNA整合建立稳定转基因品系。该方法支持基因功能研究、细胞追踪及发育生物学应用，为低成本创建转基因模型提供可靠方案。

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本工作由 G. Harold 资助 &amp;#38; 莱拉·雅各布斯·马瑟斯奖（Leila Y. Mathers Award）授予H.L.，以及美国国立卫生研究院（NIH）资助R.E.S.（项目编号：R24 GM080527）。C.E.J. 曾获得NIH国家研究服务奖（NRSA）博士后资助（F32GM9037222），目前受美国国家老龄化研究所颁发的导师型科研科学家发展奖（K01AG04435）支持。我们感谢审稿人提出的有益意见。

1. 质粒DNA、注射针和注射皿的准备
<ol>
	<li>使用高速大提或中提试剂盒制备质粒DNA，并通过乙醇沉淀将DNA浓缩至2.5 mg/ml。DNA沉淀应溶解于无核酸酶的去离子水中。将DNA分装为10–20 µl每份，于-20°C保存。（参见 补充表1 有关可用载体的列表）</li>
	<li>使用琼脂糖在100 × 15 mm培养皿中制备注射皿，以构建用于固定胚胎的槽道。
	<ol>
		<li>将一块75 × 50的玻璃载玻片以倾斜角度放入一个100 × 15 mm的培养皿中。倒入约50 ml熔化的2%琼脂糖 水螅 培养基24 倒入培养皿中。或者，先将琼脂糖倒入培养皿，然后在其表面漂浮一个“显微注射鱼模具”。</li>
		<li>琼脂糖凝固后，移除玻璃片或模具。如果使用了玻璃片，用剃刀片切去多余的琼脂糖以形成壁状结构。倒入 水螅 将培养基加入培养皿中，立即使用或于4°C保存至需要时。注意：注射用培养皿若在使用间期于4°C保存，可重复使用。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用显微拉针仪将含细丝的硼硅酸盐玻璃毛细管按以下条件拉制针尖：加热温度525，拉力75，速度100，时间50。将制备好的针尖插入培养皿中一条细长的黏土条内进行保存，使针尖与培养皿底部保持平行。</li>
	<li>配制注射溶液时，将 3 µl 的 2.5 mg/ml 质粒 DNA 溶液与 2 µl 的 10% 酚红溶液混合。短暂涡旋振荡后，离心 10 分钟&#160;在微量离心机中以最大速度离心，以去除可能堵塞针头的任何颗粒。</li>
	<li>在解剖显微镜下，用镊子从针尖处剪去几毫米，形成一个小开口。注意：开口的合适尺寸具有一定灵活性，因为在步骤3.3中可通过调节压力来适应此差异。</li>
	<li>将培养皿放置好，使针头保持垂直向下。用移液器将约 0.5 µl 注射液注入针头后端，使液体通过毛细作用吸入针尖。</li>
</ol>
2. 注射用胚胎的制备
<ol>
	<li>每天定期检查 Hydra AEP 品系培养物中是否产生卵子的水螅体。收集这些水螅体，并将其单独放置于另一培养皿中。在白天每隔数小时观察一次这些水螅体，以监测卵子形成进程。当卵子突破外胚层并位于一圈收缩的外胚层细胞环上时，即可进行显微注射25。在注射前，将这些水螅体与数只带有精巢的 Hydra 共同培养至少 1 小时，以完成受精。雄性 Hydra 无需特殊处理即可释放精子。</li>
	<li>若在 AEP 品系群体中发现带有完全成形卵子（直径约为 400 μm25）或处于 1 至 8 细胞阶段的胚胎的雌性个体，也应收集用于注射。对于已经开始卵裂的胚胎，应立即进行注射。注意：完全成形的卵子与单细胞合子在形态上无法区分，因此在注射前应将其与雄性个体共同孵育以确保受精。</li>
	<li>注射前，使用带有 #15 刀片的解剖刀切除胚胎上下方大部分亲本组织，仅保留胚胎及其附带的一小段体柱，以便必要时可用镊子操作胚胎。注意：从胚胎上分离的组织具有再生能力，应予以保存，以确保 Hydra 群体中持续存在雌性个体。</li>
	<li>使用巴斯德移液管将胚胎转移至注射用培养皿中，并将其沿琼脂糖槽壁平行排列。</li>
</ol>
3. 质粒DNA的显微注射
<ol>
	<li>将显微注射仪安装在置于铁板上的磁性支架上。将注射持针器（即显微注射仪中夹持针头的部分）安装到操纵杆式显微操作器上。使用磁性支架将操纵杆式显微操作器固定在铁板上。将整个装置放置在解剖显微镜的右侧，并调整持针器位置，使其位于观察视野中。</li>
	<li>将装有胚胎的注射培养皿置于解剖显微镜下，方向应使琼脂糖槽的垂直壁位于左侧。将针头插入持针器，并将针尖下移至培养皿的 Hydra 培养基中。</li>
	<li>缓慢顺时针旋转注射器旋钮，直至矿物油充满针头顶部，并观察到注射液以稳定流速从针尖持续流出进入 Hydra 培养基中。若液流过强，可逆时针旋转旋钮以降低压力。重复练习此步骤，以常规获得适宜的压力，该压力取决于针头开口的大小（即 步骤 1.5 中针头剪切方式）。注意：若液流过强，胚胎将无法存活。</li>
	<li>在解剖显微镜下观察，移动注射培养皿，使第一个胚胎位于视野中央。移动针头使其接触该胚胎。使用显微操作器将针头刺入胚胎。注意：琼脂糖槽的垂直壁可防止胚胎被针头推离原位。</li>
	<li>让注射液流入胚胎 1 至 2 秒后迅速抽出针头。若胚胎含有多个细胞，需对每个细胞单独注射。使用镊子重新调整胚胎方向，使下一个细胞对准针尖。</li>
	<li>完成第一个胚胎注射后，移动培养皿使下一个胚胎进入注射位置，并重复上述操作；持续进行直至所有胚胎均完成注射。</li>
</ol>
4. 胚胎的培养与孵化
<ol>
	<li>将所有显微注射后的胚胎转移至一个含有数只具精巢的Hydra的培养皿中（以确保所有胚胎均被受精）。将胚胎置于18 °C培养箱中继续胚胎发育。</li>
	<li>当胚胎发育至角质层阶段时，将每个注射后的胚胎分别转移至24孔板的独立孔中，每孔预先加入Hydra培养液。</li>
	<li>将注射后的胚胎在18 °C黑暗条件下培养2周。</li>
	<li>经过2周的培养后，在解剖显微镜下检查每个注射胚胎。若发现角质层阶段的胚胎已从亲本组织小块上脱落，且亲本组织已再生为水螅体，需立即移除该再生水螅体，以防与新孵化的个体混淆。</li>
	<li>将盛有注射胚胎的培养皿转移至室温下的水族灯下光照环境。每天观察各孔，收集新孵化的个体。新孵化的个体呈白色，因为Hydra水螅体典型的粉红色来源于其摄食的Artemia。</li>
	<li>在荧光显微镜下观察孵化个体，检测转基因表达情况。</li>
</ol>

<ol><li>Wittlieb, J., Khalturin, K., Lohmann, J. U., Anton-Erxleben, F., Bosch, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenic+Hydra+allow+in+vivo+tracking+of+individual+stem+cells+during+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Transgenic Hydra allow in vivo tracking of individual stem cells during morphogenesis.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 103, 6208-6211 (2006).</li>
<li>Glauber, K. M., Dana, C. E., Steele, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydra%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Hydra.</a> Curr Biol. 20, 964-965 (2010).</li>
<li>Holstein, T. W., Hobmayer, E., David, C. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pattern+of+epithelial+cell+cycling+in+hydra%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Pattern of epithelial cell cycling in hydra.</a> Dev Biol. 148, 602-611 (1991).</li>
<li>Dubel, S., Hoffmeister, S. A., Schaller, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+pathways+of+ectodermal+epithelial+cells+in+hydra%5BTitle%5D)+AND+%22Differentiation%22%5BJournal%5D)">Differentiation pathways of ectodermal epithelial cells in hydra.</a> Differentiation. 35, 181-189 (1987).</li>
<li>Khalturin, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenic+stem+cells+in+Hydra+reveal+an+early+evolutionary+origin+for+key+elements+controlling+self-renewal+and+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Transgenic stem cells in Hydra reveal an early evolutionary origin for key elements controlling self-renewal and differentiation.</a> Dev Biol. 309, 32-44 (2007).</li>
<li>Bosch, T., David, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+Cells+of+Hydra+magnipapillata+can+differentiate+into+somatic+cells+and+germ+line+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Stem Cells of Hydra magnipapillata can differentiate into somatic cells and germ line cells.</a> Dev Biol. 121, 182-191 (1987).</li>
<li>David, C. N., Murphy, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+interstitial+stem+cells+in+hydra+by+cloning%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Characterization of interstitial stem cells in hydra by cloning.</a> Dev Biol. 58, 372-383 (1977).</li>
<li>Chapman, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+dynamic+genome+of+Hydra%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The dynamic genome of Hydra.</a> Nature. 464, 592-596 (2010).</li>
<li>Boehm, A. M., Bosch, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Migration+of+multipotent+interstitial+stem+cells+in+Hydra%5BTitle%5D)+AND+%22Zoology+%28Jena%29%22%5BJournal%5D)">Migration of multipotent interstitial stem cells in Hydra.</a> Zoology (Jena). 115, 275-282 (2012).</li>
<li>Glauber, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+small+molecule+screen+identifies+a+novel+compound+that+induces+a+homeotic+transformation+in+Hydra%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">A small molecule screen identifies a novel compound that induces a homeotic transformation in Hydra.</a> Development. 140, 4788-4796 (2013).</li>
<li>Siebert, S., Anton-Erxleben, F., Bosch, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+type+complexity+in+the+basal+metazoan+Hydra+is+maintained+by+both+stem+cell+based+mechanisms+and+transdifferentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Cell type complexity in the basal metazoan Hydra is maintained by both stem cell based mechanisms and transdifferentiation.</a> Dev Biol. 313, 13-24 (2008).</li>
<li>Anton-Erxleben, F., Thomas, A., Wittlieb, J., Fraune, S., Bosch, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasticity+of+epithelial+cell+shape+in+response+to+upstream+signals%3A+a+whole-organism+study+using+transgenic+Hydra%5BTitle%5D)+AND+%22Zoology+%28Jena%29%22%5BJournal%5D)">Plasticity of epithelial cell shape in response to upstream signals: a whole-organism study using transgenic Hydra.</a> Zoology (Jena). 112, 185-194 (2009).</li>
<li>Hemmrich, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+signatures+of+the+three+stem+cell+lineages+in+Hydra+and+the+emergence+of+stem+cell+function+at+the+base+of+multicellularity%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Evol%22%5BJournal%5D)">Molecular signatures of the three stem cell lineages in Hydra and the emergence of stem cell function at the base of multicellularity.</a> Mol Biol Evol. , (2012).</li>
<li>Juliano, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PIWI+proteins+and+PIWI-interacting+RNAs+function+in+Hydra+somatic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">PIWI proteins and PIWI-interacting RNAs function in Hydra somatic stem cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 111, 337-342 (2014).</li>
<li>Nishimiya-Fujisawa, C., Kobayashi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Germline+stem+cells+and+sex+determination+in+Hydra%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Germline stem cells and sex determination in Hydra.</a> Int J Dev Biol. 56, 499-508 (2012).</li>
<li>Milde, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+taxonomically+restricted+genes+in+a+phylum-restricted+cell+type%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">Characterization of taxonomically restricted genes in a phylum-restricted cell type.</a> Genome Biol. 10, 8(2009).</li>
<li>Nakamura, Y., Tsiairis, C. D., Ozbek, S., Holstein, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autoregulatory+and+repressive+inputs+localize+Hydra+Wnt3+to+the+head+organizer%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Autoregulatory and repressive inputs localize Hydra Wnt3 to the head organizer.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 108, 9137-9142 (2011).</li>
<li>Gee, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((beta-catenin+plays+a+central+role+in+setting+up+the+head+organizer+in+hydra%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">beta-catenin plays a central role in setting up the head organizer in hydra.</a> Dev Biol. 340, 116-124 (2010).</li>
<li>Fraune, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+an+early+branching+metazoan%2C+bacterial+colonization+of+the+embryo+is+controlled+by+maternal+antimicrobial+peptides%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">In an early branching metazoan, bacterial colonization of the embryo is controlled by maternal antimicrobial peptides.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 18067-18072 (2010).</li>
<li>Bridge, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FoxO+and+stress+responses+in+the+cnidarian+Hydra+vulgaris%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">FoxO and stress responses in the cnidarian Hydra vulgaris.</a> PLoS One. 5, e11686(2010).</li>
<li>Boehm, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FoxO+is+a+critical+regulator+of+stem+cell+maintenance+in+immortal+Hydra%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">FoxO is a critical regulator of stem cell maintenance in immortal Hydra.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109, 19697-19702 (2012).</li>
<li>Franzenburg, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MyD88-deficient+Hydra+reveal+an+ancient+function+of+TLR+signaling+in+sensing+bacterial+colonizers%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">MyD88-deficient Hydra reveal an ancient function of TLR signaling in sensing bacterial colonizers.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109, 19374-19379 (2012).</li>
<li>Dana, C. E., Glauber, K. M., Chan, T. A., Bridge, D. M., Steele, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Incorporation+of+a+horizontally+transferred+gene+into+an+operon+during+cnidarian+evolution%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Incorporation of a horizontally transferred gene into an operon during cnidarian evolution.</a> PLoS One. 7, e31643(2012).</li>
<li>Lenhoff, H. M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLenhoff%2C+HM+%22Hydra%3A+Research+Methods%22">Hydra: Research Methods</a>. Lenhoff, H. M. , Plenum Press. Ch. 4 29-34 (1983).</li>
<li>Miller, M. A., Technau, U., Smith, K. M., Steele, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oocyte+development+in+Hydra+involves+selection+from+competent+precursor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Oocyte development in Hydra involves selection from competent precursor cells.</a> Dev Biol. 224, 326-338 (2000).</li>
<li>Lenhoff, H. M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLenhoff%2C+HM+%22Hydra%3A+Research+Methods%22">Hydra: Research Methods</a>. Lenhoff, H. M. , Plenum Press. Ch. 8 53-62 (1983).</li>
</ol>

作者无披露内容

Hydra 通常进行无性繁殖，但需要环境刺激才能开始产生配子。对于大多数Hydra物种而言，这些刺激因素尚未明确界定，并且可能因品系而异。制备转基因Hydra面临的一个重要障碍是难以定期获得胚胎，因为在实验室条件下诱导Hydra进入有性生殖阶段较为困难。然而，AEP品系25在实验室中能够 readily产生配子，迄今为止所有转基因品系的建立均仅使用了该品系。诱导配子生成的最常用方法是通过饮食调控。如前所述，应将动物每日喂食持续三周，随后饥饿5天，之后改为每周喂食两次，在此期间将产生配子1。我们的经验还表明，将AEP Hydra培养在水族箱中的垂直平板上26（可能模拟了更自然的环境），即使保持常规喂食频率，也能促进卵子的生成。此外，通过AEP自交获得的品系有时比亲本品系更规律地产生配子。因此，建立AEP的F1代品系是获得更稳定胚胎来源的另一种可行方法。
注射后存活并发育至角质阶段的胚胎比例取决于胚胎的健康状况、注入溶液的量以及注...

Hydra 已被用于研究再生、模式形成和干细胞约 250 年2。Hydra 具有简单的身体结构，包含三个细胞谱系：外胚层上皮、内胚层上皮和间质细胞。管状身体由外胚层和内胚层上皮谱系构成，每个谱系均为单层细胞。体柱中的所有上皮细胞均具有有丝分裂能力。当上皮细胞移位至末端区域3，即口端的头部（口和触手）或反口端的足部（基盘）时，它们会停滞在细胞周期的 G2 期，并改变细胞命运4。间质谱系的细胞位于上皮细胞之间的间隙中。该谱系由位于体柱外胚层上皮层中的多能干细胞维持5。间质干细胞可分化为三种体细胞类型（神经细胞、腺细胞和刺细胞）以及生殖细胞6,7。
作为刺胞动物门的一员，且是所有两侧对称动物的姐妹群，Hydra 可以为揭示多细胞动物共有的基本生物学过程提供重要线索。直到最近，由于缺乏可靠的基因功能扰动方法，相关研究进展受到阻碍。然而，随着转基因技术的发展1，我们现在能够充分利用 Hydra 来更深入地理解多细胞动物共有的基本机制，例如干细胞功能、再生以及模式形成。转基因 Hydra 品系的建立是通过将质粒 DNA 显微注射到胚胎中实现的，这种方法会导致外源 DNA 随机整合，并在相当比例的孵化幼体中产生嵌合表达。通过无性繁殖，可以获得在特定谱系中均一表达的稳定品系。与大多数只能通过有性繁殖传代的动物模型相比，转基因 Hydra 能够进行克隆扩增，这是其显著优势。此外，由于 Hydra 个体通体透明且自身不表达内源性荧光蛋白，转基因细胞可在活体中被方便地追踪8。
自首批转基因Hydra品系建立以来的七年中1，这些品系已被用于多种研究应用。在不同细胞类型中表达荧光蛋白，使得研究人员能够在野生型条件下以及化学干预后，追踪细胞运动、观察细胞形态变化并追踪细胞命运1,5,9-12。此外，在不同谱系中表达多种荧光蛋白，可实现通过FACS分离特定的细胞群体。该技术已被用于干细胞特异性mRNA和谱系特异性小RNA的测序13,14。尽管两个Hydra肌动蛋白基因之一的启动子应用最为广泛，但已有少数细胞类型特异性启动子被鉴定并用于驱动转基因Hydra中GFP的表达9,11,15,16。未来，细胞类型特异性启动子将使任意特定细胞类型的观察与分离成为可能。此外，转基因方法已成功用于界定Wnt3启动子的顺式作用调控元件17。
在Hydra中建立转基因方法为通过异位表达、过表达和基因敲低来检测基因功能提供了强有力的手段。已构建出表达荧光标记蛋白的转基因动物，以研究蛋白的功能及其细胞内定位18-20。此外，在GFP转基因的3’非翻译区（3’UTR）中表达RNA发夹结构可实现对靶基因的敲低21,22。在这些方法中，需要利用GFP来识别和追踪在建立转基因品系过程中的转基因组织。然而，在某些情况下，GFP分子可能会干扰被标记蛋白的功能。最近一项研究表明，Hydra基因可排列成操纵子结构，即&#160;形成多顺反子转录本，随后通过反式剪接添加前导序列并分别翻译成独立的蛋白质23。通过将编码蛋白或RNA发夹的基因置于操纵子的上游位置，而将荧光蛋白基因置于下游位置，即可在无需标记编码蛋白或RNA发夹基因的情况下追踪转基因组织。该方法已被用于将RNA发夹与DsRed2以操纵子结构共表达，从而实现基因敲低14。

<table><tbody><tr><td>AEP Hydra 品系</td><td></td><td></td><td>电子邮件：Celina Juliano，邮箱 celina.juliano@yale.edu 或 Hiroshi Shimizu，邮箱 bubuchin2006@yahoo.co.jp</td></tr><tr><td>高速大提试剂盒</td><td>Qiagen</td><td>12662</td><td></td></tr><tr><td>100 × 15 mm 培养皿</td><td>BD Falcon</td><td>351029</td><td></td></tr><tr><td>75 × 50 mm 玻璃显微镜载玻片</td><td>Sigma</td><td>CLS294775X50</td><td></td></tr><tr><td>鱼类显微注射模具</td><td>IBI Scientific</td><td>FM-600</td><td></td></tr><tr><td>含丝硼硅酸盐玻璃毛细管</td><td>Sutter Instrument</td><td>BF100-50-10</td><td>外径：1.0 mm，内径：0.50 mm，长度：10 cm</td></tr><tr><td>Flaming/Brown 微量移液器拉制仪</td><td>Sutter Instrument</td><td>P-97</td><td></td></tr><tr><td>酚红</td><td>Sigma</td><td>P3532</td><td></td></tr><tr><td>珠宝商镊子，Dumont #5</td><td>Sigma</td><td>F6521</td><td></td></tr><tr><td>手术刀片 #15</td><td>Fisher</td><td>50-822-421</td><td></td></tr><tr><td>矿物油</td><td>Sigma</td><td>M8410-500ML</td><td></td></tr><tr><td>显微注射仪</td><td>Narishige</td><td>IM-9B</td><td></td></tr><tr><td>磁力支架</td><td>Narishige</td><td>GJ-1</td><td></td></tr><tr><td>铁板</td><td>Narishige</td><td>IP</td><td></td></tr><tr><td>操纵杆式显微操作器</td><td>Narishige</td><td>MN-151</td><td></td></tr></tbody></table>

转基因动物的制备 水螅 通过胚胎显微注射

Generation of Transgenic Hydra by Embryo Microinjection

作为刺胞动物门（Cnidaria）的成员，也是所有两侧对称动物的姐妹群，Hydra 可用于揭示多细胞动物共有的基本生物学过程。Hydra 被用作研究再生、模式形成和干细胞的模式生物。然而，由于缺乏可靠的基因扰动方法来研究分子功能，相关研究进展一直受到限制。转基因技术的发展重新激发了对 Hydra 生物学的研究1。转基因 Hydra 可用于活细胞示踪、分选以获得用于生化分析的纯细胞群体、通过基因敲低和过表达来操控基因功能，以及启动子功能的分析。质粒 DNA 被注射到早期胚胎中后，会在发育早期随机整合到基因组中。这导致孵化出的个体在其三个谱系（外胚层上皮、内胚层上皮或间质细胞）中一个或多个谱系的组织区域表达转基因。获得具有转基因组织的孵化个体的成功率在 10% 至 20% 之间。通过无性繁殖转基因孵化个体，可在特定谱系中建立稳定且均一的转基因品系。生成转基因 Hydra 的过程出人意料地简单且高效，本文介绍了一种可低成本轻松实施的实验方案。

建立转基因 水螅 线条
每隔2-3天用卤虫（Artemia nauplii）投喂转基因孵化幼体。孵化后的幼体有时在最初一两天内不会进食。部分新孵化的幼体始终不进食，因而无法存活。若幼体的外胚层（图1A）或内胚层上皮组织中存在转基因成分，可让该个体出芽，并收集转基因组织比例最高的芽体（图1B, C）。对新产生的芽体持续进行此操作，直至建立一个在外胚层（图1D）或内胚层上皮谱系中均一表达转基因的稳定品系。同时，可建立另一个不携带转基因但其他遗传背景完全相同的品系（图1B），作为后续实验的阴性对照。如果转基因组织未能进入芽体，有时可通过切割动物体并使其再生，从而使转基因组织进入新的出芽区域。然而，若转基因组织过于靠近末端，则可能在动物正常生长过程中因被推挤而丢失，此种情况通常无法补救。根据我们的经验，若转基因本身为中性（即对生物学功能无影响），约有30%携带上皮组织转基因的水螅（H...

通过将质粒DNA显微注射到胚胎中，随后发生基因组随机整合并经无性繁殖建立均一品系，可获得稳定转基因的Hydra。转基因Hydra可用于追踪细胞运动、基因过表达、启动子功能研究，或利用RNAi技术敲低基因表达。

作为刺胞动物门（Cnidaria）的一员，且为所有两侧对称动物的姐妹群，水螅可为揭示两侧对称动物间共有的基本生物学过程提供重要线索……

本实验的总体目标是将质粒DNA显微注射到水螅胚胎中，以产生转基因品系。首先制备质粒DNA溶液，并将其装入注射针中。随后，在水螅胚胎发育处于1至8细胞阶段之间时，将质粒DNA溶液注射入胚胎内。随后让水螅胚胎发育并孵化，筛选出具有转基因组织的幼体。最后一步是通过原始转基因个体的无性出芽繁殖，建立稳定的转基因品系。最终利用荧光显微镜观察水螅中转基因的表达情况。该方法专为希望以低成本构建转基因水螅品系的研究人员设计，从而促进这一有用技术的更广泛应用，不仅适用于当前从事水螅研究的科研人员，也适用于刚开始使用该模式生物的研究者。转基因水螅可用于研究组织动态、蛋白质定位、通过基因敲低和过表达分析基因功能，以及启动子功能。按照文本所述方案制备质粒DNA后，通过先放置一块75乘50的玻璃载片来制备注射用培养皿。将100毫米×15毫米的培养皿倾斜，加入50毫升水培基质，溶解2%的琼脂。待其冷却后，倒入培养皿中。琼脂凝固后，取出玻璃片，并用刀片切除多余的琼脂，形成一道壁。然后立即将水螅培养基倒入培养皿中，可立即使用，或在4°C下保存备用。制备注射溶液时，将3微升浓度为2.5毫克/毫升的质粒DNA溶液与2微升10%酚红溶液混合。短暂涡旋混匀后，在微型离心机中以最大速度离心10分钟，以去除可能堵塞显微注射针头的颗粒物，操作过程可在解剖显微镜下进行。使用镊子在距离针尖几毫米处夹住针头，以形成一个小开口。将装有针头的培养皿调整方向，使针头垂直且针尖朝下。然后用移液器将约 0.5 µL 的注射溶液注入针头的后端。 为准备用于注射的胚胎，首先在EP品系的水螅培养物中筛选产卵的水螅水母体。收集这些水母体并转移至单独的培养皿中。在白天每隔几小时观察一次这些水母体，以监测卵子形成的过程。当卵细胞突破外胚层并位于一圈收缩的真皮细胞环上时，即可进行显微注射。将已准备好接受注射的水螅息肉与若干带有精巢的水螅共同置于培养皿中至少一小时，以确保若在aEP品系群体中发现雌性个体时能够完成受精。这些具有完全形成卵子或处于单细胞至八细胞阶段胚胎的个体，也需在注射前收集备用。使用带15号刀片的解剖刀，切除已开始卵裂的胚胎上下方大部分亲本组织，仅保留少量亲本体壁与胚胎相连。将解剖后的组织保存在水螅培养基中，因为它会再生，并确保雌性个体保留在水螅群体中。使用移液管将正在分裂的胚胎转移至注射皿中，并将其排列在琼脂槽壁的平行位置。准备安装在磁力架上的显微注射仪，该磁力架置于铁板上。将显微注射仪的持针部件（即注射支架）安装到操纵杆式显微操作器上。使用磁力支架将操纵杆式显微操作器固定在铁板上。然后将整个装置置于解剖显微镜的右侧，并调整注射支架的位置，使其位于观察视野内可见。将含有胚胎的注射培养皿置于解剖显微镜下，调整方向，使农杆菌槽的垂直壁位于左侧。将针头插入注射 holder 中，并将针尖下降至培养皿的水螅培养基内。接着，缓慢顺时针旋转注射器旋钮，直至矿物油充满针头顶部，并观察到注射溶液持续稳定地从针头流出进入水螅培养基中。如果流速过强，可通过逆时针旋转旋钮降低压力。将胚胎置于视野中央，并移动针头使其接触胚胎。然后使用显微操作仪将针头刺入胚胎，并让注射液流入胚胎内持续一到两秒，随后迅速抽出针头。如果胚胎含有多个细胞，则需对每个细胞进行单独注射。持续操作直至所有胚胎均完成注射。待全部胚胎注射完毕后，将其转移至培养皿中，与数只带有精巢的EP水螅共同孵育，并在18摄氏度条件下继续胚胎发育过程。当胚胎发育至角质层阶段时，将每个胚胎转移至含有水螅培养基的24孔板的孔中，在18摄氏度避光条件下培养两周。随后在解剖显微镜下检查每个胚胎是否已从亲本组织小片上脱离，以及该亲本组织是否发生再生。若存在再生组织，应立即去除，以免被误认为新孵化的幼体。检查每个胚胎后，将培养皿移至室温下的水族灯下。每天检查培养板并收集孵出的幼体。新孵出的幼体呈白色，因为尚未进食。在荧光显微镜下观察转基因表达情况。每隔两到三天使用 art napoli 喂养转基因幼体。当电胚层或内胚层上皮组织中具有转基因的幼体产生芽体时，对其进行转基因表达评估。图中显示的是一只孵化幼体，其表达了一种DsRed双转基因，该基因在肌动蛋白启动子的调控下，且存在一片外胚层上皮细胞。通过该生物体持续出芽，最终可产生一个在表皮或内胚层上皮细胞系中均一表达该转基因的品系。如图所示，最初的孵化幼体现在正在产生两个新的芽体。标有星号的芽体不含转基因组织，被用作对照品系的起始个体，该对照品系在遗传上与转基因品系完全相同，仅缺少转基因成分。该个体是由最初孵化的水螅产生的第一个带有转基因组织的芽体。通过使用对生物学功能无影响的转基因进行这些实验，已从约30%孵化时具有表皮转基因组织的水螅中成功建立了均一的表皮细胞系。与内胚层细胞系相比，此处所示的均匀外胚层细胞系的建立频率低33%至50%。因此，在观看本视频后，您应能充分理解如何制备转基因水母细胞系，这将丰富您利用该模型开展功能研究的技术手段。

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